Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Detta arbete stöddes ekonomiskt av Kinas nationella nyckel FoU-program (2021YFD1400805), Major Science and Technology R & D-programmet i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), Projekt från Jiangxi Education Department (GJJ201449) och Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

1. Konstruktion av CLas-DETECTR
OBS: Konstruktionen av CLas-DETECTR är en fyrstegsprocess: lösningsberedning, citrus total DNA-isolering, isotermisk DNA-förstärkning och resultatvisualisering. Schemat för CLas-DETECTR-analysen illustreras i figur 1A.
<ol><li>Beredning av lösning<ol><li>Förbered buffert A: 20 mM NaOH i 6% PEG 200. För 100 ml, tillsätt 113 mg NaOH och 6 g PEG 200 till 80 mlH2Oi en flaska. Inkubera flaskan i ett vattenbad vid 60...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus,+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing.">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li><li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+(HLB-RPA-LFA)+for+rapid+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;.">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).</li><li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Denna studie presenterar en snabb och bärbar metod för att upptäcka CLas med namnet CLas-DETECTR, som kombinerar RPA- och CRISPR-Cas12a-systemen. Arbetsflödet illustreras i bild 1. CLas-DETECTR detekterar CLas med specificitet och känslighet (figur 2 och figur 3). Dessutom, med hjälp av Newhall-bladprover, detekterar CLas-DETECTR CLas med samma känslighet som qPCR (figur 4). I sy...

Huanglongbing (HLB) är en av de mest problematiska citrussjukdomarna i världen1. HLB orsakas av floemkoloniserande och krångliga bakterier Candidatus Liberibacter spp., inklusive Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus, och Ca. L. americanus 2. Den vanligaste HLB-associerade arten i Kina och USA är CLas, som överförs av asiatiska citruspsyllider (Diaphorina citri) eller genom ympning3. Efter att ha smittats av CLas visar citrusträd tillväxtminskning fram till döden2. De vanliga symptomen på citrusblad infekterade med CLas är fläckiga fläckar, gröna öar (små cirkulära mörkgröna prickar), upphöjda korkiga vener på tjockare och läderartade löv och icke-enhetliga gulnande skott2. Dessutom verkar frukter infekterade med CLas små och snedställda2.
Eftersom ingen citrussort är resistent mot HLB och det inte finns något terapeutiskt botemedel mot HLB, kräver förebyggande av HLB karantän och isolering av CLas-positiva citrusträd 2,3. Därför är tidig upptäckt avgörande för övervakning och karantän för att förhindra spridning av CLas och minimera ekonomiska förluster3. Dessutom behövs känslig CLas-detektion på grund av den låga titern av CLas i växter under det tidiga infektionsstadiet3. I Kina utförs CLas-detektering vanligtvis av vissa certifierade testcenter. Identifieringsprocessen tar dock vanligtvis minst 1 vecka och identifieringsavgiften är dyr. Därför, för att hjälpa till att övervaka HLB-incidensen
Olika tekniker har tillämpats för att diagnostisera HLB 4,5,6,7,8,9. Polymeraskedjereaktion (PCR) och kvantitativ PCR (qPCR) är de mest använda verktygen för CLas-detektion på grund av deras höga känslighet och specificitet 4,5. Dessa tekniker är dock starkt beroende av dyra instrument och högkvalificerad personal. Dessutom har flera isotermiska förstärkningsmetoder, såsom loopmedierad isotermisk förstärkning (LAMP), utvecklats som attraktiva alternativ till konventionella PCR-metoder på grund av deras enkelhet, snabbhet och låga kostnad 8,9,10. Det är dock utmanande att tillämpa dem för att exakt upptäcka CLas på grund av de icke-specifika förstärkningssignalerna, vilket kan orsaka falskt positiva resultat.
RNA-styrd CRISPR / Cas (grupperad regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar / CRISPR-associerade) endonukleasbaserad nukleinsyradetektering har utvecklats som nästa generations molekylära diagnostikteknik på grund av dess höga känslighet, specificitet och tillförlitlighet11,12,13,14. Dessa CRISPR/Cas-diagnostiktekniker förlitar sig på säkerhetsnukleasaktiviteten hos Cas-proteiner för att klyva enkelsträngat DNA (ssDNA) modifierat med en fluorescerande reporter och en fluorescenssläckare i varje ände av oligonukleotiderna, samt en fluorescensdetekteringsanordning för att fånga den frigjorda fluorescerande reportern11,12 . Nukleasaktiviteten hos flera Cas-effektorer som aktiveras av CRISPR RNA (crRNA) målduplex kan urskillningslöst klyva den omgivande icke-mål-ssDNA11. CRISPR-Cas12a (även kallat Cpf 1), ett klass 2-klass V-A CRISPR/CAS-SYSTEM, visar på flera fördelar jämfört med Cas9, såsom en lägre missmatchningstolerans och större specificitet13. Cas12a/crRNA-systemet har tillämpats för känslig och specifik detektion av nukleinsyrorna hos humana patogener och fytopatogener 14,15,16,17,18. Därför bör användning av Cas12a / crRNA-systemet möjliggöra noggrann och känslig detektion av nukleinsyran i CLas.
Cas12a ensam är inte teoretiskt känslig nog för att detektera låga nivåer av nukleinsyror. För att förbättra detektionskänsligheten kombineras därför CRISPR-Cas12a-detektion vanligtvis med ett isotermiskt förstärkningssteg14,15. Rekombinaspolymerasförstärkning (RPA) möjliggör känslig och snabb isotermisk DNA-förstärkning i ett temperaturområde från 37 °C till 42 °C19.
En detektionsplattform som heter DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) som kombinerar DNase-aktiviteten hos Cas12a med RPA och en fluorescensavläsning har nyligen utformats12 och har visat sig detektera nukleinsyra med högre känslighet20. Dessutom kan fluorescenssignalen som emitteras från de positiva proverna observeras genom en handhållen fluorescensdetekteringsanordning i fältet.
Eftersom vi förstärkte DNA med RPA, designade crRNA som riktade sig mot den femkopierade nrdB-genen (ribonukleotidreduktas β- subenhet) som är specifik för CLas21 och använde DNas-aktiviteten hos Cas12a-proteinet, kallade vi denna CLas-detektionsmetod CLas-DETECTR. Jämfört med befintliga CLas-detektionsmetoder är CLas-DETECTR snabb, exakt, känslig och distribuerbar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

Tidig upptäckt av Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) av citrusodlare underlättar tidigt ingripande och förhindrar spridning av sjukdomar. En enkel metod för snabb och bärbar Huanglongbing (HLB) diagnos presenteras här som kombinerar rekombinaspolymerasförstärkning och en fluorescerande reporter som använder nukleasaktiviteten hos det grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar / CRISPR-associerade 12a (CRISPR-Cas12a) systemet. Känsligheten hos denna teknik är mycket högre än PCR. Dessutom visade denna metod liknande resultat som qPCR när bladprover användes. Jämfört med konventionella CLas-detektionsmetoder kan detektionsmetoden som presenteras här slutföras på 90 minuter och fungerar i ett isotermiskt tillstånd som inte kräver användning av PCR-maskiner. Dessutom kan resultaten visualiseras genom en handhållen fluorescerande detekteringsanordning i fältet.

Här har vi beskrivit en portabel plattform, CLas-DETECTR, som kammar RPA- och CRISPR-Cas12a-systemen för att diagnostisera HLB i fält. Schemat för CLas-DETECTR illustreras i figur 1A.
När bladprover från de HLB-infekterade och HLB-oinfekterade Newhall-träden (figur 1B), för vilka förekomsten av CLas bekräftades av PCR (figur 1C), utsattes för CLas-DETECTR-testet, sågs en grön fluorescenssignal i det HLB-infekterade provet men inte i det HLB-oinfektera...

Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

I detta arbete utvecklades en snabb, känslig och portabel detektionsmetod för Candidatus Liberibacter asiaticus baserad på rekombinaspolymerasförstärkning i kombination med CRISPR-Cas12a.

Fältdistribuerbar Candidatus liberibacter asiaticus-detektion med rekombinaspolymerasförstärkning i kombination med CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, förkortat HLB. Det är en förödande citrussjukdom världen över. I de mest citrusproducerande länderna, som Kina och USA, orsakas HLB av den floembegränsade bakterien Candidatus Liberibacter asiaticus, förkortad CLas.Tidig upptäckt av CLas var viktigt för odlare som underlättar tidigt ingripande och förhindrar sjukdomsspridning. Så här utvecklade vi en ny metod för snabb och portabel HLB-diagnos, i kombination med rekombinaspolymerasförstärkning och CRISPR-Cas12a-systemet. Vi kallade det CLas-DETECTR.Känsligheten hos vår plattform är mycket högre än PCR. Dessutom visar det liknande resultat med qPCR när bladproverna användes. Jämför med konventionella CLas-detektioner, vår metod kan slutföras på 90 minuter och fungerar i isotermiskt tillstånd.Resultatet kan också visualiseras genom en handhållen fluorescerande detekteringsanordning i fältet. CLas-DETECTR innehåller fyra steg: lösningsberedning, citrus total DNA-isolering, isotermisk DNA-förstärkning och resultaten av visualisering. Schemat för CLas-DETECTR-analysen illustreras här.Buffert A, lösning B och lösning C framställs enligt beskrivningen i protokollet. För att spara tid och göra denna metod lämplig för fält-CLas-detektion användes E.coli-polyetylenglykolbaserad metod för att erhålla råa växtextrakt för DNA-förstärkning. Citrusblad används i verktyget.Stansa de få bitarna av bladskivor från bladet. Sätt bladskivor i ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Tillsätt sedan 200 mikroliter buffert A i röret.Slipa bladskivorna tills de är släta med en plaststav manuellt. Lämna röret ostört i 10 minuter. Supernatanten appliceras därefter på DNA-förstärkning.För isotermisk DNA-förstärkning, tillsätt en mikroliter supernatant från steg 2.3 och en mikroliter magnesiumacetat i lösning B och blanda väl. I labbet inkubera dem i en enkel inkubator vid 37 grader i 15 minuter. För att visualisera resultaten, tillsätt 10 mikroliter av blandningen från steg 3.2 till lösning C och blanda väl.Inkubera dem i 37 graders inkubatorn i 60 minuter. Använd en skyddsglasögon och observera den gröna fluorescenssignalen genom en handhållen fluorescerande detekteringsanordning. För att testa specificiteten hos CLas-DETECTR, första rena kolonier av Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri som är patogenen för citrus canker och Burkholderia stabilis stam 1440 isolerade i vårt laboratorium användes för att extrahera deras genomiska DNA. Sedan utsattes detta tre bakteriegenomiska DNA och det CLas-positiva Newhall-bladets genomiska DNA för CLas-DETECTR-testet. För att testa känsligheten hos CLas-DETECTR detekterades en serie CLas DNA-fragmentutspädningar med PCR, CLas-DETECTR och qPCR som beskrivs i protokollet Efter specificiteten och känslighetstestet användes CLas-DETECTR-metoden för att detektera närvaron av CLas i fält.Bladprover som samlats in från Newhall sött apelsinträd som odlas i bakterieplasmaresursskolan på campus vid Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. qPCR, en övertygande CLas-detektionsmetod som vanligtvis används i labbet tillämpades också. Bladproverna från HLB-infekterade och HLB-oinfekterade Newhall-träd, där närvaron av CLas bekräftades i vårt laboratorium, utsattes för CLas-DETECTR-testet.Den gröna fluorescenssignalen fångades i det HLB-infekterade provet, men inte i HLB-oinfekterad och negativ kontroll. Vi bestämde specificiteten hos CLas-DETECTR med hjälp av nukleinsyror extraherade från andra bakterier. I CLas-DETECTR-analysen visade endast gDNA extraherat från CLas-positiva Newhall-blad gröna fluorescerande signaler.gDNA extraherad från Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri och Burkholderia stabilis stam 1440 gjorde det inte, vilket innebär att CLas-DETECTR kan detektera CLas specifikt. Vi testade också känsligheten hos CLas-DETECTR med hjälp av en serie CLas DNA-utspädningar, listade i protokollet.PCR kan upptäcka 201 kopior per megaliter. Å andra sidan kan CLas-DETECTR upptäcka 2,01 kopior per megaliter, vilket tyder på dess tillgänglighet som en känslig fältdiagnostik. qPCR kan upptäcka 0,201 kopior per megaliter och Ct-värdet är högre än 36.Så CLas-DETECTR är två storleksordningar känsligare än traditionell PCR och en storleksordning mindre känslig än qPCR när utspädda CLas-specifika amplikoner användes. Slutligen undersökte på nytt genomförbarheten av CLas-DETECTR för fältprover och jämförde dess känslighet med qPCR. I siffror ser vi.Vi kan se att Ct-värdet är högre än 36 när CLas-koncentrationen är mindre än 0,2 kopior per megaliter, vilket är en mycket låg koncentration. Bland de 15 proverna var Ct-värdet för proverna 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 och 14 som detekterades av qPCR mindre än 36. En uppenbar grön fluorescenssignaler observerades.Å andra sidan, när Ct-värdet för proverna 6, 7, 9, 12 och 15 detekterades av qPCR var obestämt, observerades inga gröna fluorescerande signaler. Dessutom observerades svaga gröna fluorescerande signaler när CT-värdet för prov 5 och 11 detekterade av qPCR var högre än 36. Resultaten tyder på att vår plattform är ett snabbt, robust och känsligt verktyg för HLB-diagnostik i fält.

Research

JoVE Journal

Biology

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Märkning stamceller med fluorescerande färger för icke-invasiv Detection med optisk avbildning

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Principer för platsspecifika Recombinase (SSR) Teknik

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Molekylär evolution av Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Intervju: HIV-1 proviral DNA Excision Använda en Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Kromosom Replikera Timing kombination med fluorescerande<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolering från Cell Specifika Subpopulationer Använda Laser-capture Microdissection Kombinerat med Rapid immunomärkning

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Utveckling av en kvantitativ Recombinase polymeras amplifieringsanalysen med en intern positiv kontroll

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...