Name: a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization at JoVE.com

Erkenning wordt gedaan aan de donoren van het American Chemical Society Petroleum Research Fund voor ondersteuning van dit onderzoek (subsidienummer 60191-UNI5). De auteurs willen prof. Ido Braslavsky bedanken voor het pionieren in het gebruik van microfluïdische apparaten om antivrieseiwitten en ijs te bestuderen. De auteurs zijn Prof. Arthur DeVries, Prof. Konrad Meister en Prof. Peter Davies dankbaar voor het verstrekken van antivries eiwitmonsters.

1. Fabricage van microfluïdische apparaten
<ol><li>Bedek het binnenoppervlak van een petrischaal met aluminiumfolie en plaats de vooraf bereide vorm in de petrischaal.<ol><li>Fabriceer de mallen met behulp van de lithografietechnieken die in referenties worden beschreven. De twee apparaatontwerpen die in het huidige werk worden gebruikt, zijn afgebeeld in figuur 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid 30-40 ml van het PDMS-mengsel door een mengsel van 1:10 (in gewicht) van het uithardingsmiddel en het elastomeer te wegen (zie materiaaltabel) en gedurende ongeveer 5 minuten continu te mengen totdat het mengsel wit en bijna ondoorzichtig lijkt. OPMERKING: Plaats een plastic beker op de weegschaal, giet het elastomeer in de beker en voeg vervolgens het uithardingsmiddel toe om een gewichtsverhouding van 1:10 te bereiken.</li>
	<li>Giet het PDMS-mengsel met de vorm in de petrischaal en ontgas in een exsiccator totdat er geen bubbels achterblijven (ongeveer 30 min).</li>
	<li>Bak de mal met de vloeibare PDMS in een oven of op een hete plaat op 70 °C tot een rubberachtige consistentie is verkregen. Dit proces duurt ongeveer een uur.</li>
	<li>Knip het apparaat uit door de kenmerken met een scalpel te traceren en zorg ervoor dat je met het scalpel naar voren duwt in plaats van naar beneden, omdat de mal kwetsbaar is. Verwijder het uitgesneden PDMS-apparaat en plaats het ondersteboven in een nieuwe petrischaal. Verwijder stof- en vuildeeltjes van het bodemoppervlak door een stuk plakband te bevestigen en te verwijderen (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Gebruik een stompe spuitnaald (20 G) om gaten in het apparaat te ponsen op basis van het bedrukte patroon, indien nodig met behulp van een microscoop. Zorg ervoor dat het gat door de andere kant van het apparaat dringt en gebruik een pincet om de uitgestanste stukken te verwijderen.</li>
	<li>Was een deklip (18 x 18 mm, 0,14 mm dik) grondig met water en zeep en vervolgens met isopropanol. Gebruik luchtdruk om de gereinigde coverslip te drogen.</li>
	<li>Plaats de gereinigde PDMS en coverslip in de plasmareiniger, sluit de kleppen en schakel de stroom, stofzuiger en pomp in. Laat de plasmareiniger ongeveer een minuut draaien, stel de RF in op HI en laat wat lucht in de plasmareiniger komen met behulp van de fijne klep.<ol><li>Wanneer de kleur van het kijkvenster verandert van paars naar roze, laat u de plasmareiniger 50 s werken en schakelt u de RF uit. Houd de pomp een minuut aan en open na het uitschakelen geleidelijk de hoofdklep om lucht in de plasmareiniger toe te laten. OPMERKING: Een alternatieve methode om vergelijkbare resultaten te bereiken is warmtebinding. Leg voor deze methode de mal op de afdekplaat en plaats deze op een kookplaat op 70-80 °C gedurende ongeveer 60 minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Druk het PDMS-oppervlak op de gereinigde coverslip en bevestig dat ze zijn gehecht door geen loslating te observeren wanneer u iets op de coverslip optrekt.</li>
	<li>Bevestig de naald van een 90° stompe naald (18 G) met een tang en trek de plastic spuitconnector eraf om deze te verwijderen. Steek het ene uiteinde van de naald in een Tygon-buis (0,020" ID, 0,060" OD, zie Materiaaltabel) en het andere uiteinde in een van de uitgestanste gaten van het apparaat. Herhaal het proces voor de andere gaten.</li>
	<li>Om luchtbellen te verwijderen, injecteert u water/buffer in de kanalen met een glazen spuit (een pomp is optioneel, maar hier is geen pomp gebruikt). Filter alle vloeistoffen met een filter van 0,22 μm voordat u ze in het apparaat injecteert.</li>
	<li>Gebruik een blokkerende agent zoals een 1% BSA-oplossing om de binding van fluorescentie-gelabelde AFP's op de PDMS-wanden te voorkomen. Injecteer het blokkerende middel in het inlaatkanaal en laat het gedurende 20 minuten in de microkanalen blijven. Injecteer vervolgens de bufferoplossing in het inlaatkanaal om de BSA-oplossing weg te spoelen. OPMERKING: Het resulterende PDMS-apparaat is bevestigd aan een afdeksel langs het bodemoppervlak, verbonden met buizen in de inlaat- en uitlaatgaten en bedekt met een blokkerend middel in de kanalen.</li>
</ol>2. Het microfluïdische apparaat instellen
<ol><li>Breng een kleine hoeveelheid dompelolie aan op het oppervlak van de koperen koude fase (zie Materiaaltabel) en verdeel deze met een pluisvrij doekje om een dunne laag olie te maken. Plaats vervolgens een schone saffierschijf (zie Materiaaltabel) op de gecreëerde olielaag. Breng een druppel dompelolie aan op het midden van de saffierschijf en plaats het PDMS-apparaat op de druppel zodat de functies van het apparaat worden uitgelijnd over het kijkgat van de koude fase.</li>
	<li>Houd het apparaat op zijn plaats en bevestig de slang met plakband aan de buitenwanden van de aluminium doos waarin het koude podium is ondergebracht. Noteer de plaatsing van elke specifieke buis.</li>
	<li>Gebruik een glazen spuit om 4-5 μL AF(G)P-oplossing (zie materiaaltabel) in het inlaatkanaal te injecteren. Sluit het deksel van de koude fase. OPMERKING: De concentratie van de AFP-oplossingen kan worden gevarieerd en bepaald op basis van hun fluorescentie-intensiteit. In het huidige protocol was het bereik van concentraties 5-40 μL.</li>
</ol>3. Vorming van enkelvoudige kristallen in de microfluïdische kanalen
<ol><li>Reinig de koude fase met droge lucht / stikstof om te voorkomen dat er condensatie in ontstaat. Activeer een circulerend koelbad om water door de koude fase te laten circuleren en dien als koellichaam.</li>
	<li>Start het temperatuurregelingsprogramma en stel de temperatuur in op -25 °C. OPMERKING: Bevriezing vindt plaats wanneer het monster een temperatuur van ~ -20 ° C bereikt, wat kan worden waargenomen als een plotselinge verduistering en opruwing van het monster. Elk doel kan op dit punt worden gebruikt, bij voorkeur het 4x-objectief, waarmee de gebruiker het geheel van de microfluïdische kanalen kan observeren.</li>
	<li>Langzaam, waarbij de temperatuur met ongeveer 1 °C/5 s wordt verhoogd, nadert u het smeltpunt van het monster, dat kan variëren van -1 tot -0,2 °C, afhankelijk van de buffer die in de AF(G)P-oplossing wordt gebruikt. Als de temperatuur het smeltpunt nadert, wacht je tot een paar enkele kristallen zijn geïsoleerd. OPMERKING: Indien nodig kan ongewenst ijs lokaal worden gesmolten met behulp van een IR-laser (980 nm) (zie Tabel van materialen), die op de microscoop wordt bevestigd. De laser smelt nabijgelegen ijskristallen zolang deze aan staat.</li>
	<li>Op dit punt wordt aanbevolen om over te schakelen naar 10x of 20x objectieven om enkele kristallen beter te observeren. Na het verkrijgen van een enkel kristal op de gewenste locatie, laat het kristal groeien door de temperatuur enigszins te verlagen (met ~ 0,01 ° C) totdat de randen van het kristal de kanaalwanden ontmoeten.</li>
	<li>Schakel over naar het 50x-objectief, injecteer de AF(G)P-oplossing in de kanalen en observeer de toename van de fluorescentie-intensiteit, wat aangeeft dat de eiwitoplossing met succes in de kanalen is geïnjecteerd. Voer deze stap zorgvuldig uit om smelten van het ijskristal tijdens de uitwisseling van oplossingen te voorkomen. Controleer en pas zowel het debiet (door meer/minder druk uit te oefenen op de glazen spuit) als de temperatuur tijdens het oplossingsuitwisselingsproces nauwlettend aan.</li>
	<li>Geef de eiwitten voldoende tijd om zich op te hopen en te binden aan het kristaloppervlak. OPMERKING: Dit varieert op basis van de accumulatie- en adsorptiesnelheden van de AF(G)P 5,25. In een typisch experiment is 5-10 minuten toegestaan voor AFP-accumulatie</li>
</ol>4. Thermische hysterese (TH) activiteitsmeting
OPMERKING: Deze stap is optioneel.
<ol><li>Bepaal het smeltpunt van het kristal door de temperatuur aan te passen met kleine stappen van 0,002 °C en de hoogste temperatuur in acht te nemen waaraan een klein kristal kan worden blootgesteld zonder dat het smelt.</li>
	<li>Stel op de RAMP-functie van de temperatuurregelaar de koelsnelheid in op -0,05 tot -0,01 °C/4 s en activeer de RAMP. Noteer de exacte temperatuur waarbij plotselinge kristalgroei optreedt. OPMERKING: Deze waarde wordt de burst-temperatuur genoemd en komt overeen met de temperatuur van het vriespunt. Het verschil tussen de smelt- en vriestemperaturen is de TH-activiteit25.</li>
</ol>5. Oplossingsuitwisseling rond enkelvoudige kristallen
<ol><li>Zorg ervoor dat de monstertemperatuur zich in de TH-opening bevindt om het smelten of groeien van het kristal tijdens het experiment te voorkomen.</li>
	<li>Leg het oplossingsuitwisselingsproces vast met behulp van het NIS Elements-beeldvormingsprogramma (zie Materiaaltabel) voor latere fluorescentiegegevensanalyse. Injecteer de bufferoplossing langzaam in de tweede inlaat van het microfluïdische apparaat en observeer een afname van het fluorescerende signaal met een snelheid die afhankelijk is van de druk die op de spuit wordt uitgeoefend.<ol><li>Gebruik deze visuele weergave om ervoor te zorgen dat de uitgeoefende druk niet te hoog is om het kristal niet te laten smelten. Zie figuur 2 voor een reeks afbeeldingen die het oplossingsuitwisselingsproces demonstreren.</li>
	</ol></li>
	<li>Meet de fluorescentie-intensiteit in het microfluïdische kanaal met behulp van het beeldvormingsprogramma. OPMERKING: Het signaal moet pieken in het gebied nabij het oppervlak van het kristal, wat wijst op AFP-binding, en moet relatief laag zijn in de omringende oplossing, die met buffer is gespoeld.</li>
	<li>Meet de TH-activiteit na de oplossingsuitwisseling volgens stap 4.</li>
	<li>Herhaal het experiment door een nieuw kristal te isoleren (stappen 3.3-3.5). Injecteer de AFP-oplossing met een glazen spuit en herhaal de oplossingsuitwisseling (stappen 5.1-5.3). Verkrijg een nieuw enkel kristal (stappen 3.3-3.5) en laat de AFP-oplossing met behulp van de glazen spuit in de kanalen stromen.</li>
</ol>6. Experimenten met clathraathydraten
<ol><li>Om THF-hydraten te verkrijgen, bereidt u een THF/water-oplossing met een molaire verhouding van 1:15, wat een volumeverhouding is van 1:3,326. Handhaaf deze verhouding in alle oplossingen die in de volgende experimenten worden gebruikt, inclusief oplossingen die AF(G)Ps of andere remmers bevatten.</li>
	<li>Volg stap 1 en 2 om het microfluïdische apparaat voor te bereiden en in de koude fase te plaatsen. Stel de temperatuur in op -25 °C; het monster bevriest bij ~-20 °C zoals beschreven in stap 3.2.</li>
	<li>Nadat de THF-oplossing is bevroren, verhoogt u langzaam de temperatuur totdat al het ijs is gesmolten. OPMERKING: Het smeltpunt van ijs wordt enigszins verlaagd door de THF.</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat alle ijskristallen smolten met uitsluiting van de hydraten, houdt u de temperatuur gedurende 3 minuten op 1 °C.</li>
	<li>Stel de temperatuur in op -2 °C en observeer de overvloed aan hydraten die in de microfluïdische kanalen verschijnen in afwezigheid van remmers. OPMERKING: THF-hydraten hebben de vorm van octaëders (figuur 2) en in sommige gevallen zijn de kristallen erg dun; duidelijke observatie kan dus een uitdaging zijn. In deze gevallen wordt aanbevolen om stap 6.4-6.5 te herhalen om nieuwe kristallen te verkrijgen.</li>
	<li>Injecteer de AF(G)P/inhibitor in het microfluïdische kanaal met behulp van de glazen spuit terwijl u de temperatuur aanpast om ervoor te zorgen dat de verkregen kristallen niet smelten/groeien. Wacht een paar minuten voordat de remmende moleculen aan het kristaloppervlak adsorberen.</li>
	<li>Meet indien nodig de TH-activiteit volgens stap 4.</li>
	<li>Wissel de oplossing rond de kristallen zoals beschreven in stap 5.2-5.3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-Binding+Proteins+and+Their+Function.">Ice-Binding Proteins and Their Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).</li><li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+are+antifreeze+proteins+in+solution+essential+for+ice+growth+inhibition.">When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition.</a> Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).</li><li>Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+glycoproteins+bind+irreversibly+to+ice.">Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).</li><li>Braslavsky, I., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LabVIEW-operated+Novel+Nanoliter+Osmometer+for+Ice+Binding+Protein+Investigations.">LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).</li><li>Ruppel, C. D., Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+climate+change+and+methane+hydrates.">The interaction of climate change and methane hydrates.</a> Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).</li><li>Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alcohols+and+diols+on+PVCap-induced+hydrate+crystal+growth+patterns+in+methane+systems.">Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems.</a> Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).</li><li>Sa, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+methane+and+natural+gas+hydrate+formation+by+altering+the+structure+of+water+with+amino+acids.">Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids.</a> Scientific Reports. 6, 31582 (2016).</li><li>Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+kinetic+inhibitors+for+natural+gas+hydrates.">Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates.</a> Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).</li><li>Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Inhibition+of+Gas+Hydrates+by+&#945;-Helical+Antifreeze+Proteins.">Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by &#945;-Helical Antifreeze Proteins.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antifreeze+proteins+on+the+nucleation,+growth,+and+the+memory+effect+during+tetrahydrofuran+clathrate+hydrate+formation.">Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tetrahydrofuran+clathrate-hydrate+formation+with+antifreeze+protein.">The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein.</a> Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).</li><li>Walker, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+as+gas+hydrate+inhibitors.">Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors.</a> Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).</li><li>Gordienko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+green+hydrate+inhibitor:+imaging+antifreeze+proteins+on+clathrates.">Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates.</a> PloS One. 5 (2), 8953 (2010).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+generation+using+a+polydimethylsiloxane+(PDMS)+co-axial+flow+focus+device.">Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).</li><li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing:+An+overview.">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview.</a> Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).</li><li>Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+diagnostic+microfluidics.">Advances in diagnostic microfluidics.</a> Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).</li><li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography.">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).</li><li>Haleva, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cold-finger+device+for+the+investigation+of+ice-binding+proteins.">Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins.</a> Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).</li><li>Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THF+hydrates+as+model+systems+for+natural+gas+hydrates:+Comparing+their+mechanical+and+vibrational+properties.">THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties.</a> Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).</li><li>Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+crystallization+kinetics+of+methane+(sI)+hydrate+in+a+thermoelectrically-cooled+microreactor.">Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+that+accumulate+on+different+ice+crystal+planes+produce+distinct+thermal+hysteresis+dynamics.">Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).</li><li>Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption-inhibition+of+clathrate+hydrates+by+self-assembled+nanostructures.">Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures.</a> ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).</li><li>Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v., Ward, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+unsteady+morphologies+at+ice+interfaces+driven+by+D2O-H2O+exchange.">Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).</li><li>Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+growth+acceleration+by+antifreeze+proteins+leads+to+higher+thermal+hysteresis+activity.">Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity.</a> Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).</li></ol>

Het huidige protocol is ontworpen om de combinatie van microfluïdische stroming met microscopische kristallen te gebruiken om nieuwe inzichten in kristalgroei en de remming ervan te onthullen. Een millikelvin-resolutie temperatuurgestuurde koude fase27 maakt de controle van enkele microscopische kristallen in microfluïdische kanalen mogelijk, waardoor de uitwisseling van oplossingen eromheen mogelijk is. Hoewel de fabricage van microfluïdische apparaten standaard is en vergelijkbaar met gangbare praktijken17,18, is de controle over de groei en het smelten van kristallen in het apparaat uniek en nieuw. Het meest kritieke onderdeel in dit systeem is de uitstekende temperatuurregeling, die wordt bereikt door gebruik te maken van Peltier thermo-elektrische koelers, feedback van een thermistor die zich dicht bij het monster bevindt en een temperatuurregelaar met hoge resolutie die de feedbacklus regelt.
Een andere kritieke stap is de oplossingsuitwisseling zelf, omdat de kristallen tijdens dit proces kunnen smelten of groeien; daarom moet de temperatuur tijdens de oplossingsuitwisseling worden aangepast om groei / smelten te voorkomen. De vorming van kristallen in microfluïdische kanalen interfereert met de vloeistofstroom en vormt de belangrijkste uitdaging van dit systeem; daarom moet de groei van deze kristallen worden gecontroleerd. Hier werd een IR-laser (980 nm) op de omgekeerde microscoop gemonteerd en gebruikt om lokaal ongewenst ijs / hydraatkristallen te smelten28. Als een dergelijke laser niet kan worden gebruikt, kunnen de metalen connectoren van het microfluïdische apparaat worden verwarmd door een extra Peltier thermo-elektrische koeler, die het ijs in de inlaat / uitlaat van het apparaat zal smelten.
De hier beschreven methode omvat zelf ontwikkelde instrumenten (koude fase) en vereist training, omdat sommige van de bovengenoemde stappen uitdagend zijn. Aangezien de concentratie van de oplossing rond de kristallen kan veranderen, zelfs wanneer de stroom niet bedoeld is, kan een eenvoudige kalibratiestap5 een betrouwbare schatting van de concentratie opleveren op basis van het fluorescentiesignaal. Een andere mogelijke oplossing voor ongewenste stroming (bijvoorbeeld tijdens TH-metingen) zijn microfluïdische kleppen, die worden beschreven in referentie4.
Dit systeem werd ook gebruikt om het groeigedrag van D2O-ijs in H2O-vloeistof te onderzoeken, een studie die een nieuw fenomeen van microscopisch kleine, geschulpte ijsoppervlakken onthulde27. Microfluïdica kan dus worden gebruikt bij de studie van verschillende kristallijne systemen die goed reageren op temperatuurveranderingen.

Antivrieseiwitten (AFP's) en antivriesglycoproteïnen (AFGP's) beschermen verschillende aan koude aangepaste organismen tegen vorstschade1. AFP's en AFGP's (gegeneraliseerd als AF(G)Ps) remmen de groei van ijskristallen door zich onomkeerbaar aan hun oppervlak te binden en verdere groei te remmen als gevolg van het Gibbs-Thomson-effect 2,3,4,5. De resulterende kloof die ontstaat tussen de smelttemperatuur, die grotendeels ongewijzigd is, en de nieuw verlaagde vriestemperatuur wordt thermische hysterese (TH) genoemd en vertegenwoordigt een meetbare parameter die overeenkomt met AFP-activiteit6. Het gebruik van AFP's om ijsgroei te remmen heeft verreikende en diverse toepassingen en biedt potentiële verbetering op verschillende gebieden, waaronder cryopreservatie, bevroren voedselkwaliteit en bescherming van koud blootgestelde gewassen.
De kristallisatie van water bij lage temperaturen en hoge drukken in de aanwezigheid van kleine organische moleculen resulteert in de vorming van clathraathydraten (of gashydraten), waarbij het meest voorkomende hydraat methaanhydraatis 7. De kristallisatie van methaanhydraten in gas/oliestroomlijnen kan pluggen veroorzaken, die explosies kunnen veroorzaken als gevolg van gasontbranding 8,9,10. Huidige inspanningen om hydraatkristallisatie in flowlines te voorkomen, omvatten het gebruik van thermodynamische (alcoholen en glycolen) en kinetische (voornamelijk polymeren) remmers 11,12,13,14. AFP's blijken ook te binden aan clathraathydraatkristallen en hun groei te remmen, wat wijst op het mogelijke gebruik van AFP's om de vorming van pluggen te belemmeren, waardoor een groenere oplossing wordt geboden15.
Microfluïdica is een veelgebruikte methode om de eigenschappen van vloeistoffen te bestuderen bij minuscule monstervolumes (tot fL) die door een netwerk van microkanalen worden gestroomd16. De microkanalen volgen een patroon gemaakt op een silicium wafer (de mal) met behulp van lithografie17. Een veelgebruikt materiaal om microfluïdische apparaten te fabriceren is polydimethylsiloxaan (PDMS), dat goedkoop is en relatief eenvoudig om mee te werken in onderzoekslaboratoria. Het ontwerp van de functies (kanalen) is samengesteld met betrekking tot het specifieke doel van het apparaat; het kan dus worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder DNA-detectie18, medische diagnose19 en kristallisatieprocessen 3,20,21.
Het huidige protocol beschrijft een unieke microfluïdische methode voor het kweken van micron-ijs en hydraatkristallen met verschillende remmers, waaronder AFP's en AFGP's. Voor deze experimenten werden tetrahydrofuran (THF) hydraten gebruikt om de eigenschappen van methaangashydraten na te bootsen22, die gespecialiseerde apparatuur vereisen voor druk- en temperatuurregeling23. Fluorescerend gelabelde AF (G) Ps werden gebruikt om de adsorptie van de eiwitten aan het kristaloppervlak te visualiseren en te analyseren, en in combinatie met fluorescerende beeldvorming maakte de microfluïdische benadering het verkrijgen van belangrijke kenmerken van het bindingsproces van deze moleculen aan kristaloppervlakken mogelijk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

Een nauwkeurige mechanistische beschrijving van waterkristallisatie is een uitdaging en vereist een paar belangrijke elementen: uitstekende temperatuurregeling om de vorming van enkele microscopische kristallen mogelijk te maken en een geschikt microscopiesysteem gekoppeld aan de koude fase. De hierin beschreven methode voegt nog een belangrijk kenmerk toe, waaronder het uitwisselen van oplossingen rond ijs en clathraathydraatkristallen. Het beschreven systeem bestaat uit een combinatie van unieke en zelfontwikkelde instrumenten, waaronder microfluïdica, koude stadia met hoge resolutie en fluorescentiemicroscopie. De koude fase is ontworpen voor microfluïdische apparaten en maakt de vorming van micron-ijs / hydraatkristallen in microfluïdische kanalen en de uitwisseling van oplossingen eromheen mogelijk. De temperatuurresolutie en stabiliteit van de koude fase is één millikelvin, wat cruciaal is voor het beheersen van de groei van deze kleine kristallen. Dit diverse systeem wordt gebruikt om de verschillende processen van ijs- en hydraatkristallisatie te bestuderen en het mechanisme waardoor de groei van deze kristallen wordt geremd. Het protocol beschrijft hoe microfluïdische apparaten te bereiden, hoe microscopische kristallen in de microfluïdische kanalen te laten groeien en te beheersen, en hoe het gebruik van de stroom van vloeistoffen rond ijs / hydraatkristallen nieuwe inzichten biedt in de kristallisatie van water.

Oplossingsuitwisseling met ijskristallen Een succesvolle oplossingsuitwisseling rond een ijskristal is weergegeven in figuur 3. Het tijdstempel op elke momentopname geeft aan dat de oplossingsuitwisseling relatief snel was; een langzamere uitwisseling is echter mogelijk. De fluorescentie-intensiteit afkomstig van de ijsgeadsorbeerde AFGP-moleculen wordt duidelijk waargenomen nadat de uitwisseling is voltooid (figuur 3, rechts). Een kwantitatieve analyse van de AFP-concentratie op het ijsoppervlak wordt gemonitord met behulp van een aangewezen tool (region of interest ) (ROI) (figuur 4). In dit experiment4 werd AFP type III (QAE isoform) verdund in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) en 100 mM NaCl gebruikt. De oplossing wordt uitgewisseld rond een bipiramidaalvormig kristal en de fluorescentie-intensiteit in de oplossing en op het ijs wordt bewaakt. De rode plot die het fluorescentiesignaal in de oplossing aangeeft, wordt tijdens de oplossingsuitwisseling met een factor 100 verminderd, terwijl het berekende signaal (groene plot) op het ijsoppervlak constant blijft. Het berekende signaal van de ijsgeadsorbeerde moleculen werd verkregen door het signaal afkomstig van de oplossing (vermenigvuldigd met een constante die betrekking heeft op de dikte van het microfluïdische kanaal) af te trekken van het signaal afkomstig van het ijs4.
Oplossingsuitwisseling met THF-hydraten Microfluïdische experimenten met THF-hydraten werden op dezelfde manier uitgevoerd als de experimenten met ijs. Nadat de hydraatkristallen de remmermoleculen uit de oplossing mochten adsorberen, werd een remmervrije oplossing in de kanalen geïnjecteerd. Figuur 5 toont THF-hydraten na oplossingsuitwisseling met twee soorten remmers: AFGP1-5 gelabeld met fluoresceïneisothiocyanaat (FITC) (figuur 5A) en safranine O (zie tabel met materialen), een fluorescentiekleurstof26 (figuur 5B). Dit is de eerste demonstartie van een AFGP-binding aan het oppervlak van een clathraathydraat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> Figuur 1: Een schematische weergave van de microfluïdische kanalen die in deze studie zijn gebruikt. Beide ontwerpen bevatten twee inlaten en een uitlaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> Figuur 2: THF-hydraten gevormd in het microfluïdische kanaal nadat de temperatuur was afgekoeld tot ~ -2 ° C. De morfologie van alle gepresenteerde kristallen is een tetraëder; sommige kristallen zijn echter anders georiënteerd. Schaalbalk = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> Figuur 3: Een representatief experiment met oplossingsuitwisseling rond een enkel ijskristal in een microfluïdisch kanaal. Aanvankelijk bevatte de oplossing AFGP1-5 gelabeld met FITC en ijs-geadsorbeerde AFGP's werden niet waargenomen. Nadat de oplossing was vervangen door een AFGP-vrije oplossing, werden de eiwitten die eerder aan het ijsoppervlak waren geadsorbeerd duidelijk gedetecteerd (afbeelding rechts). Schaalbalk = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> Figuur 4: Een kwantitatieve en kwalitatieve analyse van de AFP-concentratie op het ijsoppervlak. (A) Een ijskristal bij hoge AFP-oplossingsconcentratie (vóór oplossingsuitwisseling). (B) Hetzelfde kristal nadat de AFP-oplossing werd uitgewisseld met een AFP-vrije bufferoplossing. Schaalbalk = 20 μm. (C) Kwantitatieve analyse van de fluorescentie-intensiteit op het ijsoppervlak (zwart) en in de oplossing (rood) tijdens een oplossingsuitwisseling. De groene curve geeft de berekende intensiteit op het ijsoppervlak weer. De figuur is met toestemming aangepast van referentie4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> Figuur 5: Enkelvoudige THF-hydraatkristallen in microfluïdische kanalen nadat de oplossing eromheen (A, AFGP1-5) of (B,  Safranine O) was uitgewisseld. De afbeelding in (B) is gereproduceerd uit referentie26. Schaalbalk = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization at JoVE.com

A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

Het huidige protocol beschrijft de kristallisatie van microscopische ijskristallen en clathraathydraten in microfluïdische apparaten, waardoor vloeistofuitwisseling rond de gevormde kristallen mogelijk wordt. Dit biedt ongeëvenaarde mogelijkheden om het kristallisatieproces en de bindingsmechanismen van de remmers te onderzoeken.

Een microfluïdische benadering voor de studie van ijs- en clathraathydraatkristallisatie

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Dit protocol is uniek omdat het de gebruiker in staat stelt om de interactie tussen oplosbare moleculen en kristaloppervlakken te bestuderen en te onderzoeken en te meten. Sterk bewijs voor onomkeerbare binding van antivrieseiwitten aan ijs of verkregen met behulp van deze methode. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om de groei van micronformaat ijs en hydrateerde kristallen te beheersen en de oplossing eromheen op een gecontroleerde manier uit te wisselen.Plaats om te beginnen de vooraf voorbereide mal in een glazen petrischaal bedekt met aluminiumfolie. Bereid vervolgens 30 tot 40 milliliter van het PDMS-mengsel door een 1 tot 10 mengsel van het uithardingsmiddel en elastomeer te wegen en gedurende ongeveer vijf minuten continu te mengen totdat het mengsel wit en bijna ondoorzichtig lijkt. Giet vervolgens het PDMS-mengsel in de petrischaal met de vorm en ontgas in een exsiccator totdat er geen bubbels achterblijven.Bak de mal met de vloeibare PDMS in een oven of op een hete plaat op 70 graden Celsius tot een rubberachtige consistentie is verkregen. Snijd vervolgens het apparaat uit door de kenmerken met een scalpel te traceren, waarbij u ervoor zorgt dat u met het scalpel naar voren duwt in plaats van naar beneden, omdat de mal kwetsbaar is. Nadat u het uitgesneden PDMS-apparaat hebt verwijderd, plaatst u het ondersteboven in een nieuwe petrischaal.Met behulp van een stompe spuit, een naald van 20 gauge, pons je gaten in het apparaat op basis van het bedrukte patroon. Plaats vervolgens het gereinigde PDMS en de coverslip in de plasmareiniger. Sluit de kleppen en schakel de stroom, stofzuiger en pomp in.Laat de plasmareiniger ongeveer een minuut draaien. Stel de RF in op hoog en laat wat lucht in de plasmareiniger komen met behulp van de fijne klep. Wanneer de kleur van de weergavevensters verandert van paars naar roze, laat u de plasmareiniger 50 seconden werken om de RF uit te schakelen.Houd de pomp een minuut aan en open na het uitschakelen geleidelijk de hoofdklep om lucht in de plasmareiniger toe te laten. Druk vervolgens het PDMS-oppervlak op de gereinigde coverslip en bevestig dat ze zijn gebonden door geen loslating te observeren bij het iets omhoog trekken op de coverslip. Nadat u de naald van een stompe naald van 90 graden met een tang hebt vastgezet, steekt u het ene uiteinde van de naald in een Tygon-buis en het andere uiteinde in een van de uitgestanste gaten van het apparaat terwijl u het proces voor de andere gaten herhaalt.Breng een kleine hoeveelheid dompelolie aan op het oppervlak van het koperen koude stadium en verspreid het met een pluisvrij doekje om een dunne laag olie te maken. Plaats vervolgens een schone saffierschijf op de gecreëerde olielaag. Breng vervolgens een druppel dompelolie aan op het midden van de saffierschijf en plaats het PDMS-apparaat op de druppel zodat de kenmerken van het apparaat worden uitgelijnd over het kijkgat van het koude podium.Nadat u het apparaat op zijn plaats hebt gehouden, bevestigt u de slang aan de buitenwanden van de aluminium doos waarin de plakband is ondergebracht. Injecteer met behulp van een glazen spuit vier tot vijf microliter antivrieseiwitoplossing in het inlaatkanaal en sluit het deksel van de koude fase. Start het temperatuurregelingsprogramma en stel de temperatuur in op min 25 graden Celsius.Verhoog vervolgens langzaam de temperatuur met ongeveer één graad Celsius per vijf seconden. Benader het smeltpunt van de monsters, dat kan variëren van min 1 tot min 0,2 graden Celsius, afhankelijk van de buffer die wordt gebruikt in de antivrieseiwitoplossing. Om enkelvoudige kristallen beter te observeren, schakel je over naar 10x of 20x objectieven.En na het verkrijgen van een enkel kristal op de gewenste locatie, laat het kristal groeien door de temperatuur enigszins te verlagen totdat de uiteinden van het kristal de kanaalwanden ontmoeten. Nadat u bent overgeschakeld naar het 50x-doel, injecteert u de antivrieseiwitoplossing in de kanalen en ziet u de fluorescentie-intensiteit toenemen, wat aangeeft dat de eiwitoplossing met succes in de kanalen is geïnjecteerd. Om het uitwisselingsproces van de oplossing vast te leggen, gebruikt u het NIS-Elements Imaging Program, zorgt u ervoor dat de uitgeoefende druk niet te hoog is en injecteert u de bufferoplossing langzaam in de tweede inlaat van het microfluïdische apparaat.Neem een afname van het fluorescerende signaal op met een snelheid die afhankelijk is van de druk die op de spuit wordt uitgeoefend. Om THF-hydraten te verkrijgen na het bereiden van een THF-wateroplossing met een molaire verhouding van 1 tot 15, injecteert u de oplossing in het microfluïdische apparaat. Nadat de THF-wateroplossing is bevroren, verhoogt u langzaam de temperatuur totdat al het ijs is gesmolten met uitsluiting van de hydraten en houdt u de temperatuur gedurende drie minuten op één graad Celsius.Stel de temperatuur in op min twee graden Celsius en observeer de overvloed aan hydraten die in de microfluïdische kanalen verschijnen in afwezigheid van remmers. Injecteer vervolgens het antivrieseiwit of de remmer in het microfluïdische kanaal met behulp van de glazen spuit terwijl u de temperatuur aanpast om ervoor te zorgen dat de verkregen kristallen niet smelten of groeien en een paar minuten de remmermoleculen laten adsorberen aan het kristaloppervlak. Voer de oplossingsuitwisseling uit door de remmervrije oplossing in het kanaal te injecteren.Maak beelden van het kristal voor en na de oplossingsuitwisseling en analyseer de fluorescentie-intensiteit op het kristal en in de oplossing met behulp van het beeldvormingsprogramma. Een succesvolle oplossingsuitwisseling rond een ijskristal werd uitgevoerd, wat aangeeft dat de oplossingsuitwisseling relatief snel was. Een langzamere uitwisseling is echter mogelijk.De fluorescentie-intensiteit afkomstig van de ijsgeadsorbeerde antivriesglycoproteïnenmoleculen werd duidelijk waargenomen nadat de uitwisseling was voltooid. Een kwantitatieve analyse van de concentratie van antivrieseiwitten werd gemonitord en de fluorescentie-intensiteit werd bepaald in de oplossing en op het ijs, wat aangeeft dat het fluorescentiesignaal in de oplossing tijdens de oplossingsuitwisseling met een factor 100 is afgenomen, terwijl het berekende signaal op het ijsoppervlak constant blijft. Microfluïdische experimenten met THF-hydraten werden uitgevoerd waarbij een remmervrije oplossing in de kanalen werd geïnjecteerd nadat de hydraatkristallen de remmermoleculen hadden mogen adsorberen.De THF-hydraten werden waargenomen na oplossingsuitwisseling met twee soorten remmers, waaronder antivriesglycoproteïnen gelabeld met fluoresceïneisothiocyanaat en Safranin O, een fluorescerende kleurstof. De kritieke stappen van deze procedure zijn de vorming en isolatie van een enkel kristal in de microfluïdische kanalen en de uitwisseling van oplossing eromheen. Deze methode kan worden gebruikt met andere kristalmaterialen die zeer temperatuurgevoelig zijn, in een poging om het mechanisme te begrijpen waarmee remmers interageren met deze kristallen.Het vermogen om oplossingen rond kristallen uit te wisselen, maakte de weg vrij voor onderzoekers om belangrijke inzichten in het bindingsmechanisme van antivrieseiwitten te identificeren en een nieuw fenomeen van isotoopeffect op ijsgroei te ontdekken.

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW bediende Novel nanoliter Osmometer voor Ice Bindend Eiwit Onderzoeken

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Covalente binding van BMP-2 op oppervlakken met een Zelf-geassembleerde monolaag Aanpak

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

Een Inverse Analyse aanpak van de karakterisering van de Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Microfluïdische Pneumatische Cages: een nieuwe benadering voor de In-chip Crystal Trapping, manipulatie en gecontroleerde chemische behandeling

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Sulfaat Scheiden door selectieve kristallisatie met een Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Microfluidic droog-spinnen en karakterisering van geregenereerde zijde Fibroin vezels

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, kristallisatie en spectroscopische karakterisering van 3,5-Lutidine, N-Oxide uitdrogen

The synthesis of 3,5-lutidine N-oxide dehydrate, 1, was achieved in the synthesis route of 2-amino-pyridine-3,5-dicarboxylic acid. Ochiai first used the ...