Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
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Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFD1400805), el Programa Principal de Investigación y Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Jiangxi (20194ABC28007), Proyectos del Departamento de Educación de Jiangxi (GJJ201449) y la Innovación Colaborativa de Investigación Científica Agrícola Moderna en la Provincia de Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

1. Construcción del CLas-DETECTR
NOTA: La construcción de CLas-DETECTR es un proceso de cuatro pasos: preparación de la solución, aislamiento de ADN total cítrico, amplificación isotérmica del ADN y visualización de resultados. El esquema del ensayo CLas-DETECTR se ilustra en la Figura 1A.
<ol><li>Preparación de la solución<ol><li>Preparar el tampón A: 20 mM NaOH en 6% PEG 200. Para 100 ml, agregue 113 mg de NaOH y 6 g de PEG 200 en 80 ml deH2O</...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus,+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing.">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li><li>Ghosh, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. 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G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Este estudio presenta un método rápido y portátil para detectar CLas denominado CLas-DETECTR, que combina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a. El flujo de trabajo se ilustra en la figura 1. CLas-DETECTR detecta CLas con especificidad y sensibilidad (Figura 2 y Figura 3). Además, utilizando muestras de hojas de Newhall, CLas-DETECTR detecta CLas con la misma sensibilidad que la qPCR (Figura 4</s...

Huanglongbing (HLB) es una de las enfermedades de los cítricos más problemáticas en todo el mundo1. El HLB es causado por la bacteria colonizadora de floemas y fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluyendo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus y Ca. L. americanus2 . La especie asociada al HLB más prevalente en China y los EE.UU. es CLas, que se transmite por psílidos asiáticos de los cítricos (Diaphorina citri) o a través de injertos3. Después de ser infectados por CLas, los árboles de cítricos muestran una disminución del crecimiento hasta la muerte2. Los síntomas comunes de las hojas de cítricos infectadas con CLas son moteado con manchas, islas verdes (pequeños puntos circulares de color verde oscuro), venas corchosas elevadas en hojas más gruesas y coriáceas, y brotes amarillentos no uniformes2. Además, las frutas infectadas con CLas aparecen pequeñas y desequilibradas2.
Dado que ninguna variedad de cítricos es resistente al HLB y no existe cura terapéutica para el HLB, la prevención del HLB requiere la cuarentena y el aislamiento de los cítricos CLas-positivos 2,3. Por lo tanto, la detección temprana es crítica para el monitoreo y la cuarentena para prevenir la propagación de CLas y minimizar las pérdidas económicas3. Además, se necesita la detección sensible de CLas debido al bajo título de CLas en las plantas durante la etapa temprana de la infección3. En China, la detección de CLas generalmente es realizada por ciertos centros de prueba certificados. Sin embargo, el proceso de detección generalmente toma al menos 1 semana, y la tarifa de detección es costosa. Por lo tanto, para ayudar a monitorear la incidencia de HLB
Se han aplicado diversas tecnologías para diagnosticar HLB 4,5,6,7,8,9. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR cuantitativa (qPCR) son las herramientas más utilizadas para la detección de CLas debido a su alta sensibilidad y especificidad 4,5. Sin embargo, esas tecnologías dependen en gran medida de instrumentos costosos y personal altamente calificado. Además, varios métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), han sido desarrollados como alternativas atractivas a los métodos convencionales de PCR debido a su simplicidad, rapidez y bajo costo 8,9,10. Sin embargo, es difícil aplicarlos para detectar con precisión CLas debido a las señales de amplificación no específicas, que pueden causar resultados falsos positivos.
La detección de ácidos nucleicos basada en endonucleasa basada en CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas regularmente / asociadas a CRISPR) se ha desarrollado como una tecnología de diagnóstico molecular de próxima generación debido a su alta sensibilidad, especificidad y confiabilidad11,12,13,14. Estas tecnologías de diagnóstico CRISPR/Cas se basan en la actividad nucleasa colateral de las proteínas Cas para escindir ADN monocatenario (ssDNA) modificado con un reportero fluorescente y un extintor de fluorescencia en cada extremo de los oligonucleótidos, así como un dispositivo de detección de fluorescencia para capturar el reportero fluorescente liberado11,12 . La actividad nucleasa de varios efectores Cas activados por el dúplex diana de ARN CRISPR (crRNA) puede escindir indiscriminadamente el ssDNA11 circundante no diana. CRISPR-Cas12a (también llamado Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas de clase 2 tipo V-A, demuestra varias ventajas en comparación con Cas9, como una menor tolerancia al desajuste y una mayor especificidad13. El sistema Cas12a/crRNA ha sido aplicado para la detección sensible y específica de los ácidos nucleicos de patógenos humanos y fitopatógenos 14,15,16,17,18. Por lo tanto, la utilización del sistema Cas12a / crRNA debería permitir la detección precisa y sensible del ácido nucleico de CLas.
Cas12a solo no es teóricamente lo suficientemente sensible como para detectar niveles bajos de ácidos nucleicos. Por lo tanto, para mejorar su sensibilidad de detección, la detección de CRISPR-Cas12a se combina típicamente con un paso de amplificación isotérmica14,15. La amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) permite la amplificación isotérmica sensible y rápida del ADN en un rango de temperatura de 37 °C a 42 °C19.
Una plataforma de detección llamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina la actividad DNasa de Cas12a con RPA y una lectura de fluorescencia ha sido ideada recientemente12 y se ha demostrado que detecta ácido nucleico con mayor sensibilidad20. Además, la señal de fluorescencia emitida por las muestras positivas se puede observar a través de un dispositivo portátil de detección de fluorescencia en el campo.
Dado que amplificamos el ADN con RPA, diseñamos crRNA dirigido al gen nrdB (ribonucleonucleotide reductase β- subunidad) de cinco copias específico para CLas21, y empleamos la actividad DNasa de la proteína Cas12a, llamamos a este método de detección CLas CLas-DETECTR. En comparación con los métodos de detección de CLas existentes, CLas-DETECTR es rápido, preciso, sensible e implementable.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

La detección temprana de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por los productores de cítricos facilita la intervención temprana y previene la propagación de la enfermedad. Aquí se presenta un método simple para el diagnóstico rápido y portátil de Huanglongbing (HLB) que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa y un reportero fluorescente que utiliza la actividad nucleasa del sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas / 12a asociado a CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilidad de esta técnica es mucho mayor que la PCR. Además, este método mostró resultados similares a la qPCR cuando se utilizaron muestras de hojas. En comparación con los métodos de detección de CLas convencionales, el método de detección presentado aquí se puede completar en 90 minutos y funciona en una condición isotérmica que no requiere el uso de máquinas de PCR. Además, los resultados se pueden visualizar a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil en el campo.

Aquí, hemos descrito una plataforma portátil, CLas-DETECTR, que peina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a para diagnosticar HLB en el campo. El esquema de CLas-DETECTR se ilustra en la figura 1A.
Cuando las muestras de hojas de los árboles Newhall infectados con HLB y no infectados con HLB (Figura 1B), para los cuales la presencia de CLas se confirmó mediante PCR (Figura 1C), se sometieron a la prueba CLas-DETECTR, se observó una señal de fluorescencia verde en...

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Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

En este trabajo, se desarrolló un método de detección rápido, sensible y portátil para Candidatus Liberibacter asiaticus basado en la amplificación de la polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a.

Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, abreviado como HLB. Es una enfermedad devastadora de los cítricos en todo el mundo. En los países más productores de cítricos, como China y los Estados Unidos, el HLB es causado por la bacteria restringida en floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abreviada como CLas.La detección temprana de CLas fue importante para los productores, facilitando la intervención temprana y previniendo la propagación de la enfermedad. Así que aquí desarrollamos un nuevo método para el diagnóstico rápido y portátil de HLB, combinado con la amplificación de polimerasa recombinasa y el sistema CRISPR-Cas12a. Lo llamamos CLas-DETECTR.La sensibilidad de nuestra plataforma es mucho mayor que la PCR. Además, muestra un resultado similar con qPCR cuando se utilizaron las muestras de hojas. Compare con las detecciones convencionales de CLas, nuestro método se puede terminar en 90 minutos y funciona en condiciones isotérmicas.El resultado también se puede visualizar a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil en el campo. El CLas-DETECTR contiene cuatro pasos: preparación de la solución, aislamiento de ADN total cítrico, amplificación isotérmica del ADN y los resultados de la visualización. El esquema del ensayo CLas-DETECTR se ilustra aquí.El tampón A, la solución B y la solución C se preparan como se describe en el protocolo. Para ahorrar tiempo y hacer que este método sea adecuado para la detección de CLas de campo, se utilizó el enfoque basado en polietilenglicol E. coli para obtener extractos de plantas crudas para la amplificación de ADN. Las hojas de cítricos se utilizan en la herramienta.Perfora los pocos trozos de discos de hojas de hoja. Coloque los discos de hojas en un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros. Luego, agregue 200 microlitros de tampón A en el tubo.Moler los discos de hojas hasta que queden suaves con una varilla de plástico manualmente. Deje el tubo sin interrupciones durante 10 minutos. El sobrenadante se aplica posteriormente a la amplificación del ADN.Para la amplificación isotérmica del ADN, agregue un microlitro de sobrenadante del paso 2.3 y un microlitro de acetato de magnesio en la solución B y mezcle bien. En el laboratorio, incubarlos en una incubadora simple a 37 grados durante 15 minutos. Para visualizar los resultados, agregue 10 microlitros de la mezcla del paso 3.2 en la solución C y mezcle bien.Incubarlos en la incubadora de 37 grados durante 60 minutos. Use una gafa y observe la señal de fluorescencia verde a través de un dispositivo de detección fluorescente de mano. Para probar la especificidad de CLas-DETECTR, primeras colonias puras de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri, que es el patógeno del cancro de los cítricos, y Burkholderia stabilis cepa 1440 aislada en nuestro laboratorio, se utilizaron para extraer su ADN genómico. Luego, este ADN genómico de tres bacterias y el ADN genómico de hojas de Newhall positivo para CLas se sometieron a la prueba CLas-DETECTR. Para probar la sensibilidad de CLas-DETECTR, se detectaron una serie de diluciones de fragmentos de ADN de CLas utilizando PCR, CLas-DETECTR y qPCR como se describe en el protocolo. Después de la especificidad y la prueba de sensibilidad, se utilizó el método CLas-DETECTR para detectar la presencia de CLas en campo.Muestras de hojas recolectadas del naranjo dulce Newhall cultivado en el vivero de recursos de germoplasma en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. También se aplicó qPCR, un método convincente de detección de CLas generalmente utilizado en el laboratorio. Las muestras de hojas del árbol de Newhall infectado con HLB y no infectado con HLB, en el que se confirmó la presencia del CLas en nuestro laboratorio, se sometieron a la prueba CLas-DETECTR.La señal de fluorescencia verde se capturó en la muestra infectada con HLB, pero no en el control negativo y no infectado con HLB. Se determinó la especificidad de CLas-DETECTR utilizando ácidos nucleicos extraídos de otras bacterias. En el ensayo CLas-DETECTR, solo el ADNg extraído de hojas de Newhall positivas para CLas demostró señales fluorescentes verdes.El ADNg extraído de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri y Burkholderia stabilis cepa 1440 no lo hicieron, lo que significa que el CLas-DETECTR puede detectar CLas específicamente. También probamos la sensibilidad de CLas-DETECTR utilizando una serie de diluciones de ADN CLas, enumeradas en el protocolo.La PCR puede detectar 201 copias por megalitro. Por otro lado, CLas-DETECTR puede detectar 2,01 copias por megalitro, lo que sugiere su disponibilidad como un diagnóstico de campo sensible. qPCR puede detectar 0,201 copias por megalitro y el valor de Ct es superior a 36.Por lo tanto, CLas-DETECTR es dos órdenes de magnitud más sensible que la PCR tradicional y un orden de magnitud menos sensible que la qPCR cuando se utilizaron amplicones específicos de CLas diluidos. Finalmente, se reexaminó la viabilidad del CLas-DETECTR para muestras de campo, y se comparó su sensibilidad con la qPCR. En cifras, vemos.Podemos ver que el valor de Ct es superior a 36 cuando la concentración de CLas es inferior a 0,2 copias por megalitro, que es una concentración muy baja. Entre las 15 muestras, el valor de Ct de las muestras 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 y 14 detectadas por qPCR fue inferior a 36. Se observó una aparente señal de fluorescencia verde.Por otro lado, cuando el valor de Ct de las muestras 6, 7, 9, 12 y 15 detectadas por qPCR fue indeterminado, no se observaron señales fluorescentes verdes. Además, se observaron señales fluorescentes verdes débiles cuando el valor de TC de las muestras 5 y 11 detectadas por qPCR fue superior a 36. Los resultados sugerirán que nuestra plataforma es una herramienta rápida, robusta y sensible para el diagnóstico de HLB en el campo.

Research

JoVE Journal

Biology

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