Name: a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00
Duration: 8 min 1 s
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感谢美国化学学会石油研究基金的捐助者支持这项研究（批准号60191-UNI5）。作者要感谢Ido Braslavsky教授率先使用微流体装置来研究防冻蛋白和冰。作者感谢Arthur DeVries教授，Konrad Meister教授和Peter Davies教授提供防冻蛋白样品。

1. 微流控器件制造
<ol><li>用铝箔覆盖培养皿的内表面，并将预先准备好的模具放入培养皿中。<ol><li>使用参考文献中描述的光刻技术制造模具。本工作中使用的两种器件设计如图 1所示。</li>
	</ol></li>
	<li>通过称取固化剂和弹性体的1：10（重量）混合物（参见 材料表）并连续混合约5分钟，直到混合物呈白色且几乎不透明，制备30-40mL的PDMS混合物。 注意：将塑料杯放在体重秤上，将弹性体倒入杯中，然后加入固化剂以达到1：10的重量比。</li>
	<li>将PDMS混合物倒入带有模具的培养皿中，并在干燥器中脱气，直到没有气泡残留（约30分钟）。</li>
	<li>用液体PDMS在烤箱或70°C的热板上烘烤模具，直到获得类似橡胶的稠度。此过程大约需要一个小时。</li>
	<li>用手术刀在特征周围描摹，将设备切出，注意用手术刀向前推而不是向下推，因为模具很脆弱。取出切口的PDMS装置，将其倒置在新的培养皿中。通过连接和移除一块胶带去除底表面上的灰尘和污垢颗粒（见 材料表）。</li>
	<li>使用钝针（20 G）根据印记图案在设备上打出孔，必要时使用显微镜。确保孔穿透设备的另一侧，并使用镊子取出打孔件。</li>
	<li>用水和肥皂彻底清洗盖玻片（18 x 18 毫米，0.14 毫米厚），然后用异丙醇清洗。使用气压擦干清洁的盖玻片。</li>
	<li>将清洁后的PDMS和盖玻片插入等离子清洁器，关闭阀门，然后打开电源，真空和泵。让等离子清洁器运行约一分钟，将射频设置为 HI，并使用精细阀门允许一些空气进入等离子清洁器。<ol><li>当观察窗的颜色从紫色变为粉红色时，让等离子清洁器工作 50 秒并关闭射频。保持泵打开一分钟，关闭后，逐渐打开主阀，让空气进入等离子清洁器。 注意：获得类似结果的另一种方法是热粘合。对于这种方法，将模具放在盖玻片上，并将其放在设置为70-80°C的热板上约60分钟。</li>
	</ol></li>
	<li>将PDMS表面按在清洁的盖玻片上，并在盖玻片上稍微向上拉时观察到没有脱落，以确认它们已粘合。</li>
	<li>用一把钳子固定 90° 钝针 （18 G） 的针头，然后拔下塑料注射器连接器将其取出。将针的一端插入Tygon管（0.020“内径，0.060”外径，见 材料表），另一端插入设备的一个冲孔。对其他孔重复此过程。</li>
	<li>要去除气泡，请用玻璃注射器将水/缓冲液注入通道（泵是可选的，但此处未使用泵）。在将液体注入设备之前，用0.22μm过滤器过滤所有液体。</li>
	<li>使用封闭剂（例如 1% BSA 溶液）来防止荧光标记的 AFP 结合到 PDMS 壁上。将封闭剂注入入口通道，使其在微通道中停留20分钟。然后，将缓冲溶液注入入口通道以冲洗出BSA溶液。 注意： 所得的 PDMS 设备沿其底面连接到盖玻片上，连接到其入口和出口孔中的管道，并在其通道中涂有封闭剂。</li>
</ol>2. 设置微流控装置
<ol><li>在铜冷台表面涂抹少量浸油（见 材料表），并使用不起毛的擦拭物铺开以形成一层薄薄的油。接下来，将一个干净的蓝宝石圆盘（见 材料表）放在创建的油层上。将一滴浸油涂在蓝宝石圆盘的中心，并将PDMS设备放置在液滴上，使设备的特征在冷载物台的观察孔上对齐。</li>
	<li>将设备固定到位，并使用胶带将管子固定到容纳冷台的铝盒的外壁上。记下每个特定管的位置。</li>
	<li>使用玻璃注射器将 4-5 μL AF（G）P 溶液（参见 材料表）注入入口通道。合上冷载物台的盖子。 注意：AFP溶液的浓度可以根据其荧光强度变化和决定。在本协议中，浓度范围为5-40μL。</li>
</ol>3. 微流控通道中单晶的形成
<ol><li>用干燥空气/氮气吹扫冷台，以防止其内部形成冷凝。激活循环冷却浴，使水循环通过冷级并用作散热器。</li>
	<li>启动温度控制程序并将温度设置为-25°C。 注意：当样品达到~-20°C的温度时，将发生冻结，这可以观察到样品突然变暗和粗糙。此时可以使用任何物镜，最好是4倍物镜，它使用户能够观察整个微流体通道。</li>
	<li>缓慢地，将温度升高约1°C / 5 s，接近样品的熔点，其范围为-1至-0.2°C，具体取决于AF（G）P溶液中使用的缓冲液。当温度接近熔点时，等到几个单晶被分离出来。 注意：如果需要，可以使用固定在显微镜上的红外激光（980 nm）（参见 材料表）局部融化不需要的冰。只要激光开启，它就会融化附近的冰晶。</li>
	<li>此时，建议切换到10倍或20倍物镜，以更好地观察单晶。在所需位置获得单晶后，通过稍微降低温度（~0.01°C）来生长晶体，直到晶体的边缘与通道壁相遇。</li>
	<li>切换到50倍物镜，将AF（G）P溶液注入通道，并观察荧光强度增加，表明蛋白质溶液已成功注入通道。小心执行此步骤，以避免在溶液交换过程中冰晶融化。在溶液交换过程中密切监控和调整流速（通过在玻璃注射器上施加更多/更少的压力）和温度。</li>
	<li>让蛋白质有足够的时间积累并结合到晶体表面。 注意：这取决于AF（G）P5，25的积累和吸附速率。在典型的实验中，允许5-10分钟AFP积累</li>
</ol>4. 热滞后 （TH） 活性测量
注意：此步骤是可选的。
<ol><li>通过以0.002°C的小步骤调节温度并观察小晶体在不熔化的情况下可以承受的最高温度来确定晶体的熔点。</li>
	<li>在温度控制器的 RAMP 功能上，将冷却速率设置为-0.05至-0.01°C/4秒并激活RAMP。注意晶体突然生长的确切温度。 注意：此值称为突发温度，对应于冻结温度。熔化温度和冷冻温度之间的差异是TH活性25。</li>
</ol>5. 单晶周围的溶液交换
<ol><li>确保样品温度在TH间隙中，以防止实验过程中晶体熔化或生长。</li>
	<li>使用NIS元素成像程序（参见 材料表）记录溶液交换过程，以便以后进行荧光数据分析。缓慢地将缓冲溶液注入微流体装置的第二个入口，并观察荧光信号的降低，其速率取决于施加到注射器的压力。<ol><li>使用此视觉表示来确保施加的压力不会太高，以免导致晶体熔化。有关演示溶液交换过程的一系列图像，请参见 图 2 。</li>
	</ol></li>
	<li>使用成像程序测量微流体通道中的荧光强度。 注意：信号应在晶体表面附近的区域达到峰值，表明AFP结合，并且在周围溶液中应相对较低，该溶液已用缓冲液冲洗。</li>
	<li>按照步骤4测量溶液交换后的TH活性。</li>
	<li>通过分离新晶体重复实验（步骤3.3-3.5）。用玻璃注射器注射AFP溶液并重复溶液交换（步骤5.1-5.3）。获得新的单晶（步骤3.3-3.5），并使用玻璃注射器将AFP溶液流入通道中。</li>
</ol>6. 包合物水合物实验
<ol><li>为了获得THF水合物，制备摩尔比为1：15的THF/水溶液，其体积比为1：3.326。在以下实验中使用的所有溶液中保持该比例，包括含有AF（G）Ps或其他抑制剂的溶液。</li>
	<li>按照步骤1和2准备微流体装置并将其置于冷阶段。将温度设置为-25°C;样品将在~-20°C下冻结，如步骤3.2中所述。</li>
	<li>THF溶液冷冻后，慢慢提高温度，直到所有冰融化。 注意：THF会稍微降低冰的熔点。</li>
	<li>为确保所有冰晶在排除水合物时融化，请将温度保持在1°C3分钟。</li>
	<li>将温度设置为-2°C，并在没有抑制剂的情况下观察微流体通道中出现的水合物丰度。 注意：THF水合物的形状为八面体（图2），在某些情况下，晶体非常薄;因此，清晰的观察可能具有挑战性。在这些情况下，建议重复步骤6.4-6.5以获得新的晶体。</li>
	<li>使用玻璃注射器将AF（G）P /抑制剂注入微流体通道，同时调节温度以确保获得的晶体不会熔化/生长。等待几分钟，让抑制剂分子吸附到晶体表面。</li>
	<li>如果需要，按照步骤 4 测量 TH 活性。</li>
	<li>如步骤5.2-5.3中所述交换晶体周围的溶液。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-Binding+Proteins+and+Their+Function.">Ice-Binding Proteins and Their Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).</li><li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+are+antifreeze+proteins+in+solution+essential+for+ice+growth+inhibition.">When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition.</a> Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).</li><li>Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+glycoproteins+bind+irreversibly+to+ice.">Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).</li><li>Braslavsky, I., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LabVIEW-operated+Novel+Nanoliter+Osmometer+for+Ice+Binding+Protein+Investigations.">LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).</li><li>Ruppel, C. D., Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+climate+change+and+methane+hydrates.">The interaction of climate change and methane hydrates.</a> Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).</li><li>Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alcohols+and+diols+on+PVCap-induced+hydrate+crystal+growth+patterns+in+methane+systems.">Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems.</a> Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).</li><li>Sa, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+methane+and+natural+gas+hydrate+formation+by+altering+the+structure+of+water+with+amino+acids.">Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids.</a> Scientific Reports. 6, 31582 (2016).</li><li>Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+kinetic+inhibitors+for+natural+gas+hydrates.">Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates.</a> Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).</li><li>Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Inhibition+of+Gas+Hydrates+by+&#945;-Helical+Antifreeze+Proteins.">Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by &#945;-Helical Antifreeze Proteins.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antifreeze+proteins+on+the+nucleation,+growth,+and+the+memory+effect+during+tetrahydrofuran+clathrate+hydrate+formation.">Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tetrahydrofuran+clathrate-hydrate+formation+with+antifreeze+protein.">The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein.</a> Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).</li><li>Walker, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+as+gas+hydrate+inhibitors.">Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors.</a> Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).</li><li>Gordienko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+green+hydrate+inhibitor:+imaging+antifreeze+proteins+on+clathrates.">Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates.</a> PloS One. 5 (2), 8953 (2010).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+generation+using+a+polydimethylsiloxane+(PDMS)+co-axial+flow+focus+device.">Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).</li><li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing:+An+overview.">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview.</a> Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).</li><li>Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography.">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).</li><li>Haleva, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cold-finger+device+for+the+investigation+of+ice-binding+proteins.">Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins.</a> Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).</li><li>Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+that+accumulate+on+different+ice+crystal+planes+produce+distinct+thermal+hysteresis+dynamics.">Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).</li><li>Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption-inhibition+of+clathrate+hydrates+by+self-assembled+nanostructures.">Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures.</a> ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).</li><li>Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v., Ward, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+unsteady+morphologies+at+ice+interfaces+driven+by+D2O-H2O+exchange.">Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).</li><li>Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+growth+acceleration+by+antifreeze+proteins+leads+to+higher+thermal+hysteresis+activity.">Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity.</a> Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).</li></ol>

本协议旨在利用微流体流与微观晶体的组合，以揭示晶体生长及其抑制的新见解。毫开尔文分辨率温控冷级27 能够控制位于微流体通道内的单个微观晶体，从而允许在其周围交换溶液。虽然微流体装置的制造是标准的，并且类似于常见的做法17，18，但对装置内部晶体生长和熔化的控制是独特而新颖的。该系统中最关键的组件是出色的温度控制，这是通过使用帕尔贴热电冷却器、来自样品附近的热敏电阻的反馈以及控制反馈回路的高分辨率温度控制器来实现的。
另一个关键步骤是溶液交换本身，因为在此过程中晶体可能会熔化或生长;因此，在溶液交换过程中必须调整温度以防止生长/熔化。微流体通道中晶体的形成会干扰液体流动，并构成该系统的主要挑战;因此，必须控制这些晶体的生长。在这里，红外激光器（980nm）安装在倒置显微镜上，用于局部融化不需要的冰/水合物晶体28。如果无法使用这种激光器，微流体装置的金属连接器可以通过额外的帕尔贴热电冷却器加热，该冷却器将融化装置入口/出口中的冰。
这里描述的方法包括家庭开发的仪器（冷阶段），需要培训，因为上述一些步骤具有挑战性。由于即使不打算流动，晶体周围溶液的浓度也可能发生变化，因此简单的校准步骤5 可以根据荧光信号提供可靠的浓度估计。不需要的流量（例如在TH测量期间）的另一种可能的解决方案是微流体阀，如参考文献4中所述。
该系统还用于探索D 2 O冰在H2O液体中的生长行为，该研究揭示了微观扇形冰表面的新现象27。因此，微流体可用于研究对温度变化反应良好的各种晶体系统。

防冻蛋白 （AFP） 和防冻糖蛋白 （AFGP） 可保护各种适应寒冷的生物免受冻害1.AFP和AFGP（广义为AF（G）Ps）通过不可逆地结合到冰晶表面并抑制由于吉布斯 - 汤姆逊效应2，3，4，5而进一步生长来抑制冰晶的生长。在熔化温度（基本不变）和新降低的冻结温度之间形成的间隙称为热滞后（TH），代表对应于AFP活动6的可测量参数。使用AFPs抑制冰的生长具有深远而多样的应用，在各个领域提供了潜在的增强功能，包括冷冻保存，冷冻食品质量和保护暴露在寒冷的作物。
在小有机分子存在下，水在低温高压下结晶导致包合物水合物（或气体水合物）的形成，其中最丰富的水合物是甲烷水合物7。天然气/石油输油管线中甲烷水合物的结晶可能会导致堵塞，这可能会导致气体点火引起的爆炸8，9，10。目前防止水合物在流水线中结晶的努力包括使用热力学（醇和乙二醇）和动力学（主要是聚合物）抑制剂11，12，13，14。还发现AFP与包合物水合物晶体结合并抑制其生长，这表明AFP的潜在用途是阻止堵塞的形成，从而提供更绿色的解决方案15。
微流体是一种流行的方法，用于研究流经微通道网络16 的微小样品体积（低至 fL）的流体特性。微通道遵循使用光刻技术17在硅晶圆（模具）上创建的图案。制造微流体器件的常用材料是聚二甲基硅氧烷（PDMS），它在研究实验室中价格低廉且相对简单。功能（通道）的设计是根据设备的特定用途组成的;因此，它可用于各种应用，包括DNA传感18，医学诊断19和结晶过程3，20，21。
本协议描述了一种独特的微流体方法，该方法使用各种抑制剂（包括AFP和AFGP）生长微米大小的冰和水合物晶体。在这些实验中，使用四氢呋喃（THF）水合物来模拟甲烷气体水合物22的性质，这需要专门的压力和温度控制设备23。荧光标记的AF（G）Ps用于可视化和分析蛋白质对晶体表面的吸附，并与荧光成像相结合，微流控方法允许获得这些分子与晶体表面结合过程的关键特征。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

水结晶的准确机理描述具有挑战性，需要几个关键要素：出色的温度控制，允许形成单个微观晶体，以及与冷阶段耦合的合适显微镜系统。本文描述的方法增加了另一个重要特征，其包括在冰和包合物水合物晶体周围交换溶液。所描述的系统包括独特和自主开发的仪器的组合，包括微流体、高分辨率冷台和荧光显微镜。冷阶段是为微流体装置设计的，允许在微流体通道内形成微米大小的冰/水合物晶体，并在它们周围交换溶液。冷阶段的温度分辨率和稳定性为一毫开尔文，这对于控制这些小晶体的生长至关重要。这种多样化的系统用于研究冰和水合物结晶的不同过程以及抑制这些晶体生长的机制。该协议描述了如何制备微流体装置，如何在微流体通道中生长和控制微观晶体，以及如何利用冰/水合物晶体周围的液体流动为水的结晶提供新的见解。

与冰晶交换溶液 图3显示了冰晶周围的成功溶液交换。每个快照上的时间戳指示解决方案交换相对较快;但是，交换速度较慢是可能的。交换完成后，可以清楚地观察到来自冰吸附的AFGP分子的荧光强度（图3，右）。使用指定感兴趣区域（ROI）工具监测冰面AFP浓度的定量分析（图4）。在该实验4中，使用在50mM Tris-HCl（pH 7.8）和100mM NaCl中稀释的AFP III型（QAE亚型）。溶液围绕双锥形晶体交换，并监测溶液中和冰上的荧光强度。在溶液交换期间，指示溶液中荧光信号的红色图减少了100倍，而冰表面上的计算信号（绿色图）保持不变。通过从来自冰的信号中减去来自溶液的信号（乘以与微流体通道厚度相关的常数）来获得冰吸附分子的计算信号4.
与THF水合物的溶液交换 THF水合物的微流体实验与冰的实验类似。在允许水合物晶体从溶液中吸附抑制剂分子后，将无抑制剂溶液注入通道中。图5显示了与两种类型的抑制剂进行溶液交换后的THF水合物：用异硫氰酸荧光素（FITC）（图5A）标记的AFGP1-5和沙夫拉宁O（见材料表），后者是荧光染料26（图5B）。这是AFGP与包合物水合物表面结合的首次演示。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> 图1：本研究中使用的微流体通道的示意图。 两种设计都包括两个入口和一个出口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> 图2：温度冷却至~-2°C后在微流体通道中形成的THF水合物。 所呈现的所有晶体的形态都是四面体;然而，有些晶体的方向不同。比例尺 = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> 图 3：一个代表性实验，展示了微流体通道中单个冰晶周围的溶液交换。 最初，溶液含有用FITC标记的AFGP1-5 ，并且未观察到冰吸附的AFGP。将溶液换成不含AFGP的溶液后，可以清楚地检测到先前吸附在冰面上的蛋白质（右图）。比例尺 = 25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> 图4：冰面AFP浓度的定量和定性分析。 （A）高AFP溶液浓度的冰晶（溶液交换前）。（B）将相同的晶体与不含AFP的缓冲溶液交换后。比例尺 = 20 μm。 （C）溶液交换过程中冰表面（黑色）和溶液（红色）荧光强度的定量分析。绿色曲线表示计算出的冰面强度。该图经参考文献4许可改编。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> 图5： 交换微流体通道中的单个THF水合物晶体（A，AFGP1-5）或（B， Safranine O）后。（B）中的图像转载自参考文献26。比例尺 = 25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

本协议描述了微流体装置中微观冰晶和包合物水合物的结晶，使形成的晶体周围的液体交换成为可能。这为检查抑制剂的结晶过程和结合机制提供了无与伦比的可能性。

一种用于研究冰和包合物水合物结晶的微流控方法

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

该协议是独一无二的，因为它允许用户研究，检查和测量可溶性分子与晶体表面之间的相互作用。防冻蛋白与冰的不可逆结合或使用这种方法获得的有力证据。该技术的主要优点是能够控制微米尺寸的冰和水合物晶体的生长，并以受控方式交换它们周围的溶液。首先，将预先准备好的模具放入覆盖有铝箔的玻璃培养皿中。然后通过称取1至10的固化剂和弹性体混合物并连续混合约五分钟，直到混合物呈现白色且几乎不透明，制备30至40毫升PDMS混合物。接下来，将PDMS混合物倒入带有模具的培养皿中，并在干燥器中脱气，直到没有气泡残留。用液体PDMS在烤箱或70摄氏度的热板上烘烤模具，直到获得类似橡胶的稠度。然后用手术刀在特征周围描摹设备，注意用手术刀向前推而不是向下推，因为模具很脆弱。取出切口PDMS装置后，将其倒置放在新的培养皿中。使用钝器，20号针头，根据印记图案在设备上打孔。然后将清洁的PDMS和盖玻片插入等离子清洁剂。关闭阀门并打开电源、真空和泵。让等离子清洁器运行约一分钟。将RF设置为高，并使用精细阀允许一些空气进入等离子清洁器。当观察窗颜色从紫色变为粉红色时，让等离子清洁器工作 50 秒以关闭射频。保持泵打开一分钟，关闭后，逐渐打开主阀，让空气进入等离子清洁器。然后将PDMS表面压在清洁的盖玻片上，并在盖玻片上稍微向上拉时观察到没有脱落，以确认它们已粘合。用一把钳子固定90度钝针的针后，将针的一端插入Tygon管中，另一端插入设备的一个打孔，同时对其他孔重复该过程。在铜冷台表面涂抹少量浸油，然后用不起毛的擦拭将其涂抹，以形成一层薄薄的油。接下来，将干净的蓝宝石圆盘放在创建的油层上。然后将一滴浸油涂在蓝宝石圆盘的中心，并将PDMS器件定位在液滴上，使器件的特征在冷载物台的观察孔上对齐。将设备固定到位后，将管子固定到装有胶带的铝盒的外壁上。使用玻璃注射器，将四至五微升防冻蛋白溶液注入入口通道并关闭冷台的盖子。启动温度控制程序，将温度设置为零下25摄氏度。然后每五秒缓慢升高温度约一摄氏度。接近样品熔点，其范围从零下1到零下0.2摄氏度，具体取决于防冻蛋白溶液中使用的缓冲液。为了更好地观察单晶，请切换到10倍或20倍物镜。并且在所需位置获得单晶后，通过略微降低温度来生长晶体，直到晶体的末端与通道壁相遇。切换到50倍物镜后，将防冻蛋白溶液注入通道并观察荧光强度增加，表明蛋白质溶液已成功注入通道。要记录溶液交换过程，请使用NIS-Elements成像程序，确保施加的压力不会太高，并将缓冲溶液缓慢注入微流体装置的第二个入口。观察荧光信号的减少，其速率取决于施加到注射器的压力。为了在制备摩尔比为1至15的THF水溶液后获得THF水合物，请将溶液注入微流体装置中。THF水溶液冷冻后，缓慢升高温度，直到所有冰在排除水合物的情况下融化，并将温度保持在一摄氏度三分钟。将温度设置为零下两摄氏度，并在没有抑制剂的情况下观察微流体通道中出现的水合物丰度。然后使用玻璃注射器将防冻蛋白或抑制剂注入微流体通道，同时调节温度，以确保获得的晶体不会熔化或生长，并允许抑制剂分子吸附几分钟到晶体表面。通过将无抑制剂溶液注入通道来进行溶液交换。在溶液交换前后拍摄晶体图像，并使用成像程序分析晶体和溶液中的荧光强度。在冰晶周围进行了成功的溶液交换，表明溶液交换相对较快。但是，交换速度较慢是可能的。交换完成后，清楚地观察到来自冰吸附的防冻糖蛋白分子的荧光强度。监测防冻蛋白浓度的定量分析，测定溶液和冰上的荧光强度，表明溶液中的荧光信号在溶液交换过程中降低了100倍，而计算出的冰表面信号保持不变。使用THF水合物进行微流体实验，在允许水合物晶体吸附抑制剂分子后，将无抑制剂溶液注入通道中。在与两种类型的抑制剂进行溶液交换后观察到THF水合物，包括用异硫氰酸荧光素标记的防冻糖蛋白和荧光染料Safranin O。该过程的关键步骤是在微流体通道中形成和分离单晶以及在其周围交换溶液。该方法可以与其他对温度高度敏感的晶体材料一起使用，以了解抑制剂与这些晶体相互作用的机制。围绕晶体交换溶液的能力为研究人员确定防冻蛋白结合机制的关键见解铺平了道路，并发现了同位素对冰生长的影响的新现象。

Research

JoVE Journal

Chemistry

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