Name: a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00
Duration: 8 min 1 s
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Nous remercions les donateurs du Petroleum Research Fund de l’American Chemical Society pour leur soutien à cette recherche (numéro de subvention 60191-UNI5). Les auteurs tiennent à remercier le professeur Ido Braslavsky pour avoir été le pionnier de l’utilisation de dispositifs microfluidiques pour étudier les protéines antigel et la glace. Les auteurs remercient le professeur Arthur DeVries, le professeur Konrad Meister et le professeur Peter Davies pour avoir fourni des échantillons de protéines antigel.

1. Fabrication de dispositifs microfluidiques
<ol><li>Couvrez la surface intérieure d’une boîte de Petri avec du papier d’aluminium et placez le moule pré-préparé dans la boîte de Pétri.<ol><li>Fabriquer les moules en utilisant les techniques de lithographie décrites dans les références. Les deux conceptions de dispositifs utilisées dans le présent travail sont représentées à la figure 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer 30 à 40 ml du mélange PDMS en pesant un mélange 1:10 (en poids) de l’agent de durcissement et de l’élastomère (voir le tableau des matières) et en mélangeant continuellement pendant environ 5 minutes jusqu’à ce que le mélange apparaisse blanc et presque opaque. REMARQUE: Placez un gobelet en plastique sur la balance, versez l’élastomère dans la tasse, puis ajoutez l’agent de durcissement pour obtenir un rapport de poids de 1:10.</li>
	<li>Verser le mélange PDMS dans la boîte de Petri avec le moule et dégazer dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles (environ 30 min).</li>
	<li>Cuire le moule avec le PDMS liquide dans un four ou sur une plaque chauffante à 70 °C jusqu’à obtention d’une consistance semblable à celle d’un caoutchouc. Ce processus prend environ une heure.</li>
	<li>Découpez l’appareil en traçant les traits avec un scalpel, en prenant soin de pousser vers l’avant avec le scalpel plutôt que vers le bas car le moule est fragile. Retirez le dispositif PDMS découpé et placez-le à l’envers dans une nouvelle boîte de Pétri. Enlevez la poussière et les particules de saleté de la surface inférieure en fixant et en retirant un morceau de ruban adhésif (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Utilisez une aiguille de seringue contondante (20 G) pour percer les trous dans l’appareil en fonction du motif imprimé, à l’aide d’un microscope si nécessaire. Assurez-vous que le trou pénètre de l’autre côté de l’appareil et utilisez une pince à épiler pour retirer les pièces perforées.</li>
	<li>Lavez soigneusement une lamelle de couverture (18 x 18 mm, 0,14 mm d’épaisseur) avec de l’eau et du savon, puis avec de l’isopropanol. Utilisez la pression de l’air pour sécher la lamelle de couverture nettoyée.</li>
	<li>Insérez le PDMS nettoyé et le couvercle dans le nettoyeur plasma, fermez les vannes et allumez l’alimentation, l’aspirateur et la pompe. Laissez le nettoyeur plasma fonctionner pendant environ une minute, réglez le RF sur HI et laissez un peu d’air pénétrer dans le nettoyeur plasma à l’aide de la valve fine.<ol><li>Lorsque la couleur de la fenêtre de visualisation passe du violet au rose, laissez le nettoyeur plasma agir pendant 50 s et désactivez la RF. Maintenez la pompe allumée pendant une minute et, après l’avoir éteinte, ouvrez progressivement la vanne principale pour permettre à l’air d’entrer dans le nettoyeur plasma. REMARQUE: Une autre méthode pour obtenir des résultats comparables est le collage thermique. Pour cette méthode, posez le moule sur la lamelle de couverture et placez-la sur une plaque chauffante réglée à 70-80 °C pendant environ 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Appuyez sur la surface PDMS sur le bordereau de couverture nettoyé et confirmez qu’ils sont collés en n’observant aucun détachement lorsque vous tirez légèrement vers le haut sur le bordereau de couverture.</li>
	<li>Fixez l’aiguille d’une aiguille émoussée à 90° (18 G) avec une pince et retirez le connecteur de la seringue en plastique pour la retirer. Insérez une extrémité de l’aiguille dans un tube Tygon (0,020 » ID, 0,060 » OD, voir Tableau des matériaux) et l’autre extrémité dans l’un des trous perforés de l’appareil. Répétez le processus pour les autres trous.</li>
	<li>Pour éliminer les bulles d’air, injectez de l’eau / tampon dans les canaux avec une seringue en verre (une pompe est facultative, mais aucune pompe n’a été utilisée ici). Filtrez tous les liquides avec un filtre de 0,22 μm avant de les injecter dans l’appareil.</li>
	<li>Utilisez un agent bloquant tel qu’une solution BSA à 1 % pour empêcher la liaison d’AFP marqués par fluorescence sur les parois PDMS. Injectez l’agent bloquant dans le canal d’entrée et laissez-le rester dans les microcanaux pendant 20 min. Ensuite, injectez la solution tampon dans le canal d’entrée pour rincer la solution BSA. REMARQUE: Le dispositif PDMS résultant est fixé à une glissière de recouvrement le long de sa surface inférieure, connecté à un tube dans ses trous d’entrée et de sortie, et recouvert d’un agent bloquant dans ses canaux.</li>
</ol>2. Mise en place du dispositif microfluidique
<ol><li>Appliquez une petite quantité d’huile d’immersion sur la surface de l’étage froid en cuivre (voir le tableau des matériaux) et étalez-la à l’aide d’une lingette non pelucheuse pour créer une fine couche d’huile. Ensuite, placez un disque de saphir propre (voir le tableau des matériaux) sur la couche d’huile créée. Appliquez une gouttelette d’huile d’immersion sur le centre du disque saphir et positionnez le dispositif PDMS sur la goutte de sorte que les caractéristiques de l’appareil soient alignées sur le trou de visualisation de l’étage froid.</li>
	<li>Maintenez l’appareil en place et fixez le tube aux parois extérieures de la boîte en aluminium qui abrite l’étage froid à l’aide de ruban adhésif. Notez l’emplacement de chaque tube spécifique.</li>
	<li>Utilisez une seringue en verre pour injecter 4 à 5 μL de solution de FA(G)P (voir le tableau des matériaux) dans le canal d’admission. Fermez le couvercle de la scène froide. NOTE: La concentration des solutions AFP peut être modifiée et décidée en fonction de leur intensité de fluorescence. Dans le protocole actuel, la plage de concentrations était de 5 à 40 μL.</li>
</ol>3. Formation de monocristaux dans les canaux microfluidiques
<ol><li>Purgez la platine froide avec de l’air sec / azote pour empêcher la condensation de se former à l’intérieur. Activez un bain de refroidissement circulant pour faire circuler l’eau à travers la phase froide et servir de dissipateur thermique.</li>
	<li>Lancez le programme de contrôle de la température et réglez la température à -25 °C. NOTE: La congélation se produira lorsque l’échantillon atteindra une température de ~-20 ° C, ce qui peut être observé comme un assombrissement et une rugosité soudains de l’échantillon. N’importe quel objectif peut être utilisé à ce stade, de préférence l’objectif 4x, ce qui permet à l’utilisateur d’observer l’intégralité des canaux microfluidiques.</li>
	<li>Lentement, en augmentant la température d’environ 1 °C/5 s, approchez le point de fusion de l’échantillon, qui peut varier de -1 à -0,2 °C selon le tampon utilisé dans la solution AF(G)P. Lorsque la température approche du point de fusion, attendez que quelques monocristaux soient isolés. REMARQUE : Si nécessaire, la glace indésirable peut être fondue localement à l’aide d’un laser IR (980 nm) (voir le tableau des matériaux), qui est fixé au microscope. Le laser fait fondre les cristaux de glace à proximité tant qu’il est allumé.</li>
	<li>À ce stade, il est recommandé de passer à des objectifs 10x ou 20x pour mieux observer les monocristaux. Après avoir obtenu un seul cristal à l’endroit souhaité, cultivez le cristal en diminuant légèrement la température (de ~0,01 °C) jusqu’à ce que les bords du cristal rencontrent les parois du canal.</li>
	<li>Passez à l’objectif 50x, injectez la solution AF(G)P dans les canaux et observez l’augmentation de l’intensité de fluorescence, indiquant que la solution protéique a été injectée avec succès dans les canaux. Effectuez cette étape avec précaution pour éviter la fonte du cristal de glace lors de l’échange de solutions. Surveillez et ajustez de près le débit (en appliquant plus ou moins de pression sur la seringue en verre) et la température pendant le processus d’échange de solution.</li>
	<li>Laissez aux protéines suffisamment de temps pour s’accumuler et se lier à la surface du cristal. NOTE: Cela varie en fonction des taux d’accumulation et d’adsorption de l’AF(G)P 5,25. Dans une expérience typique, 5 à 10 minutes sont autorisées pour l’accumulation d’AFP</li>
</ol>4. Mesure de l’activité de l’hystérésis thermique (TH)
Remarque : Cette étape est facultative.
<ol><li>Déterminez le point de fusion du cristal en ajustant la température par petites étapes de 0,002 °C et en observant la température la plus élevée à laquelle un petit cristal peut être soumis sans fondre.</li>
	<li>Sur la fonction RAMP du régulateur de température, réglez la vitesse de refroidissement de -0,05 à -0,01 °C/4 s et activez la RAMP. Notez la température exacte à laquelle la croissance soudaine des cristaux se produit. REMARQUE: Cette valeur est appelée température d’éclatement et correspond à la température de congélation. La différence entre les températures de fusion et de congélation est l’activité TH25.</li>
</ol>5. Échange de solutions autour de monocristaux
<ol><li>Assurez-vous que la température de l’échantillon est dans l’espace TH pour empêcher la fusion ou la croissance du cristal pendant l’expérience.</li>
	<li>Enregistrez le processus d’échange de solution à l’aide du programme d’imagerie NIS Elements (voir le tableau des matériaux) pour une analyse ultérieure des données de fluorescence. Injectez lentement la solution tampon dans la deuxième entrée du dispositif microfluidique et observez une diminution du signal fluorescent à un taux qui dépend de la pression appliquée à la seringue.<ol><li>Utilisez cette représentation visuelle pour vous assurer que la pression appliquée n’est pas trop élevée afin de ne pas faire fondre le cristal. Voir la figure 2 pour une séquence d’images illustrant le processus d’échange de solutions.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesurer l’intensité de fluorescence dans le canal microfluidique à l’aide du programme d’imagerie. REMARQUE: Le signal doit culminer dans la région près de la surface du cristal, indiquant une liaison AFP, et doit être relativement faible dans la solution environnante, qui a été rincée avec un tampon.</li>
	<li>Mesurez l’activité TH après l’échange de solution après l’étape 4.</li>
	<li>Répétez l’expérience en isolant un nouveau cristal (étapes 3.3-3.5). Injecter la solution AFP avec une seringue en verre et répéter l’échange de solution (étapes 5.1-5.3). Obtenir un nouveau monocristal (étapes 3.3-3.5) et faire couler la solution AFP dans les canaux à l’aide de la seringue en verre.</li>
</ol>6. Expériences avec des hydrates de clathrate
<ol><li>Pour obtenir des hydrates de THF, préparez une solution THF/eau avec un rapport molaire de 1:15, soit un rapport volumique de 1:3,326. Maintenir ce rapport dans toutes les solutions utilisées dans les expériences suivantes, y compris celles contenant des AF(G)Ps ou d’autres inhibiteurs.</li>
	<li>Suivez les étapes 1 et 2 pour préparer le dispositif microfluidique et le placer à froid. Régler la température à -25 °C; l’échantillon gèlera à ~-20 °C comme décrit à l’étape 3.2.</li>
	<li>Une fois la solution de THF congelée, augmentez lentement la température jusqu’à ce que toute la glace ait fondu. NOTE: Le point de fusion de la glace est légèrement abaissé par le THF.</li>
	<li>Pour s’assurer que tous les cristaux de glace ont fondu à l’exclusion des hydrates, maintenez la température à 1 °C pendant 3 min.</li>
	<li>Réglez la température à -2 °C et observez l’abondance des hydrates qui apparaissent dans les canaux microfluidiques en l’absence d’inhibiteurs. REMARQUE : Les hydrates de THF ont la forme d’octaèdres (Figure 2) et, dans certains cas, les cristaux sont très minces; Ainsi, une observation claire pourrait être difficile. Dans ces cas, il est recommandé de répéter les étapes 6.4-6.5 pour obtenir de nouveaux cristaux.</li>
	<li>Injecter l’AF(G)P/inhibiteur dans le canal microfluidique à l’aide de la seringue en verre tout en ajustant la température pour s’assurer que les cristaux obtenus ne fondent pas ou ne se développent pas. Attendez quelques minutes pour que les molécules inhibitrices s’adsorbent à la surface du cristal.</li>
	<li>Si nécessaire, mesurez l’activité TH après l’étape 4.</li>
	<li>Échangez la solution autour des cristaux comme décrit aux étapes 5.2-5.3.</li>
</ol>

<ol>
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Le présent protocole a été conçu pour utiliser la combinaison du flux microfluidique avec des cristaux microscopiques afin de révéler de nouvelles connaissances sur la croissance des cristaux et son inhibition. Un étage froid à température contrôlée à résolutionmillikelvin 27 permet le contrôle de cristaux microscopiques simples situés à l’intérieur de canaux microfluidiques, permettant ainsi l’échange de solutions autour d’eux. Bien que la fabrication de dispositifs microfluidiques soit standard et similaire aux pratiques courantes17,18, le contrôle de la croissance et de la fusion des cristaux à l’intérieur du dispositif est unique et nouveau. Le composant le plus critique de ce système est le superbe contrôle de la température, qui est réalisé en utilisant des refroidisseurs thermoélectriques Peltier, la rétroaction d’une thermistance située à proximité de l’échantillon et un régulateur de température haute résolution qui régit la boucle de rétroaction.
Une autre étape critique est l’échange de solution lui-même, car les cristaux peuvent fondre ou croître au cours de ce processus; Ainsi, la température doit être ajustée pendant l’échange de solution pour empêcher la croissance/fusion. La formation de cristaux dans les canaux microfluidiques interfère avec l’écoulement du liquide et pose le principal défi de ce système; Ainsi, la croissance de ces cristaux doit être contrôlée. Ici, un laser IR (980 nm) a été monté sur le microscope inversé et a été utilisé pour faire fondre localement des cristaux de glace / hydrate indésirables28. Si un tel laser ne peut pas être utilisé, les connecteurs métalliques du dispositif microfluidique peuvent être chauffés par un refroidisseur thermoélectrique Peltier supplémentaire, qui fera fondre la glace dans l’entrée / sortie de l’appareil.
La méthode décrite ici comprend des instruments développés à la maison (étage froid) et nécessite une formation, car certaines des étapes mentionnées ci-dessus sont difficiles. Comme la concentration de la solution entourant les cristaux peut changer même lorsque l’écoulement n’est pas prévu, une simple étaped’étalonnage 5 peut fournir une estimation fiable de la concentration basée sur le signal de fluorescence. Une autre solution possible à l’écoulement indésirable (lors des mesures TH, par exemple) est les vannes microfluidiques, qui sont décrites dans la référence4.
Ce système a également été utilisé pour explorer le comportement de croissance de la glaceD2Odans le liquideH2O, une étude qui a révélé un nouveau phénomène de surfaces microscopiques de glace festonnée27. Ainsi, la microfluidique peut être utilisée dans l’étude de divers systèmes cristallins qui répondent bien aux changements de température.

Les protéines antigel (AFP) et les glycoprotéines antigel (AFGP) protègent divers organismes adaptés au froid contre les dommages causés par le gel1. Les AFP et les AFGP (généralisés sous le nom d’AF(G)Ps) inhibent la croissance des cristaux de glace en se liant irréversiblement à leur surface et en inhibant la croissance ultérieure due à l’effet Gibbs-Thomson 2,3,4,5. L’écart qui se forme entre la température de fusion, qui est en grande partie inchangée, et la température de congélation nouvellement abaissée est appelé hystérésis thermique (TH) et représente un paramètre mesurable correspondant à l’activité AFP6. L’utilisation des PFA pour inhiber la croissance de la glace a des applications vastes et variées, offrant une amélioration potentielle dans divers domaines, y compris la cryoconservation, la qualité des aliments congelés et la protection des cultures exposées au froid.
La cristallisation de l’eau à basse température et haute pression en présence de petites molécules organiques entraîne la formation d’hydrates de clathrate (ou hydrates de gaz), où l’hydrate le plus abondant est l’hydrate de méthane7. La cristallisation des hydrates de méthane dans les conduites d’écoulement gaz/huile peut provoquer des bouchons, ce qui peut provoquer des explosions dues à l’inflammation du gaz 8,9,10. Les efforts actuels pour prévenir la cristallisation des hydrates dans les conduites d’écoulement comprennent l’utilisation d’inhibiteurs thermodynamiques (alcools et glycols) et cinétiques (principalement des polymères)11,12,13,14. On a également constaté que les AFP se lient aux cristaux d’hydrate clathrates et inhibent leur croissance, ce qui indique l’utilisation potentielle des AFP pour empêcher la formation de bouchons, fournissant ainsi une solution plus verte15.
La microfluidique est une méthode courante utilisée pour étudier les propriétés des fluides à des volumes d’échantillons minuscules (jusqu’à fL) qui circulent à travers un réseau de microcanaux16. Les microcanaux suivent un motif créé sur une plaquette de silicium (le moule) par lithographie17. Un matériau couramment utilisé pour fabriquer des dispositifs microfluidiques est le polydiméthylsiloxane (PDMS), qui est peu coûteux et relativement simple à utiliser dans les laboratoires de recherche. La conception des caractéristiques (canaux) est composée en fonction de l’objectif spécifique de l’appareil; ainsi, il peut être utilisé pour une variété d’applications, y compris la détection de l’ADN18, le diagnostic médical19 et les processus de cristallisation 3,20,21.
Le présent protocole décrit une méthode microfluidique unique de croissance de glace de taille micronique et de cristaux d’hydrate avec divers inhibiteurs, y compris les AFP et les AFGP. Pour ces expériences, des hydrates de tétrahydrofurane (THF) ont été utilisés pour imiter les propriétés des hydrates de méthane22, qui nécessitent un équipement spécialisé pour le contrôle de la pression et de la température23. Des AF(G)P marqués par fluorescence ont été utilisés pour visualiser et analyser l’adsorption des protéines à la surface du cristal et, couplée à l’imagerie fluorescente, l’approche microfluidique a permis d’obtenir des caractéristiques clés du processus de liaison de ces molécules aux surfaces cristallines.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

Une description mécaniste précise de la cristallisation de l’eau est difficile et nécessite quelques éléments clés : un superbe contrôle de la température pour permettre la formation de cristaux microscopiques uniques et un système de microscopie approprié couplé à l’étage froid. La méthode décrite ici ajoute une autre caractéristique importante qui comprend l’échange de solutions autour de cristaux d’hydrate de glace et de clathrate. Le système décrit comprend une combinaison d’instruments uniques et développés à la maison, y compris la microfluidique, les étages froids à haute résolution et la microscopie à fluorescence. L’étage froid a été conçu pour les dispositifs microfluidiques et permet la formation de cristaux de glace / hydrate de la taille d’un micron à l’intérieur des canaux microfluidiques et l’échange de solutions autour d’eux. La résolution de température et la stabilité de l’étage froid sont d’un millikelvin, ce qui est crucial pour contrôler la croissance de ces petits cristaux. Ce système diversifié est utilisé pour étudier les différents processus de cristallisation de la glace et des hydrates et le mécanisme par lequel la croissance de ces cristaux est inhibée. Le protocole décrit comment préparer des dispositifs microfluidiques, comment cultiver et contrôler des cristaux microscopiques dans les canaux microfluidiques, et comment l’utilisation du flux de liquides autour des cristaux de glace / hydrate offre de nouvelles perspectives sur la cristallisation de l’eau.

Échange de solution avec des cristaux de glace Un échange de solution réussi autour d’un cristal de glace est présenté à la figure 3. L’horodatage sur chaque instantané indique que l’échange de solution a été relativement rapide ; Cependant, un échange plus lent est possible. L’intensité de fluorescence provenant des molécules AFGP adsorbées par la glace est clairement observée une fois l’échange terminé (Figure 3, à droite). Une analyse quantitative de la concentration d’AFP à la surface de la glace est surveillée à l’aide d’un outil de région d’intérêt désignée (ROI) (figure 4). Dans cette expérience4, on a utilisé de l’AFP de type III (isoforme QAE) diluée dans du Tris-HCl 50 mM (pH 7,8) et du NaCl 100 mM. La solution est échangée autour d’un cristal de forme bipyramidale, et l’intensité de fluorescence dans la solution et sur la glace est surveillée. Le diagramme rouge indiquant le signal de fluorescence dans la solution est diminué d’un facteur 100 pendant l’échange de solution, tandis que le signal calculé (diagramme vert) à la surface de la glace reste constant. Le signal calculé des molécules adsorbées par la glace a été obtenu en soustrayant le signal provenant de la solution (multiplié par une constante qui se rapporte à l’épaisseur du canal microfluidique) du signal provenant de la glace4.
Échange de solution avec des hydrates de THF Des expériences microfluidiques avec des hydrates de THF ont été réalisées de la même manière que les expériences avec de la glace. Après que les cristaux d’hydrate aient été autorisés à adsorber les molécules inhibitrices de la solution, une solution sans inhibiteur a été injectée dans les canaux. La figure 5 présente les hydrates de THF après échange de solution avec deux types d’inhibiteurs : AFGP1-5 marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Figure 5A) et safranine O (voir Tableau des matériaux), qui est un colorant de fluorescence26 (Figure 5B). C’est la première démonation d’un AFGP se liant à la surface d’un hydrate de clathrate.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique des canaux microfluidiques utilisés dans la présente étude. Les deux conceptions comprennent deux entrées et une sortie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> Figure 2 : Hydrates de THF formés dans le canal microfluidique après refroidissement de la température à ~-2 °C. La morphologie de tous les cristaux présentés est un tétraèdre; Cependant, certains cristaux sont orientés différemment. Barre d’échelle = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> Figure 3 : Expérience représentative présentant un échange de solution autour d’un seul cristal de glace dans un canal microfluidique. Initialement, la solution contenait AFGP1-5 marqué avec FITC, et les AFGP adsorbés par la glace n’ont pas été observés. Après que la solution a été échangée contre une solution sans AFGP, les protéines qui avaient été précédemment adsorbées à la surface de la glace ont été clairement détectées (image de droite). Barre d’échelle = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> Figure 4 : Analyse quantitative et qualitative de la concentration d’AFP à la surface de la glace. (A) Un cristal de glace à haute concentration de solution d’AFP (avant échange de solution). (B) Le même cristal après l’échange de la solution AFP avec une solution tampon sans AFP. Barre d’échelle = 20 μm. (C) Analyse quantitative de l’intensité de fluorescence à la surface de la glace (noir) et dans la solution (rouge) lors d’un échange de solution. La courbe verte représente l’intensité calculée à la surface de la glace. La figure est adaptée avec la permission de la référence4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> Figure 5 : Cristaux d’hydrate de THF simples dans des canaux microfluidiques après échange de la solution qui les entoure (A, AFGP1-5) ou (B,Safranine  O). L’image en (B) est reproduite à partir de la référence26. Barre d’échelle = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

Le présent protocole décrit la cristallisation de cristaux de glace microscopiques et d’hydrates de clathrate dans des dispositifs microfluidiques, permettant l’échange de liquides autour des cristaux formés. Cela offre des possibilités inégalées pour examiner le processus de cristallisation et les mécanismes de liaison des inhibiteurs.

Une approche microfluidique pour l’étude de la cristallisation de la glace et de l’hydrate de clathrate

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Ce protocole est unique car il permet à l’utilisateur d’étudier, d’examiner et de mesurer l’interaction entre les molécules solubles et les surfaces cristallines. Preuves solides de la liaison irréversible des protéines antigel à la glace ou obtenues à l’aide de cette méthode. Le principal avantage de cette technique est la capacité de contrôler la croissance de la glace de taille micronique et d’hydrater les cristaux et d’échanger la solution autour d’eux de manière contrôlée.Pour commencer, placez le moule pré-préparé dans une boîte de Petri en verre recouverte de papier d’aluminium. Préparez ensuite 30 à 40 millilitres du mélange PDMS en pesant un mélange de 1 à 10 de l’agent de durcissement et de l’élastomère et en mélangeant en continu pendant environ cinq minutes jusqu’à ce que le mélange apparaisse blanc et presque opaque. Ensuite, versez le mélange PDMS dans la boîte de Petri avec le moule et dégazez dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles.Cuire le moule avec le PDMS liquide dans un four ou sur une plaque chauffante à 70 degrés Celsius jusqu’à obtenir une consistance caoutchouteuse. Ensuite, découpez l’appareil en traçant autour des traits avec un scalpel, en prenant soin de pousser vers l’avant avec le scalpel au lieu de le baisser, car le moule est fragile. Après avoir retiré le dispositif PDMS découpé, placez-le à l’envers dans une nouvelle boîte de Pétri.À l’aide d’une seringue émoussée, d’une aiguille de calibre 20, percez des trous dans l’appareil en fonction du motif imprimé. Insérez ensuite le PDMS nettoyé et le couvercle dans le nettoyeur plasma. Fermez les vannes et allumez l’alimentation, le vide et la pompe.Laissez le nettoyeur de plasma fonctionner pendant environ une minute. Réglez la RF à haute température et laissez entrer un peu d’air dans le nettoyeur plasma à l’aide de la valve fine. Lorsque la couleur des fenêtres d’affichage passe du violet au rose, laissez le nettoyeur plasma agir pendant 50 secondes pour désactiver la RF.Maintenez la pompe allumée pendant une minute et, après l’avoir éteinte, ouvrez progressivement la vanne principale pour permettre à l’air d’entrer dans le nettoyeur plasma. Appuyez ensuite sur la surface PDMS sur le couvercle nettoyé et confirmez qu’ils sont collés en n’observant aucun détachement lorsque vous tirez légèrement vers le haut sur le bordereau. Après avoir fixé l’aiguille d’une aiguille émoussée à 90 degrés avec une paire de pinces, insérez une extrémité de l’aiguille dans un tube Tygon et l’autre extrémité dans l’un des trous perforés de l’appareil tout en répétant le processus pour les autres trous.Appliquez une petite quantité d’huile d’immersion sur la surface de l’étage froid en cuivre et étalez-le à l’aide d’une lingette non pelucheuse pour créer une fine couche d’huile. Ensuite, placez un disque de saphir propre sur la couche d’huile créée. Appliquez ensuite une gouttelette d’huile d’immersion sur le centre du disque saphir et positionnez le dispositif PDMS sur la goutte de manière à ce que les caractéristiques de l’appareil soient alignées sur le trou de visualisation de l’étage froid.Après avoir maintenu l’appareil en place, fixez le tube aux parois extérieures de la boîte en aluminium qui abrite le ruban adhésif. À l’aide d’une seringue en verre, injecter quatre à cinq microlitres de solution protéique antigel dans le canal d’entrée et fermer le couvercle de l’étage froid. Lancez le programme de contrôle de la température et réglez la température à moins 25 degrés Celsius.Ensuite, augmentez lentement la température d’environ un degré Celsius toutes les cinq secondes. Approchez du point de fusion des échantillons, qui peut varier de moins 1 à moins 0,2 degré Celsius, selon le tampon utilisé dans la solution protéique antigel. Pour mieux observer les monocristaux, passez à des objectifs 10x ou 20x.Et après avoir obtenu un seul cristal à l’endroit souhaité, cultivez le cristal en diminuant légèrement la température jusqu’à ce que les extrémités du cristal rencontrent les parois du canal. Après être passé à l’objectif 50x, injecter la solution protéique antigel dans les canaux et observer l’augmentation de l’intensité de fluorescence, indiquant que la solution protéique a été injectée avec succès dans les canaux. Pour enregistrer le processus d’échange de solution, utilisez le programme d’imagerie NIS-Elements, en veillant à ce que la pression appliquée ne soit pas trop élevée et injectez lentement la solution tampon dans la deuxième entrée du dispositif microfluidique.Observez une diminution du signal fluorescent à un taux qui dépend de la pression appliquée à la seringue. Pour obtenir des hydrates de THF après avoir préparé une solution d’eau de THF avec un rapport molaire de 1 à 15, injecter la solution dans le dispositif microfluidique. Une fois la solution d’eau THF congelée, augmentez lentement la température jusqu’à ce que toute la glace ait fondu à l’exclusion des hydrates et maintenez la température à un degré Celsius pendant trois minutes.Réglez la température à moins deux degrés Celsius et observez l’abondance des hydrates qui apparaissent dans les canaux microfluidiques en l’absence d’inhibiteurs. Injectez ensuite la protéine ou l’inhibiteur antigel dans le canal microfluidique à l’aide de la seringue en verre tout en ajustant la température pour s’assurer que les cristaux obtenus ne fondent pas ou ne se développent pas et laisser quelques minutes aux molécules inhibitrices pour s’adsorber à la surface du cristal. Effectuer l’échange de solution en injectant la solution sans inhibiteur dans le canal.Prenez des images du cristal avant et après l’échange de solution et analysez l’intensité de fluorescence sur le cristal et dans la solution à l’aide du programme d’imagerie. Un échange de solution réussi autour d’un cristal de glace a été effectué, indiquant que l’échange de solution était relativement rapide. Cependant, un échange plus lent est possible.L’intensité de fluorescence provenant des molécules de glycoprotéines antigel adsorbées par la glace a été clairement observée après la fin de l’échange. Une analyse quantitative de la concentration de protéines antigel a été surveillée et l’intensité de fluorescence a été déterminée dans la solution et sur la glace, indiquant que le signal de fluorescence dans la solution est diminué d’un facteur 100 pendant l’échange de solution, tandis que le signal calculé à la surface de la glace reste constant. Des expériences microfluidiques avec des hydrates de THF ont été réalisées où une solution sans inhibiteur a été injectée dans les canaux après que les cristaux d’hydrate aient été autorisés à adsorber les molécules inhibitrices.Les hydrates de THF ont été observés après échange de solution avec deux types d’inhibiteurs, y compris les glycoprotéines antigel marquées avec de l’isothiocyanate de fluorescéine et la safranine O, un colorant fluorescent. Les étapes critiques de cette procédure sont la formation et l’isolement d’un seul cristal dans les canaux microfluidiques et l’échange de solution autour de celui-ci. Cette méthode peut être utilisée avec d’autres matériaux cristallins très sensibles à la température, dans le but de comprendre le mécanisme par lequel les inhibiteurs interagissent avec ces cristaux.La possibilité d’échanger des solutions autour de cristaux a ouvert la voie aux chercheurs pour identifier des informations clés sur le mécanisme de liaison des protéines antigel et pour découvrir un nouveau phénomène d’effet isotopique sur la croissance de la glace.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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LabVIEW fonctionnant Osmomètre nanolitre Novel des enquêtes de glace Binding Protein

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Recherche

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