Name: a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization at JoVE.com

Anerkendelse gives til donorerne fra American Chemical Society Petroleum Research Fund til støtte for denne forskning (bevillingsnummer 60191-UNI5). Forfatterne vil gerne takke prof. Ido Braslavsky for banebrydende brugen af mikrofluidiske enheder til at studere frostvæskeproteiner og is. Forfatterne er taknemmelige for prof. Arthur DeVries, prof. Konrad Meister og prof. Peter Davies for at levere frostvæskeproteinprøver.

1. Fremstilling af mikrofluidisk enhed
<ol><li>Dæk indersiden af en petriskål med aluminiumsfolie, og læg den forberedte form i petriskålen.<ol><li>Fabriker formene ved hjælp af litografiteknikkerne beskrevet i referencer. De to enhedsdesign, der anvendes i det foreliggende værk, er afbildet i figur 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Der fremstilles 30-40 ml PDMS-blandingen ved at veje en blanding på 1:10 (efter vægt) af hærdningsmidlet og elastomeren (se Materialetabel) og blandes kontinuerligt i ca. 5 minutter, indtil blandingen fremstår hvid og næsten uigennemsigtig. BEMÆRK: Placer en plastikkop på vægten, hæld elastomeren i koppen, og tilsæt derefter hærdningsmidlet for at opnå et vægtforhold på 1:10.</li>
	<li>Hæld PDMS-blandingen i petriskålen med formen og afgasning i en tørremaskine, indtil der ikke er bobler tilbage (ca. 30 min).</li>
	<li>Bag formen med det flydende PDMS i en ovn eller på en kogeplade ved 70 °C, indtil der opnås en gummilignende konsistens. Denne proces tager cirka en time.</li>
	<li>Skær enheden ud ved at spore rundt om funktionerne med en skalpel, og sørg for at skubbe fremad med skalpellen i stedet for ned, da formen er skrøbelig. Fjern den udskårne PDMS-enhed, og placer den på hovedet i en ny petriskål. Fjern støv og snavspartikler fra bundoverfladen ved at fastgøre og fjerne et stykke tape (se Materialetabel).</li>
	<li>Brug en stump sprøjtenål (20 G) til at udstanse huller i enheden baseret på det påtrykte mønster, om nødvendigt ved hjælp af et mikroskop. Sørg for, at hullet trænger gennem den anden side af enheden, og brug pincet til at fjerne de udstansede stykker.</li>
	<li>Vask grundigt en dæksel (18 x 18 mm, 0,14 mm tyk) med vand og sæbe og derefter med isopropanol. Brug lufttrykket til at tørre den rensede dæksel.</li>
	<li>Indsæt det rensede PDMS og dæksel i plasmarenseren, luk ventilerne, og tænd for strømmen, støvsugeren og pumpen. Lad plasmarenseren køre i ca. et minut, indstil RF til HI, og lad noget luft komme ind i plasmarenseren ved hjælp af den fine ventil.<ol><li>Når vinduets farve skifter fra lilla til lyserød, skal du lade plasmarenseren arbejde i 50 s og slukke for RF. Hold pumpen tændt i et minut, og efter at have slukket den, skal du gradvist åbne hovedventilen for at lade luft komme ind i plasmarenseren. BEMÆRK: En alternativ metode til at opnå sammenlignelige resultater er varmebinding. Til denne metode skal du lægge formen på dækslet og placere den på en kogeplade, der er indstillet til 70-80 °C i ca. 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Tryk PDMS-overfladen på den rensede dækslip, og bekræft, at de er bundet ved ikke at observere nogen løsrivelse, når du trækker lidt op på dækslippet.</li>
	<li>Fastgør kanylen på en 90° stump kanyle (18 G) med en tang, og træk plastsprøjtestikket af for at fjerne det. Indsæt den ene ende af nålen i et Tygon-rør (0,020 " ID, 0,060 " OD, se Materialetabel) og den anden ende i et af enhedens udstansede huller. Gentag processen for de andre huller.</li>
	<li>For at fjerne luftbobler skal du injicere vand / buffer i kanalerne med en glassprøjte (en pumpe er valgfri, men der blev ikke brugt nogen pumpe her). Filtrer alle væsker med et filter på 0,22 μm, før de injiceres i enheden.</li>
	<li>Brug et blokeringsmiddel, såsom en 1% BSA-opløsning for at forhindre binding af fluorescensmærkede AFP'er på PDMS-væggene. Injicer blokeringsmidlet i indløbskanalen, og lad det forblive i mikrokanalerne i 20 minutter. Derefter injiceres bufferopløsningen i indløbskanalen for at skylle BSA-opløsningen ud. BEMÆRK: Den resulterende PDMS-enhed er fastgjort til en dæksel langs dens bundflade, forbundet med slanger i dens indløbs- og udløbshuller og belagt med et blokeringsmiddel i dets kanaler.</li>
</ol>2. Opsætning af den mikrofluidiske enhed
<ol><li>Påfør en lille mængde nedsænkningsolie på overfladen af kobberkuldetrinnet (se Materialetabel) og spred det ved hjælp af en fnugfri klud for at skabe et tyndt lag olie. Placer derefter en ren safirskive (se Materialetabel) på det oprettede olielag. Påfør en dråbe nedsænkningsolie på midten af safirskiven, og placer PDMS-enheden på dråben, således at enhedens funktioner er justeret over synshullet i det kolde trin.</li>
	<li>Hold enheden på plads, og fastgør slangen til ydervæggene i aluminiumsboksen, der huser den kolde scene, ved hjælp af tape. Noter placeringen af hvert specifikt rør.</li>
	<li>Brug en glassprøjte til at injicere 4-5 μL AF(G)P-opløsning (se Materialetabel) i indløbskanalen. Luk låget på den kolde fase. BEMÆRK: Koncentrationen af AFP-opløsningerne kan varieres og bestemmes ud fra deres fluorescensintensitet. I den nuværende protokol var koncentrationsintervallet 5-40 μL.</li>
</ol>3. Dannelse af enkeltkrystaller i de mikrofluidiske kanaler
<ol><li>Rens det kolde trin med tør luft / nitrogen for at forhindre, at der dannes kondens inde i det. Aktiver et cirkulerende kølebad for at cirkulere vand gennem det kolde trin og tjene som kølelegeme.</li>
	<li>Start temperaturreguleringsprogrammet, og indstil temperaturen til -25 °C. BEMÆRK: Frysning vil forekomme, når prøven når en temperatur på ~-20 °C, hvilket kan observeres som en pludselig mørkfarvning og ruhed af prøven. Ethvert mål kan bruges på dette tidspunkt, helst 4x-målet, som gør det muligt for brugeren at observere hele mikrofluidkanalerne.</li>
	<li>Langsomt, idet temperaturen øges med ca. 1 °C/5 s, nærmer den sig prøvens smeltepunkt, som kan variere fra -1 til -0,2 °C afhængigt af bufferen, der anvendes i AF(G)P-opløsningen. Når temperaturen nærmer sig smeltepunktet, skal du vente, indtil et par enkeltkrystaller er isoleret. BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan uønsket is smeltes lokalt ved hjælp af en IR-laser (980 nm) (se Materialetabel), som er fastgjort på mikroskopet. Laseren smelter nærliggende iskrystaller, så længe den er tændt.</li>
	<li>På dette tidspunkt anbefales det at skifte til 10x eller 20x mål for bedre at observere enkeltkrystaller. Efter opnåelse af en enkelt krystal på det ønskede sted vokser krystallen ved let at sænke temperaturen (med ~ 0,01 ° C), indtil krystalens kanter møder kanalvæggene.</li>
	<li>Skift til 50x-målet, injicer AF(G)P-opløsningen i kanalerne, og observer fluorescensintensitetsforøgelsen, hvilket indikerer, at proteinopløsningen blev injiceret i kanalerne. Udfør dette trin omhyggeligt for at undgå smeltning af iskrystallen under udveksling af opløsninger. Overvåg og juster både strømningshastigheden (ved at lægge mere/mindre tryk på glassprøjten) og temperaturen under opløsningsudskiftningsprocessen.</li>
	<li>Lad proteinerne have tid nok til at samle sig og binde sig til krystaloverfladen. BEMÆRK: Dette varierer afhængigt af akkumulerings- og adsorptionshastighederne for AF(G)P 5,25. I et typisk eksperiment er 5-10 min tilladt til AFP-akkumulering</li>
</ol>4. Måling af termisk hysterese (TH)
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit.
<ol><li>Krystallens smeltepunkt bestemmes ved at justere temperaturen med små trin på 0,002 °C og observere den højeste temperatur, som en lille krystal kan udsættes for, uden at den smelter.</li>
	<li>På temperaturregulatorens RAMP-funktion skal du indstille kølehastigheden til -0,05 til -0,01 °C/4 s og aktivere RAMP. Bemærk den nøjagtige temperatur, hvor pludselig krystalvækst opstår. BEMÆRK: Denne værdi kaldes bursttemperaturen og svarer til frysetemperaturen. Forskellen mellem smelte- og frysetemperaturerne er TH-aktiviteten25.</li>
</ol>5. Opløsningsudveksling omkring enkeltkrystaller
<ol><li>Sørg for, at prøvetemperaturen er i TH-hullet for at forhindre smeltning eller vækst af krystallen under eksperimentet.</li>
	<li>Optag løsningsudvekslingsprocessen ved hjælp af NIS Elements-billeddannelsesprogrammet (se Materialetabel) til senere fluorescensdataanalyse. Injicer langsomt bufferopløsningen i det andet indløb af den mikrofluidiske enhed, og observer et fald i fluorescerende signal med en hastighed, der afhænger af trykket på sprøjten.<ol><li>Brug denne visuelle repræsentation til at sikre, at det påførte tryk ikke er for højt for ikke at få krystallen til at smelte. Se figur 2 for en sekvens af billeder, der viser løsningsudvekslingsprocessen.</li>
	</ol></li>
	<li>Mål fluorescensintensiteten i den mikrofluidiske kanal ved hjælp af billeddannelsesprogrammet. BEMÆRK: Signalet skal toppe i området nær krystallens overflade, hvilket indikerer AFP-binding, og skal være relativt lavt i den omgivende opløsning, som er skyllet med buffer.</li>
	<li>Mål TH-aktiviteten efter løsningsudvekslingen efter trin 4.</li>
	<li>Eksperimentet gentages ved at isolere en ny krystal (trin 3.3-3.5). AFP-opløsningen injiceres med en glassprøjte, og opløsningsudvekslingen gentages (trin 5.1-5.3). Der opnås en ny enkeltkrystal (trin 3.3-3.5), og AFP-opløsningen ledes ind i kanalerne ved hjælp af glassprøjten.</li>
</ol>6. Eksperimenter med clathrathydrathydrater
<ol><li>For at opnå THF-hydrater fremstilles en THF/vand-opløsning med et molært forhold på 1:15, hvilket er et volumenforhold på 1:3,326. Dette forhold opretholdes i alle opløsninger, der anvendes i følgende forsøg, herunder dem, der indeholder AF(G)Ps eller andre hæmmere.</li>
	<li>Følg trin 1 og 2 for at forberede den mikrofluidiske enhed og placere den i det kolde stadium. Indstil temperaturen til -25 °C; prøven fryser ved ~-20 °C som beskrevet i trin 3.2.</li>
	<li>Når THF-opløsningen er frosset, øges temperaturen langsomt, indtil al isen er smeltet. BEMÆRK: Isens smeltepunkt er lidt trykket ned af THF.</li>
	<li>For at sikre, at alle iskrystaller smeltede ved udelukkelse af hydraterne, skal temperaturen holdes ved 1 °C i 3 min.</li>
	<li>Indstil temperaturen til -2 ° C og observer overflod af hydrater, der forekommer i de mikrofluidiske kanaler i fravær af hæmmere. BEMÆRK: THF-hydrater er formet som oktaeder (figur 2), og i nogle tilfælde er krystallerne meget tynde; Således kan klar observation være udfordrende. I disse tilfælde anbefales det at gentage trin 6.4-6.5 for at opnå nye krystaller.</li>
	<li>AF(G)P/hæmmeren injiceres i den mikrofluide kanal ved hjælp af glassprøjten, mens temperaturen justeres for at sikre, at de opnåede krystaller ikke smelter/vokser. Tillad et par minutter for inhibitormolekylerne at adsorbere til krystaloverfladen.</li>
	<li>Hvis det er nødvendigt, skal du måle TH-aktiviteten efter trin 4.</li>
	<li>Opløsningen ombyttes omkring krystallerne som beskrevet i trin 5.2-5.3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-Binding+Proteins+and+Their+Function.">Ice-Binding Proteins and Their Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).</li><li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+are+antifreeze+proteins+in+solution+essential+for+ice+growth+inhibition.">When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition.</a> Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).</li><li>Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+glycoproteins+bind+irreversibly+to+ice.">Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).</li><li>Braslavsky, I., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LabVIEW-operated+Novel+Nanoliter+Osmometer+for+Ice+Binding+Protein+Investigations.">LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).</li><li>Ruppel, C. D., Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+climate+change+and+methane+hydrates.">The interaction of climate change and methane hydrates.</a> Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).</li><li>Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alcohols+and+diols+on+PVCap-induced+hydrate+crystal+growth+patterns+in+methane+systems.">Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems.</a> Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).</li><li>Sa, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+methane+and+natural+gas+hydrate+formation+by+altering+the+structure+of+water+with+amino+acids.">Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids.</a> Scientific Reports. 6, 31582 (2016).</li><li>Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+kinetic+inhibitors+for+natural+gas+hydrates.">Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates.</a> Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).</li><li>Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Inhibition+of+Gas+Hydrates+by+&#945;-Helical+Antifreeze+Proteins.">Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by &#945;-Helical Antifreeze Proteins.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antifreeze+proteins+on+the+nucleation,+growth,+and+the+memory+effect+during+tetrahydrofuran+clathrate+hydrate+formation.">Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tetrahydrofuran+clathrate-hydrate+formation+with+antifreeze+protein.">The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein.</a> Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).</li><li>Walker, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+as+gas+hydrate+inhibitors.">Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors.</a> Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).</li><li>Gordienko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+green+hydrate+inhibitor:+imaging+antifreeze+proteins+on+clathrates.">Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates.</a> PloS One. 5 (2), 8953 (2010).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+generation+using+a+polydimethylsiloxane+(PDMS)+co-axial+flow+focus+device.">Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).</li><li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing:+An+overview.">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview.</a> Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).</li><li>Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+diagnostic+microfluidics.">Advances in diagnostic microfluidics.</a> Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).</li><li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography.">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).</li><li>Haleva, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cold-finger+device+for+the+investigation+of+ice-binding+proteins.">Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins.</a> Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).</li><li>Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THF+hydrates+as+model+systems+for+natural+gas+hydrates:+Comparing+their+mechanical+and+vibrational+properties.">THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties.</a> Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).</li><li>Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+crystallization+kinetics+of+methane+(sI)+hydrate+in+a+thermoelectrically-cooled+microreactor.">Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+that+accumulate+on+different+ice+crystal+planes+produce+distinct+thermal+hysteresis+dynamics.">Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).</li><li>Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption-inhibition+of+clathrate+hydrates+by+self-assembled+nanostructures.">Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures.</a> ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).</li><li>Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v., Ward, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+unsteady+morphologies+at+ice+interfaces+driven+by+D2O-H2O+exchange.">Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).</li><li>Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+growth+acceleration+by+antifreeze+proteins+leads+to+higher+thermal+hysteresis+activity.">Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity.</a> Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).</li></ol>

Den nuværende protokol blev designet til at udnytte kombinationen af mikrofluidisk strømning med mikroskopiske krystaller for at afsløre ny indsigt i krystalvækst og dens hæmning. Et millikelvinopløsnings temperaturstyret koldt trin27 muliggør kontrol af enkeltmikroskopiske krystaller placeret inde i mikrofluidiske kanaler, hvilket muliggør udveksling af opløsninger omkring dem. Mens fremstillingen af mikrofluidiske enheder er standard og ligner almindelig praksis17,18, er kontrollen over vækst og smeltning af krystaller inde i enheden unik og ny. Den mest kritiske komponent i dette system er den fremragende temperaturregulering, som opnås ved hjælp af Peltier termoelektriske kølere, feedback fra en termistor, der er placeret tæt på prøven, og en temperaturregulator med høj opløsning, der styrer feedback-sløjfen.
Et andet kritisk trin er selve opløsningsudvekslingen, da krystallerne kan smelte eller vokse under denne proces; Temperaturen skal således justeres under opløsningsudvekslingen for at forhindre vækst/smeltning. Dannelsen af krystaller i mikrofluidiske kanaler forstyrrer væskestrømmen og udgør den største udfordring i dette system; Således skal væksten af disse krystaller kontrolleres. Her blev en IR-laser (980 nm) monteret på det omvendte mikroskop og blev brugt til lokalt at smelte uønskede is/hydratkrystaller28. Hvis en sådan laser ikke kan bruges, kan de metalliske stik på den mikrofluidiske enhed opvarmes af en ekstra Peltier termoelektrisk køler, som smelter isen i enhedens indløb / udløb.
Den her beskrevne metode omfatter hjemmeudviklede instrumenter (kold fase) og kræver træning, da nogle af de ovennævnte trin er udfordrende. Da koncentrationen af opløsningen omkring krystallerne kan ændre sig, selv når strømmen ikke er beregnet, kan et simpelt kalibreringstrin5 give et pålideligt skøn over koncentrationen baseret på fluorescenssignalet. En anden mulig løsning på uønsket flow (f.eks. under TH-målinger) er mikrofluidiske ventiler, som er beskrevet i reference4.
Dette system blev også brugt til at undersøge vækstadfærden af D2O-is iH2O-væske, en undersøgelse, der afslørede et nyt fænomen med mikroskopiske, kammuslede isoverflader27. Således kan mikrofluidik anvendes i undersøgelsen af forskellige krystallinske systemer, der reagerer godt på temperaturændringer.

Frostvæskeproteiner (AFP'er) og frostvæskeglycoproteiner (AFGP'er) beskytter forskellige kuldetilpassede organismer mod frostskader1. AFP'er og AFGP'er (generaliseret som AF(G)Ps) hæmmer væksten af iskrystaller ved at binde irreversibelt til deres overflader og hæmme yderligere vækst på grund af Gibbs-Thomson-effekten 2,3,4,5. Det resulterende mellemrum, der dannes mellem smeltetemperaturen, som stort set er uændret, og den nyligt deprimerede frysetemperatur kaldes termisk hysterese (TH) og repræsenterer en målbar parameter svarende til AFP-aktivitet6. Brugen af AFP'er til at hæmme isvækst har vidtrækkende og forskellige anvendelser, der tilbyder potentiel forbedring på forskellige områder, herunder kryopræservering, frossen fødevarekvalitet og beskyttelse af koldt udsatte afgrøder.
Krystalliseringen af vand ved lave temperaturer og høje tryk i nærværelse af små organiske molekyler resulterer i dannelsen af clathrathydrathydrater (eller gashydrater), hvor det mest rigelige hydrat er metanhydrat7. Krystalliseringen af metanhydrater i gas/olie flowlines kan forårsage propper, som kan forårsage eksplosioner på grund af gasantændelse 8,9,10. Nuværende bestræbelser på at forhindre hydratkrystallisation i flowlinjer omfatter anvendelse af termodynamiske (alkoholer og glycoler) og kinetiske (hovedsageligt polymerer) hæmmere11,12,13,14. AFP'er har også vist sig at binde for at klatrathydrere krystaller og hæmme deres vækst, hvilket peger på den potentielle anvendelse af AFP'er til at forhindre dannelsen af propper og derved give en grønnere opløsning15.
Microfluidics er en udbredt metode, der bruges til at studere egenskaberne af væsker ved små prøvevolumener (ned til fL), der strømmer gennem et netværk af mikrokanaler16. Mikrokanalerne følger et mønster skabt på en siliciumskive (formen) ved hjælp af litografi17. Et almindeligt anvendt materiale til fremstilling af mikrofluidiske enheder er polydimethylsiloxan (PDMS), som er billigt og relativt enkelt at arbejde med i forskningslaboratorier. Designet af funktionerne (kanalerne) er sammensat med hensyn til enhedens specifikke formål; det kan således bruges til en række forskellige applikationer, herunder DNA-sensing18, medicinsk diagnose19 og krystalliseringsprocesser 3,20,21.
Den nuværende protokol beskriver en unik mikrofluidisk metode til dyrkning af is i mikronstørrelse og hydratkrystaller med forskellige hæmmere, herunder AFP'er og AFGP'er. Til disse eksperimenter blev Tetrahydrofuran (THF) hydrater brugt til at efterligne egenskaberne af metangasshydrater22, som kræver specialudstyr til tryk- og temperaturkontrol23. Fluorescerende mærket AF (G) Ps blev brugt til at visualisere og analysere adsorptionen af proteinerne til krystaloverfladen, og kombineret med fluorescerende billeddannelse tillod den mikrofluidiske tilgang opnåelse af nøglefunktioner i bindingsprocessen af disse molekyler til krystaloverflader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

En nøjagtig mekanistisk beskrivelse af vandkrystallisation er udfordrende og kræver et par nøgleelementer: fremragende temperaturkontrol for at muliggøre dannelse af enkeltmikroskopiske krystaller og et passende mikroskopisystem koblet til det kolde stadium. Metoden, der er beskrevet heri, tilføjer en anden vigtig funktion, der inkluderer udveksling af opløsninger omkring is og clathrathydratkrystaller. Det beskrevne system består af en kombination af unikke og hjemmeudviklede instrumenter, herunder mikrofluidik, kolde stadier med høj opløsning og fluorescensmikroskopi. Det kolde stadium blev designet til mikrofluidiske enheder og giver mulighed for dannelse af is / hydratkrystaller i mikronstørrelse inde i mikrofluidiske kanaler og udveksling af opløsninger omkring dem. Temperaturopløsningen og stabiliteten af det kolde stadium er en millikelvin, hvilket er afgørende for at kontrollere væksten af disse små krystaller. Dette forskelligartede system bruges til at studere de forskellige processer af is og hydratkrystallisation og den mekanisme, hvormed væksten af disse krystaller hæmmes. Protokollen beskriver, hvordan man forbereder mikrofluidiske enheder, hvordan man dyrker og styrer mikroskopiske krystaller i de mikrofluidiske kanaler, og hvordan udnyttelsen af strømmen af væsker omkring is / hydratkrystaller giver ny indsigt i krystalliseringen af vand.

Opløsningsudveksling med iskrystaller En vellykket løsningsudveksling omkring en iskrystal er vist i figur 3. Tidsstemplet på hvert øjebliksbillede angiver, at løsningsudvekslingen var relativt hurtig; en langsommere udveksling er dog mulig. Fluorescensintensiteten fra de isadsorberede AFGP-molekyler observeres tydeligt, når udvekslingen er afsluttet (figur 3, til højre). En kvantitativ analyse af AFP-koncentrationen på isoverfladen overvåges ved hjælp af et udpeget interesseområde (ROI) værktøj (figur 4). Idette forsøg 4 blev AFP type III (QAE isoform) fortyndet i 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) og 100 mM NaCl anvendt. Opløsningen udveksles omkring en bipyramidalformet krystal, og fluorescensintensiteten i opløsningen og på isen overvåges. Det røde plot, der angiver fluorescenssignalet i opløsningen, reduceres med en faktor 100 under opløsningsudvekslingen, mens det beregnede signal (grønt plot) på isoverfladen forbliver konstant. Det beregnede signal for de isadsorberede molekyler blev opnået ved at trække signalet fra opløsningen (multipliceret med en konstant, der vedrører tykkelsen af den mikrofluidiske kanal) fra signalet fra isen4.
Opløsningsudveksling med THF-hydrater Mikrofluidiske eksperimenter med THF-hydrater blev udført på samme måde som eksperimenterne med is. Efter at hydratkrystallerne fik lov til at adsorbere hæmmermolekylerne fra opløsningen, blev en inhibitorfri opløsning injiceret i kanalerne. Figur 5 viser THF-hydrater efter opløsningsudveksling med to typer hæmmere: AFGP1-5 mærket med fluoresceinisothiocyanat (FITC) (figur 5A) og safranin O (se materialetabel), som er et fluorescensfarvestof26 (figur 5B). Dette er den første demonstartion af en AFGP-binding til overfladen af et clathrathydrat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> Figur 1: En skematisk repræsentation af de mikrofluidiske kanaler, der anvendes i denne undersøgelse. Begge designs inkluderer to indløb og en stikkontakt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> Figur 2: THF-hydrater dannet i den mikrofluidiske kanal, efter at temperaturen var afkølet til ~-2 °C. Morfologien af alle krystaller præsenteret er en tetrahedron; nogle krystaller er dog orienteret forskelligt. Skala bar = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> Figur 3: Et repræsentativt eksperiment, der udviser opløsningsudveksling omkring en enkelt iskrystal i en mikrofluidisk kanal. Oprindeligt indeholdt opløsningen AFGP1-5 mærket med FITC, og isadsorberede AFGP'er blev ikke observeret. Efter at opløsningen blev udvekslet med en AFGP-fri opløsning, blev de proteiner, der tidligere var blevet adsorberet til isoverfladen, tydeligt detekteret (billede til højre). Skala bar = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> Figur 4: En kvantitativ og kvalitativ analyse af AFP-koncentrationen på isoverfladen. (A) En iskrystal ved høj koncentration af AFP-opløsning (før opløsningsudveksling). (B) Den samme krystal, efter at AFP-opløsningen blev udvekslet med en AFP-fri bufferopløsning. Skalabar = 20 μm. (C) Kvantitativ analyse af fluorescensintensiteten på isoverfladen (sort) og i opløsningen (rød) under en opløsningsudveksling. Den grønne kurve repræsenterer den beregnede intensitet på isoverfladen. Figuren er tilpasset med tilladelse fra reference4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> Figur 5: Enkelt THF-hydratkrystaller i mikrofluidiske kanaler, efter at opløsningen omkring dem (A, AFGP1-5) eller (B,  Safranine O) blev udvekslet. Billedet i (B) er gengivet fra reference26. Skala bar = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization at JoVE.com

A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

Den nuværende protokol beskriver krystalliseringen af mikroskopiske iskrystaller og clathrathydrathydrater i mikrofluidiske enheder, hvilket muliggør væskeudveksling omkring de dannede krystaller. Dette giver uovertrufne muligheder for at undersøge krystalliseringsprocessen og bindingsmekanismerne for hæmmerne.

En mikrofluidisk tilgang til undersøgelse af is- og clatrathydratkrystallisation

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Denne protokol er unik, fordi den giver brugeren mulighed for at studere og undersøge og måle interaktionen mellem opløselige molekyler og krystaloverflader. Stærke beviser for irreversibel binding af frostvæskeproteiner til is eller opnået ved anvendelse af denne metode. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at kontrollere væksten af mikronstørrelse is og hydrere krystaller og udveksle opløsningen omkring dem på en kontrolleret måde.Til at begynde med skal du placere den forberedte form i et glas petriskål dækket med aluminiumsfolie. Forbered derefter 30 til 40 ml af PDMS-blandingen ved at veje en 1 til 10 blanding af hærdningsmidlet og elastomeren og blandes kontinuerligt i ca. fem minutter, indtil blandingen fremstår hvid og næsten uigennemsigtig. Hæld derefter PDMS-blandingen i petriskålen med formen og afgass i en tørremiddel, indtil der ikke er bobler tilbage.Bag formen med det flydende PDMS i en ovn eller på en kogeplade ved 70 grader Celsius, indtil der opnås en gummilignende konsistens. Skær derefter enheden ud ved at spore rundt om funktionerne med en skalpel, og sørg for at skubbe fremad med skalpellen i stedet for ned, da formen er skrøbelig. Når du har fjernet den udskårne PDMS-enhed, skal du placere den på hovedet i en ny petriskål.Brug en stump sprøjte, 20 gauge nål, til at slå huller i enheden ud baseret på det påtrykte mønster. Indsæt derefter det rensede PDMS og dækslip i plasmarenseren. Luk ventilerne, og tænd for strømmen, vakuumet og pumpen.Lad plasmarenseren køre i cirka et minut. Indstil RF til høj, og lad noget luft komme ind i plasmarenseren ved hjælp af den fine ventil. Når vinduesfarven skifter fra lilla til lyserød, skal du lade plasmarenseren arbejde i 50 sekunder for at slukke for RF.Hold pumpen tændt i et minut, og efter at have slukket den, skal du gradvist åbne hovedventilen for at lade luft komme ind i plasmarenseren. Tryk derefter PDMS-overfladen på den rensede dækslip, og bekræft, at de er bundet ved ikke at observere nogen løsrivelse, når du trækker lidt op på dækslip. Efter at have fastgjort nålen på en 90 graders stump nål med en tang, skal du indsætte den ene ende af nålen i et Tygon-rør og den anden ende i et af de udstansede huller på enheden, mens du gentager processen for de andre huller.Påfør en lille mængde nedsænkningsolie på overfladen af kobberkuldetrinnet og spred det ved hjælp af en fnugfri klud for at skabe et tyndt lag olie. Placer derefter ren safirskive på det oprettede olielag. Påfør derefter en dråbe nedsænkningsolie på midten af safirskiven, og placer PDMS-enheden på dråben, således at enhedens funktioner er justeret over synshullet i det kolde trin.Når du har holdt enheden på plads, skal du fastgøre slangen til ydervæggene i aluminiumsboksen, der huser tapet. Brug en glassprøjte til at injicere fire til fem mikroliter frostvæskeproteinopløsning i indløbskanalen og luk låget på det kolde trin. Start temperaturreguleringsprogrammet, og indstil temperaturen til minus 25 grader Celsius.Derefter øges temperaturen langsomt med ca. en grad Celsius pr. Fem sekunder. Gå til prøvernes smeltepunkt, som kan variere fra minus 1 til minus 0,2 grader Celsius, afhængigt af bufferen, der anvendes i frostvæskeproteinopløsningen. For bedre at observere enkeltkrystaller skal du skifte til 10x eller 20x mål.Og efter at have opnået en enkelt krystal på det ønskede sted, vokser krystallen ved let at sænke temperaturen, indtil enderne af krystallen møder kanalvæggene. Efter at have skiftet til 50x-målet, injiceres frostvæskeproteinopløsningen i kanalerne og observerer fluorescensintensitetsforøgelsen, hvilket indikerer, at proteinopløsningen blev injiceret med succes i kanalerne. For at registrere opløsningsudvekslingsprocessen skal du bruge NIS-Elements Imaging Program, der sikrer, at det påførte tryk ikke er for højt, og injicerer langsomt bufferopløsningen i det andet indløb i den mikrofluidiske enhed.Overhold et fald i fluorescerende signal med en hastighed, der afhænger af trykket på sprøjten. For at opnå THF-hydrater efter fremstilling af en THF-vandopløsning med et molært forhold på 1 til 15, injiceres opløsningen i den mikrofluidiske enhed. Når THF-vandopløsningen er frosset, skal du langsomt øge temperaturen, indtil al isen er smeltet ved udelukkelse af hydraterne, og holde temperaturen på en grad Celsius i tre minutter.Indstil temperaturen til minus to grader Celsius og observer overflod af hydrater, der forekommer i de mikrofluidiske kanaler i fravær af hæmmere. Injicer derefter frostvæskeproteinet eller -hæmmeren i den mikrofluidiske kanal ved hjælp af glassprøjten, mens temperaturen justeres for at sikre, at de opnåede krystaller ikke smelter eller vokser, og det giver et par minutter for hæmmermolekylerne at adsorbere til krystaloverfladen. Opløsningsudvekslingen udføres ved at injicere den inhibitorfrie opløsning i kanalen.Tag billeder af krystallen før og efter opløsningsudvekslingen, og analyser fluorescensintensiteten på krystallen og i opløsningen ved hjælp af billeddannelsesprogrammet. En vellykket løsningsudveksling omkring en iskrystal blev udført, hvilket indikerer, at opløsningsudvekslingen var relativt hurtig. En langsommere udveksling er dog mulig.Fluorescensintensiteten fra de isadsorberede frostvæskeglycoproteinmolekyler blev tydeligt observeret, efter at udvekslingen var afsluttet. En kvantitativ analyse af koncentrationen af frostvæskeproteiner blev overvåget, og fluorescensintensiteten blev bestemt i opløsningen og på isen, hvilket indikerer, at fluorescenssignalet i opløsningen reduceres med en faktor 100 under opløsningsudvekslingen, mens det beregnede signal på isoverfladen forbliver konstant. Mikrofluidiske eksperimenter med THF-hydrater blev udført, hvor en hæmmerfri opløsning blev injiceret i kanalerne, efter at hydratkrystallerne fik lov til at adsorbere hæmmermolekylerne.THF-hydraterne blev observeret efter opløsningsudveksling med to typer hæmmere, herunder frostvæskeglycoproteiner mærket med fluoresceinisothiocyanat og Safranin O, et fluorescerende farvestof. De kritiske trin i denne procedure er dannelsen og isoleringen af en enkelt krystal i de mikrofluidiske kanaler og udvekslingen af opløsning omkring den. Denne metode kan bruges med andre krystalmaterialer, der er meget temperaturfølsomme, i et forsøg på at forstå den mekanisme, hvormed hæmmere interagerer med disse krystaller.Evnen til at udveksle løsninger omkring krystaller banede vejen for forskere til at identificere nøgleindsigt i bindingsmekanismen for frostvæskeproteiner og opdage et nyt fænomen med isotopeffekt på isvækst.

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW betjent Novel nanoliter Osmometer for Ice bindingsprotein Undersøgelser

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Kovalent binding af BMP-2 på overflader med en selv-samlet monolag Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestemmelse af isbindende fly af frostvæskeproteiner ved fluorescens-baserede Ice Plane Affinitet

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

En omvendt analyse tilgang til karakterisering af kemiske Transport i Maling

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycan Node Analyse: en bottom-up tilgang til Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Mikrofluide Pneumatiske Bure: en ny tilgang til In-chip Crystal fældefangst, Manipulation og kontrollerede kemiske behandling

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Sulfat Separation ved selektiv krystallisation med en Bis-iminoguanidinium ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Mikrofluid tør-spinning og karakterisering af folier silke Fibroin fibre

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrofluid Chips for In Situ Crystal røntgen diffraktion og In Situ dynamisk lysspredning for serielle krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Synteser, krystallisering og spektroskopiske karakterisering af 3,5-Lutidine N-oxid dehydrere

The synthesis of 3,5-lutidine N-oxide dehydrate, 1, was achieved in the synthesis route of 2-amino-pyridine-3,5-dicarboxylic acid. Ochiai first used the ...