Name: field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFD1400805), Jiangxi Eyaleti Büyük Bilim ve Teknoloji Ar-Ge Programı (20194ABC28007), Jiangxi Eğitim Departmanı Projeleri (GJJ201449) ve Jiangxi Eyaletindeki Modern Tarımsal Bilimsel Araştırmaların İşbirlikçi İnovasyonu (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

1. CLas-DETECTR'ın yapımı
NOT: CLas-DETECTR'ın yapımı dört adımlı bir işlemdir: çözelti hazırlama, narenciye toplam DNA izolasyonu, izotermal DNA amplifikasyonu ve sonuç görselleştirme. CLas-DETECTR testinin şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.
<ol><li>Çözelti hazırlama<ol><li>Arabellek A'yı hazırlayın: %6 PEG 200'de 20 mM NaOH. 100 mL için, bir şişede 80 mL H2 O içine 113 mg NaOH ve 6 g PEG200ekleyin. Tüm PEG 200 çözü...

<ol>
	<li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin.">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candidatus+Liberibacter-host+interface:+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control.">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li><li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR.">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37 (2009).</li><li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR.">Multiplex detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).</li><li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+from+Murraya+paniculata+in+Guandong,+China.">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).</li><li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+in+citrus,+and+identification+by+GeLC-MS/MS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens.">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272 (2016).</li><li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus,+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing.">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li><li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+(HLB-RPA-LFA)+for+rapid+detection+of+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;.">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).</li><li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+'Candidatus+Liberibacter+solanacearum'+in+potatoes+and+psyllids.">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li><li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+diagnostics+with+CRISPR.">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13,+Cas12a,+and+Csm6.">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay.">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).</li><li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics.">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568 (2021).</li><li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV,+TEV,+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13.">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay.">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li><li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification:+Basics,+applications+and+recent+advances.">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules.">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;:+Biological+implications+and+PCR+detection+application.">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020 (2016).</li><li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria,+eukaryotic+tissue+samples,+and+whole+blood.">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li><li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri.">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).</li><li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+('Candidatus+Liberibacter+asiaticus')+using+Cas12a-based+methods.">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li></ol>

Bu çalışma, RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini birleştiren CLas-DETECTR adlı CLas'ı tespit etmek için hızlı ve taşınabilir bir yöntem sunmaktadır. İş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. CLas-DETECTR, CLas'ı özgüllük ve hassasiyetle algılar (Şekil 2 ve Şekil 3). Ayrıca, Newhall yaprak örneklerini kullanan CLas-DETECTR, CLas'ı qPCR ile aynı hassasiyetle algılar (Şekil...

Huanglongbing (HLB), dünya çapında en sorunlu narenciye hastalıklarından biridir1. HLB, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus ve Ca. L. americanus2 dahil olmak üzere floem kolonize edici ve titiz bakteriler Candidatus Liberibacter spp.'den kaynaklanır. Çin ve ABD'de HLB ile ilişkili en yaygın tür, Asya narenciye psyllidleri (Diaphorina citri) veya aşılama yoluyla bulaşan CLas'tır3. CLas tarafından enfekte edildikten sonra, narenciye ağaçları ölüm2'ye kadar büyüme düşüşü gösterir. CLas ile enfekte olmuş narenciye yapraklarının yaygın semptomları lekeli benek, yeşil adalar (küçük dairesel koyu yeşil noktalar), daha kalın ve kösele yapraklar üzerinde yükseltilmiş mantarlı damarlar ve düzgün olmayan sararma sürgünleridir2. Ek olarak, CLas ile enfekte olmuş meyveler küçük ve orantısız görünür2.
Hiçbir narenciye çeşidi HLB'ye dirençli olmadığından ve HLB için terapötik bir tedavi olmadığından, HLB'nin önlenmesi CLas pozitif narenciye ağaçlarının karantinaya alınmasını ve izolasyonunu gerektirir 2,3. Bu nedenle, CLas'ın yayılmasını önlemek ve ekonomik kayıpları en aza indirmek için erken teşhis izleme ve karantinaya almak için kritiköneme sahiptir 3. Ek olarak, enfeksiyonun erken evresinde bitkilerde CLas'ın düşük titresi nedeniyle hassas CLas tespiti gereklidir3. Çin'de, CLas tespiti genellikle belirli sertifikalı test merkezleri tarafından gerçekleştirilir. Bununla birlikte, algılama işlemi genellikle en az 1 hafta sürer ve tespit ücreti pahalıdır. Bu nedenle, HLB insidansını izlemeye yardımcı olmak için
HLB 4,5,6,7,8,9 tanısında çeşitli teknolojiler uygulanmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif PCR (qPCR), yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri nedeniyle CLas tespiti için en çok kullanılan araçlardır 4,5. Bununla birlikte, bu teknolojiler büyük ölçüde pahalı araçlara ve yüksek vasıflı personele dayanmaktadır. Ek olarak, döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) gibi çeşitli izotermal amplifikasyon yöntemleri, basitlikleri, hızları ve düşük maliyetleri nedeniyle geleneksel PCR yöntemlerine cazip alternatifler olarak geliştirilmiştir 8,9,10. Bununla birlikte, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilecek spesifik olmayan amplifikasyon sinyalleri nedeniyle CLas'ı doğru bir şekilde tespit etmek için bunları uygulamak zordur.
RNA rehberliğinde CRISPR / Cas (düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili kümelenmiş) endonükleaz bazlı nükleik asit tespiti, yüksek hassasiyeti, özgüllüğü ve güvenilirliği nedeniyle yeni nesil bir moleküler tanı teknolojisi olarak geliştirilmiştir11,12,13,14. Bu CRISPR / Cas teşhis teknolojileri, oligonükleotidlerin her iki ucunda bir floresan muhabir ve bir floresan söndürücü ile modifiye edilmiş tek sarmallı DNA'yı (ssDNA) parçalamak için Cas proteinlerinin kollateral nükleaz aktivitesine ve ayrıca serbest bırakılan floresan muhabirini yakalamak için bir floresan tespit cihazına dayanır11,12 . CRISPR RNA (crRNA) hedef dubleks tarafından aktive edilen birkaç Cas efektörünün nükleaz aktivitesi, çevredeki hedef olmayan ssDNA11'i ayrım gözetmeksizin parçalayabilir. Sınıf 2 tip V-A CRISPR/Cas sistemi olan CRISPR-Cas12a (Cpf 1 olarak da adlandırılır), Cas9 ile karşılaştırıldığında, daha düşük uyumsuzluk toleransı ve daha fazla özgüllük13 gibi çeşitli avantajlar gösterir. Cas12a/crRNA sistemi, insan patojenlerinin ve fitopatojenlerin nükleik asitlerinin hassas ve spesifik tespiti için uygulanmıştır 14,15,16,17,18. Bu nedenle, Cas12a / crRNA sisteminin kullanılması, CLas'ın nükleik asidinin doğru ve hassas bir şekilde algılanmasını sağlamalıdır.
Cas12a tek başına teorik olarak düşük nükleik asit seviyelerini tespit edecek kadar hassas değildir. Bu nedenle, algılama hassasiyetini artırmak için, CRISPR-Cas12a algılama tipik olarak bir izotermal amplifikasyon adımı14,15 ile birleştirilir. Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA), 37 °C ila 42 °C19 sıcaklık aralığında hassas ve hızlı izotermal DNA amplifikasyonu sağlar.
Cas12a'nın DNaz aktivitesini RPA ve floresan okuması ile birleştiren DETECTR (DNA Endonükleaz Hedefli CRISPR Trans Reporter) adlı bir tespit platformu yakın zamanda12 geliştirilmiştir ve nükleik asidi daha yüksek hassasiyetle tespit ettiği gösterilmiştir20. Ayrıca, pozitif numunelerden yayılan floresan sinyali, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla gözlemlenebilir.
DNA'yı RPA ile güçlendirdiğimizden, CLas 21'e özgü beş kopyalı nrdB (ribonükleotid redüktaz β- alt birim) genini hedefleyen crRNA'yı tasarladığımızdan veCas12a proteininin DNaz aktivitesini kullandığımızdan, buna CLas tespit yöntemini CLas-DETECTR adını verdik. Mevcut CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, CLas-DETECTR hızlı, doğru, hassas ve konuşlandırılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09319KE1</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Genomic DNA Extraction Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1600</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbCas12a&#160;</td>
			<td>TOLOBIO</td>
			<td>32104-01</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq Version 2.0 plus dye</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR902A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld fluorescent detection device&#160;</td>
			<td>LUYOR</td>
			<td>3415RG</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>114</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate, MgOAc</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10019718</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB buffer 3.1&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7203</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>PST-0208-FT-C</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 200&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3015</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>R045A</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820B</td>
			<td>China</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp Basic</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TABAS03KIT</td>
			<td>UK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field-deployable candidatus liberibacter asiaticus detection using recombinase polymerase amplification combined with crispr-cas12a

Candidatus Liberibacter asiaticus'un (CLas) narenciye yetiştiricileri tarafından erken tespiti, erken müdahaleyi kolaylaştırır ve hastalığın yayılmasını önler. Hızlı ve taşınabilir Huanglongbing (HLB) tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu ve kümelenmiş düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili 12a (CRISPR-Cas12a) sisteminin nükleaz aktivitesini kullanan bir floresan muhabiri birleştiren basit bir yöntem sunulmaktadır. Bu tekniğin duyarlılığı PCR'den çok daha yüksektir. Ayrıca, bu yöntem yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR'ye benzer sonuçlar göstermiştir. Geleneksel CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, burada sunulan algılama yöntemi 90 dakikada tamamlanabilir ve PCR makinelerinin kullanılmasını gerektirmeyen izotermal bir durumda çalışır. Ek olarak, sonuçlar sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla görselleştirilebilir.

Burada, sahada HLB'yi teşhis etmek için RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini tarayan taşınabilir bir platform olan CLas-DETECTR'ı tanımladık. CLas-DETECTR şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.
CLas-enfekte olmuş ve HLB-enfekte olmamış Newhall ağaçlarından (Şekil 1B), CLas-DETECTR testine tabi tutulduğunda, HLB-enfekte olmuş numunede yeşil bir floresan sinyali görüldü, ancak HLB-enfekte olmamış numunede ve negatif kontrolde görülmedi (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a at JoVE.com

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, HLB olarak kısaltılmıştır. Dünya çapında yıkıcı bir narenciye hastalığıdır. Çin ve ABD gibi en narenciye üreten ülkelerde, HLB'ye CLas olarak kısaltılan floem kısıtlamalı bakteri Candidatus Liberibacter asiaticus neden olur.CLas'ın erken teşhisi, erken müdahaleyi kolaylaştıran ve hastalığın yayılmasını önleyen yetiştiriciler için önemliydi. Bu yüzden burada hızlı ve taşınabilir HLB tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR-Cas12a sistemi ile birleşen yeni bir yöntem geliştirdik. Biz buna CLas-DETECTR adını verdik.Platformumuzun hassasiyeti PCR'den çok daha yüksektir. Ayrıca, yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR ile benzer sonuçlar gösterir. Geleneksel CLas algılamalarıyla karşılaştırıldığında, yöntemimiz 90 dakika içinde tamamlanabilir ve izotermal bir durumda çalışır.Sonuç, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla da görselleştirilebilir. CLas-DETECTR dört adımdan oluşur: çözelti hazırlama, narenciye toplam DNA izolasyonu, izotermal DNA amplifikasyonu ve görselleştirme sonuçları. CLas-DETECTR testinin şeması burada gösterilmiştir.Tampon A, Çözüm B ve Çözüm C, protokolde açıklandığı gibi hazırlanır. Zamandan tasarruf etmek ve bu yöntemi alan CLas tespiti için uygun hale getirmek için, DNA amplifikasyonu için ham bitki özleri elde etmek için E.coli polietilen glikol bazlı yaklaşım kullanılmıştır. Narenciye yaprakları alette kullanılır.Birkaç parça yaprak diskini yapraktan delin. Yaprak diskleri 1,5 mililitrelik bir Eppendorf tüpüne koyun. Ardından, tüpe 200 mikrolitre Tampon A ekleyin.Yaprak diskleri plastik bir çubukla pürüzsüz hale gelene kadar manuel olarak öğütün. Tüpü 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Süpernatant daha sonra DNA amplifikasyonuna uygulanır.İzotermal DNA amplifikasyonu için, adım 2.3'ten bir mikrolitre süpernatant ve bir mikrolitre magnezyum asetat çözeltisi B'ye ekleyin ve iyice karıştırın. Laboratuvarda, onları 15 dakika boyunca 37 derecede basit bir inkübatörde inkübe edin. Sonuçları görselleştirmek için, 3.2. adımdan itibaren 10 mikrolitre karışımı çözelti C'ye ekleyin ve iyice karıştırın.Onları 37 derecelik inkübatörde 60 dakika boyunca inkübe edin. Bir gözlük takın ve el tipi bir floresan algılama cihazı aracılığıyla yeşil floresan sinyalini gözlemleyin. CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü test etmek için, Agrobacterium tumefaciens GV3101'in ilk saf kolonileri, Xanthomonas citri subsp.Laboratuvarımızda izole edilen citrus canker ve Burkholderia stabilis suşu 1440'ın patojeni olan sitri, genomik DNA'larını çıkarmak için kullanıldı. Daha sonra bu üç bakteri genomik DNA'sı ve CLas-pozitif Newhall yaprakları genomik DNA'sı CLas-DETECTR testine tabi tutuldu. CLas-DETECTR'ın duyarlılığını test etmek için, protokolde açıklandığı gibi PCR, CLas-DETECTR ve qPCR kullanılarak bir dizi CLas DNA fragmanı seyreltmesi tespit edildi Özgüllük ve duyarlılık testinden sonra, CLas-DETECTR yöntemi CLas'ın sahadaki varlığını tespit etmek için kullanıldı.Gannan Normal Üniversitesi, Jiangxi, Çin kampüsündeki germplazma kaynak fidanlığında yetiştirilen Newhall tatlı portakal ağacından toplanan yaprak örnekleri. qPCR, genellikle laboratuvarda kullanılan ikna edici bir CLas tespit yöntemi de uygulanmıştır. Laboratuvarımızda CLas'ın varlığının doğrulandığı HLB-enfekte ve HLB-enfekte olmamış Newhall ağacından elde edilen yaprak örnekleri, CLas-DETECTR testine tabi tutuldu.Yeşil floresan sinyali, HLB ile enfekte olmuş numunede yakalandı, ancak HLB-enfekte olmamış ve negatif kontrolde yakalanmadı. CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü, diğer bakterilerden ekstrakte edilen nükleik asitleri kullanarak belirledik. CLas-DETECTR testinde, sadece CLas-pozitif Newhall yapraklarından ekstrakte edilen gDNA yeşil floresan sinyalleri gösterdi.Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri ve Burkholderia stabilis suşu 1440'tan ekstrakte edilen gDNA, CLas-DETECTR'ın CLas'ı spesifik olarak tespit edebileceği anlamına gelir. Ayrıca CLas-DETECTR'ın duyarlılığını, protokolde listelenen bir dizi CLas DNA seyreltmesi kullanarak test ettik.PCR, megalitre başına 201 kopya tespit edebilir. Öte yandan, CLas-DETECTR megalitre başına 2.01 kopya tespit edebilir ve bu da hassas bir alan teşhisi olarak kullanılabilirliğini gösterir. qPCR, megalitre başına 0,201 kopya algılayabilir ve Ct değeri 36'dan yüksektir.Bu nedenle CLas-DETECTR, geleneksel PCR'den iki büyüklük sırasına göre daha hassastır ve seyreltilmiş CLas'a özgü amplikonlar kullanıldığında qPCR'den daha az hassas bir büyüklük sırasına sahiptir. Son olarak, CLas-DETECTR'ın saha örnekleri için fizibilitesini yeniden inceledi ve duyarlılığını qPCR ile karşılaştırdı. Rakamlarda görüyoruz.CLas konsantrasyonu megalitre başına 0.2 kopyadan az olduğunda Ct değerinin 36'dan yüksek olduğunu görebiliriz, bu da çok düşük bir konsantrasyondur. 15 örneklem arasında, qPCR ile saptanan 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ve 14 numaralı örneklerin Ct değeri 36'dan azdı. Belirgin bir yeşil floresan sinyalleri gözlendi.Öte yandan, qPCR ile tespit edilen 6, 7, 9, 12 ve 15 örneklerinin Ct değeri belirlenmediğinde, yeşil floresan sinyalleri gözlenmemiştir. Ek olarak, qPCR ile tespit edilen örnek 5 ve 11'in BT değeri 36'dan yüksek olduğunda zayıf yeşil floresan sinyalleri gözlenmiştir. Sonuçlar, platformumuzun sahada HLB teşhisi için hızlı, sağlam ve hassas bir araç olduğunu gösterecektir.

Research

JoVE Journal

Biology

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site Özel Recombinase (SSR) Teknoloji İlkeleri

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Tre Recombinase Moleküler Evrim

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Röportaj: Evolved Recombinase kullanarak HIV-1 Proviral DNA eksizyonu

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...