Name: a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00
Duration: 8 min 1 s
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Wir danken den Spendern des American Chemical Society Petroleum Research Fund für die Unterstützung dieser Forschung (Fördernummer 60191-UNI5). Die Autoren danken Prof. Ido Braslavsky für die Pionierarbeit bei der Verwendung mikrofluidischer Geräte zur Untersuchung von Frostschutzproteinen und Eis. Die Autoren danken Prof. Arthur DeVries, Prof. Konrad Meister und Prof. Peter Davies für die Bereitstellung von Frostschutzproteinproben.

1. Herstellung mikrofluidischer Bauelemente
<ol><li>Bedecken Sie die Innenfläche einer Petrischale mit Aluminiumfolie und legen Sie die vorbereitete Form in die Petrischale.<ol><li>Stellen Sie die Formen mit den in Referenzen beschriebenen Lithographietechniken her. Die beiden in der vorliegenden Arbeit verwendeten Gerätedesigns sind in Abbildung 1 dargestellt.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie 30-40 ml der PDMS-Mischung vor, indem Sie eine Mischung aus Härter und Elastomer im Verhältnis 1:10 (nach Gewicht) wiegen (siehe Materialtabelle) und etwa 5 Minuten lang kontinuierlich mischen, bis die Mischung weiß und nahezu undurchsichtig erscheint. HINWEIS: Stellen Sie einen Plastikbecher auf die Waage, gießen Sie das Elastomer in den Becher und fügen Sie dann das Härter hinzu, um ein Gewichtsverhältnis von 1:10 zu erreichen.</li>
	<li>Gießen Sie die PDMS-Mischung mit der Form in die Petrischale und entgasen Sie in einem Exsikkator, bis keine Blasen mehr übrig sind (ca. 30 min).</li>
	<li>Die Form mit dem flüssigen PDMS im Ofen oder auf einer heißen Platte bei 70 °C backen, bis eine gummiartige Konsistenz entsteht. Dieser Vorgang dauert etwa eine Stunde.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gerät aus, indem Sie die Merkmale mit einem Skalpell nachzeichnen, und achten Sie darauf, mit dem Skalpell nach vorne zu drücken, anstatt nach unten, da die Form zerbrechlich ist. Entfernen Sie das ausgeschnittene PDMS-Gerät, und legen Sie es kopfüber in eine neue Petrischale. Entfernen Sie Staub- und Schmutzpartikel von der Unterseite, indem Sie ein Stück Klebeband anbringen und entfernen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verwenden Sie eine stumpfe Spritzennadel (20 G), um Löcher in das Gerät basierend auf dem aufgedruckten Muster zu stanzen, gegebenenfalls mit einem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass das Loch durch die andere Seite des Geräts dringt, und verwenden Sie eine Pinzette, um die ausgestanzten Teile zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie ein Deckglas (18 x 18 mm, 0,14 mm dick) gründlich mit Wasser und Seife und dann mit Isopropanol. Verwenden Sie Luftdruck, um das gereinigte Deckglas zu trocknen.</li>
	<li>Legen Sie das gereinigte PDMS und das Deckglas in den Plasmareiniger ein, schließen Sie die Ventile und schalten Sie den Strom, das Vakuum und die Pumpe ein. Lassen Sie den Plasmareiniger etwa eine Minute laufen, stellen Sie den RF auf HI ein und lassen Sie etwas Luft mit dem Feinventil in den Plasmareiniger eindringen.<ol><li>Wenn sich die Farbe des Sichtfensters von lila zu rosa ändert, lassen Sie den Plasmareiniger 50 s lang arbeiten und schalten Sie den RF aus. Lassen Sie die Pumpe eine Minute lang eingeschaltet und öffnen Sie nach dem Ausschalten allmählich das Hauptventil, um Luft in den Plasmareiniger zu lassen. HINWEIS: Eine alternative Methode, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, ist die Wärmeverklebung. Für diese Methode legen Sie die Form auf das Deckglas und legen Sie es für ca. 60 min auf eine auf 70-80 °C eingestellte Heizplatte.</li>
	</ol></li>
	<li>Drücken Sie die PDMS-Oberfläche auf das gereinigte Deckglas und bestätigen Sie, dass sie verbunden sind, indem Sie beim leichten Hochziehen auf dem Deckglas keine Ablösung beachten.</li>
	<li>Befestigen Sie die Nadel einer 90° stumpfen Nadel (18 G) mit einer Zange und ziehen Sie den Kunststoffspritzenstecker ab, um sie zu entfernen. Führen Sie ein Ende der Nadel in ein Tygon-Rohr (0,020" ID, 0,060" OD, siehe Materialtabelle) und das andere Ende in eines der ausgestanzten Löcher des Geräts ein. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Bohrungen.</li>
	<li>Um Luftblasen zu entfernen, injizieren Sie Wasser/Puffer mit einer Glasspritze in die Kanäle (eine Pumpe ist optional, aber hier wurde keine Pumpe verwendet). Filtern Sie alle Flüssigkeiten mit einem 0,22-μm-Filter, bevor Sie sie in das Gerät injizieren.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Blockmittel wie eine 1% ige BSA-Lösung, um die Bindung von fluoreszenzmarkierten AFPs an die PDMS-Wände zu verhindern. Injizieren Sie das Blockmittel in den Einlasskanal und lassen Sie es 20 min in den Mikrokanälen verbleiben. Injizieren Sie dann die Pufferlösung in den Einlasskanal, um die BSA-Lösung auszuspülen. HINWEIS: Das resultierende PDMS-Gerät wird an einem Deckglas entlang seiner Unterseite befestigt, mit Schläuchen in seinen Einlass- und Auslasslöchern verbunden und in seinen Kanälen mit einem Blockiermittel beschichtet.</li>
</ol>2. Einrichtung des mikrofluidischen Geräts
<ol><li>Tragen Sie eine kleine Menge Tauchöl auf die Oberfläche der Kupferkaltstufe auf (siehe Materialtabelle) und verteilen Sie es mit einem fusselfreien Tuch, um eine dünne Ölschicht zu erzeugen. Als nächstes legen Sie eine saubere Saphirscheibe (siehe Materialtabelle) auf die erzeugte Ölschicht. Tragen Sie einen Tropfen Tauchöl auf die Mitte der Saphirscheibe auf und positionieren Sie das PDMS-Gerät so auf dem Tropfen, dass die Merkmale des Geräts über dem Sichtloch der kalten Bühne ausgerichtet sind.</li>
	<li>Halten Sie das Gerät fest und befestigen Sie den Schlauch mit Klebeband an den Außenwänden des Aluminiumkastens, in dem sich die kalte Bühne befindet. Notieren Sie sich die Platzierung jedes spezifischen Röhrchens.</li>
	<li>Injizieren Sie mit einer Glasspritze 4-5 μL AF(G)P-Lösung (siehe Materialtabelle) in den Einlasskanal. Schließen Sie den Deckel der kalten Bühne. HINWEIS: Die Konzentration der AFP-Lösungen kann anhand ihrer Fluoreszenzintensität variiert und entschieden werden. Im vorliegenden Protokoll betrug der Konzentrationsbereich 5-40 μL.</li>
</ol>3. Bildung von Einkristallen in den mikrofluidischen Kanälen
<ol><li>Reinigen Sie die kalte Stufe mit trockener Luft / Stickstoff, um die Bildung von Kondenswasser im Inneren zu verhindern. Aktivieren Sie ein zirkulierendes Kühlbad, um Wasser durch die kalte Stufe zu zirkulieren und als Kühlkörper zu dienen.</li>
	<li>Starten Sie das Temperaturregelprogramm und stellen Sie die Temperatur auf -25 °C ein. HINWEIS: Das Einfrieren tritt auf, wenn die Probe eine Temperatur von ~-20 °C erreicht, was als plötzliches Verdunkeln und Aufrauen der Probe beobachtet werden kann. An dieser Stelle kann jedes Objektiv verwendet werden, vorzugsweise das 4x-Objektiv, das es dem Benutzer ermöglicht, die Gesamtheit der mikrofluidischen Kanäle zu beobachten.</li>
	<li>Langsam nähert man sich durch Erhöhung der Temperatur um ca. 1 °C/5 s dem Schmelzpunkt der Probe, der je nach verwendetem Puffer in der AF(G)P-Lösung zwischen -1 und -0,2 °C liegen kann. Wenn sich die Temperatur dem Schmelzpunkt nähert, warten Sie, bis einige Einkristalle isoliert sind. HINWEIS: Bei Bedarf kann unerwünschtes Eis lokal mit einem IR-Laser (980 nm) geschmolzen werden (siehe Materialtabelle), der am Mikroskop befestigt ist. Der Laser schmilzt in der Nähe von Eiskristallen, solange er eingeschaltet ist.</li>
	<li>An dieser Stelle wird empfohlen, auf 10x- oder 20x-Objektive umzuschalten, um Einkristalle besser beobachten zu können. Nachdem Sie einen Einkristall an der gewünschten Stelle erhalten haben, züchten Sie den Kristall, indem Sie die Temperatur leicht verringern (um ~ 0,01 ° C), bis die Ränder des Kristalls auf die Kanalwände treffen.</li>
	<li>Wechseln Sie zum 50x-Objektiv, injizieren Sie die AF(G)P-Lösung in die Kanäle und beobachten Sie die Zunahme der Fluoreszenzintensität, was darauf hinweist, dass die Proteinlösung erfolgreich in die Kanäle injiziert wurde. Führen Sie diesen Schritt sorgfältig durch, um ein Schmelzen des Eiskristalls während des Lösungsaustauschs zu vermeiden. Überwachen und passen Sie sowohl die Durchflussrate (durch Anlegen von mehr/weniger Druck auf die Glasspritze) als auch die Temperatur während des Lösungsaustauschprozesses genau an.</li>
	<li>Lassen Sie den Proteinen genügend Zeit, sich anzusammeln und an die Kristalloberfläche zu binden. ANMERKUNG: Dies variiert je nach Akkumulations- und Adsorptionsraten des AF(G)P 5,25. In einem typischen Experiment sind 5-10 min für die AFP-Akkumulation erlaubt</li>
</ol>4. Messung der Aktivität der thermischen Hysterese (TH)
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional.
<ol><li>Bestimmen Sie den Schmelzpunkt des Kristalls, indem Sie die Temperatur mit kleinen Schritten von 0,002 °C einstellen und die höchste Temperatur beobachten, der ein kleiner Kristall ausgesetzt werden kann, ohne dass er schmilzt.</li>
	<li>Stellen Sie in der RAMP-Funktion des Temperaturreglers die Kühlrate auf -0,05 bis -0,01 °C/4 s ein und aktivieren Sie den RAMP. Beachten Sie die genaue Temperatur, bei der plötzliches Kristallwachstum auftritt. HINWEIS: Dieser Wert wird als Bersttemperatur bezeichnet und entspricht der Temperatur des Einfrierens. Die Differenz zwischen Schmelz- und Gefriertemperatur beträgt die TH-Aktivität25.</li>
</ol>5. Lösungsaustausch um Einkristalle
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Probentemperatur im TH-Spalt liegt, um das Schmelzen oder Wachstum des Kristalls während des Experiments zu verhindern.</li>
	<li>Zeichnen Sie den Lösungsaustauschprozess mit dem Bildgebungsprogramm NIS Elements (siehe Materialtabelle) für die spätere Fluoreszenzdatenanalyse auf. Injizieren Sie die Pufferlösung langsam in den zweiten Einlass des mikrofluidischen Geräts und beobachten Sie eine Abnahme des Fluoreszenzsignals mit einer Geschwindigkeit, die vom Druck abhängt, der auf die Spritze ausgeübt wird.<ol><li>Verwenden Sie diese visuelle Darstellung, um sicherzustellen, dass der ausgeübte Druck nicht zu hoch ist, um den Kristall nicht schmelzen zu lassen. Abbildung 2 zeigt eine Reihe von Bildern, die den Lösungsaustauschprozess veranschaulichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Messen Sie die Fluoreszenzintensität im mikrofluidischen Kanal mit dem bildgebenden Programm. HINWEIS: Das Signal sollte in der Nähe der Oberfläche des Kristalls seinen Höhepunkt erreichen, was auf eine AFP-Bindung hinweist, und sollte in der umgebenden Lösung, die mit Puffer gespült wurde, relativ niedrig sein.</li>
	<li>Messen Sie die TH-Aktivität nach dem Lösungsaustausch nach Schritt 4.</li>
	<li>Wiederholen Sie das Experiment, indem Sie einen neuen Kristall isolieren (Schritte 3.3-3.5). Injizieren Sie die AFP-Lösung mit einer Glasspritze und wiederholen Sie den Lösungsaustausch (Schritte 5.1-5.3). Gewinnen Sie einen neuen Einkristall (Schritte 3.3-3.5) und fließen Sie die AFP-Lösung mit der Glasspritze in die Kanäle.</li>
</ol>6. Experimente mit Clathrathydraten
<ol><li>Um THF-Hydrate zu erhalten, wird eine THF/Wasser-Lösung mit einem molaren Verhältnis von 1:15 hergestellt, was einem Volumenverhältnis von 1:3,326 entspricht. Dieses Verhältnis sollte in allen Lösungen beibehalten werden, die in den folgenden Experimenten verwendet werden, einschließlich solcher, die AF(G)Ps oder andere Inhibitoren enthalten.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 1 und 2 aus, um das mikrofluidische Gerät vorzubereiten und in die kalte Phase zu stellen. Stellen Sie die Temperatur auf -25 °C ein; Die Probe gefriert bei ~-20 °C, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Nachdem die THF-Lösung gefroren ist, erhöhen Sie langsam die Temperatur, bis das gesamte Eis geschmolzen ist. HINWEIS: Der Schmelzpunkt von Eis wird durch den THF leicht gedrückt.</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass alle Eiskristalle unter Ausschluss der Hydrate schmelzen, halten Sie die Temperatur 3 min lang bei 1 °C.</li>
	<li>Stellen Sie die Temperatur auf -2 °C ein und beobachten Sie die Fülle von Hydraten, die in den mikrofluidischen Kanälen in Abwesenheit von Inhibitoren auftreten. HINWEIS: THF-Hydrate sind als Oktaeder geformt (Abbildung 2), und in einigen Fällen sind die Kristalle sehr dünn; Daher kann eine klare Beobachtung eine Herausforderung darstellen. In diesen Fällen wird empfohlen, die Schritte 6.4-6.5 zu wiederholen, um neue Kristalle zu erhalten.</li>
	<li>Injizieren Sie den AF(G)P/Inhibitor mit der Glasspritze in den mikrofluidischen Kanal, während Sie die Temperatur einstellen, um sicherzustellen, dass die erhaltenen Kristalle nicht schmelzen/wachsen. Warten Sie einige Minuten, bis die Inhibitormoleküle an der Kristalloberfläche adsorbiert haben.</li>
	<li>Messen Sie bei Bedarf die TH-Aktivität nach Schritt 4.</li>
	<li>Tauschen Sie die Lösung um die Kristalle aus, wie in den Schritten 5.2-5.3 beschrieben.</li>
</ol>

<ol>
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Das vorliegende Protokoll wurde entwickelt, um die Kombination von mikrofluidischem Fluss mit mikroskopischen Kristallen zu nutzen, um neue Einblicke in das Kristallwachstum und seine Hemmung zu gewinnen. Eine temperaturgesteuerte Kühlstufe27 mit Millikelvin-Auflösung ermöglicht die Kontrolle einzelner mikroskopischer Kristalle, die sich in mikrofluidischen Kanälen befinden, wodurch der Austausch von Lösungen um sie herum ermöglicht wird. Während die Herstellung von mikrofluidischen Geräten Standard ist und den gängigen Praktiken17,18 ähnelt, ist die Kontrolle über das Wachstum und Schmelzen von Kristallen im Inneren der Vorrichtung einzigartig und neuartig. Die kritischste Komponente in diesem System ist die hervorragende Temperaturregelung, die durch den Einsatz thermoelektrischer Peltier-Kühler, Rückmeldung von einem Thermistor, der sich in der Nähe der Probe befindet, und einen hochauflösenden Temperaturregler, der die Rückkopplungsschleife steuert, erreicht wird.
Ein weiterer kritischer Schritt ist der Lösungsaustausch selbst, da die Kristalle während dieses Prozesses schmelzen oder wachsen können. Daher muss die Temperatur während des Lösungsaustauschs angepasst werden, um Wachstum/Schmelzen zu verhindern. Die Bildung von Kristallen in mikrofluidischen Kanälen stört den Flüssigkeitsfluss und stellt die größte Herausforderung dieses Systems dar; Daher muss das Wachstum dieser Kristalle kontrolliert werden. Hier wurde ein IR-Laser (980 nm) auf das inverse Mikroskop montiert und verwendet, um unerwünschte Eis-/Hydratkristalle lokal zu schmelzen28. Wenn ein solcher Laser nicht verwendet werden kann, können die metallischen Anschlüsse des mikrofluidischen Geräts durch einen zusätzlichen thermoelektrischen Peltier-Kühler erhitzt werden, der das Eis im Einlass / Auslass des Geräts schmilzt.
Die hier beschriebene Methode beinhaltet selbst entwickelte Instrumente (Cold Stage) und erfordert eine Ausbildung, da einige der oben genannten Schritte eine Herausforderung darstellen. Da sich die Konzentration der Lösung, die die Kristalle umgibt, auch dann ändern kann, wenn die Strömung nicht beabsichtigt ist, kann ein einfacher Kalibrierungsschritt5 eine zuverlässige Abschätzung der Konzentration basierend auf dem Fluoreszenzsignal liefern. Eine weitere mögliche Lösung für unerwünschte Strömungen (z.B. bei TH-Messungen) sind mikrofluidische Ventile, die in Referenz4 beschrieben sind.
Dieses System wurde auch verwendet, um das Wachstumsverhalten von D2O-Eis inH2O-Flüssigkeitzu untersuchen, eine Studie, die ein neues Phänomen mikroskopischer, überbackener Eisoberflächen aufdeckte27. Daher kann die Mikrofluidik bei der Untersuchung verschiedener kristalliner Systeme verwendet werden, die gut auf Temperaturänderungen reagieren.

Frostschutzproteine (AFPs) und Frostschutzglykoproteine (AFGPs) schützen verschiedene kälteangepasste Organismen vor Frostschäden1. AFPs und AFGPs (verallgemeinert als AF(G)Ps) hemmen das Wachstum von Eiskristallen, indem sie irreversibel an ihre Oberflächen binden und weiteres Wachstum aufgrund des Gibbs-Thomson-Effekts 2,3,4,5 hemmen. Die resultierende Lücke, die sich zwischen der weitgehend unveränderten Schmelztemperatur und der neu gedrückten Gefriertemperatur bildet, wird als thermische Hysterese (TH) bezeichnet und stellt einen messbaren Parameter dar, der der AFP-Aktivität6 entspricht. Der Einsatz von AFPs zur Hemmung des Eiswachstums hat weitreichende und vielfältige Anwendungen und bietet Verbesserungspotenzial in verschiedenen Bereichen, darunter Kryokonservierung, Tiefkühlkostqualität und Schutz von kälteexponierten Pflanzen.
Die Kristallisation von Wasser bei niedrigen Temperaturen und hohen Drücken in Gegenwart kleiner organischer Moleküle führt zur Bildung von Clathrathydraten (oder Gashydraten), wobei das häufigste Hydrat Methanhydrat7 ist. Die Kristallisation von Methanhydraten in Gas/Öl-Fließleitungen kann zu Stopfen führen, die durch Gaszündung 8,9,10 Explosionen verursachen können. Aktuelle Bemühungen zur Verhinderung der Hydratkristallisation in Fließleitungen umfassen die Verwendung thermodynamischer (Alkohole und Glykole) und kinetischer (hauptsächlich Polymere) Inhibitoren11,12,13,14. Es wurde auch festgestellt, dass AFPs an Clathrathydratkristalle binden und deren Wachstum hemmen, was auf die potenzielle Verwendung von AFPs hinweist, um die Bildung von Pfropfen zu behindern, wodurch eine umweltfreundlichere Lösung bereitgestelltwird 15.
Mikrofluidik ist eine vorherrschende Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von Flüssigkeiten bei winzigen Probenvolumina (bis hinunter zu fL), die durch ein Netzwerk von Mikrokanälen16 fließen. Die Mikrokanäle folgen einem Muster, das auf einem Siliziumwafer (der Form) mittels Lithographie17 erstellt wurde. Ein häufig verwendetes Material zur Herstellung mikrofluidischer Geräte ist Polydimethylsiloxan (PDMS), das kostengünstig und relativ einfach in Forschungslabors zu verarbeiten ist. Das Design der Merkmale (Kanäle) setzt sich im Hinblick auf den spezifischen Zweck des Geräts zusammen; Daher kann es für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich DNA-Sensorik18, medizinische Diagnose19 und Kristallisationsprozesse 3,20,21.
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige mikrofluidische Methode zur Züchtung mikrometergroßer Eis- und Hydratkristalle mit verschiedenen Inhibitoren, einschließlich AFPs und AFGPs. Für diese Experimente wurden Tetrahydrofuran (THF)-Hydrate verwendet, um die Eigenschaften von Methangashydraten22 nachzuahmen, die spezielle Ausrüstung für die Druck- und Temperaturregelung23 erfordern. Fluoreszenzmarkierte AF(G)Ps wurden verwendet, um die Adsorption der Proteine an die Kristalloberfläche zu visualisieren und zu analysieren, und in Verbindung mit der Fluoreszenzbildgebung ermöglichte der mikrofluidische Ansatz die Erzielung von Schlüsselmerkmalen des Bindungsprozesses dieser Moleküle an Kristalloberflächen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

Eine genaue mechanistische Beschreibung der Wasserkristallisation ist eine Herausforderung und erfordert einige Schlüsselelemente: eine hervorragende Temperaturkontrolle, um die Bildung einzelner mikroskopischer Kristalle zu ermöglichen, und ein geeignetes Mikroskopiesystem, das an die kalte Stufe gekoppelt ist. Das hierin beschriebene Verfahren fügt ein weiteres wichtiges Merkmal hinzu, das den Austausch von Lösungen um Eis und Clathrathydratkristalle umfasst. Das beschriebene System umfasst eine Kombination einzigartiger und selbst entwickelter Instrumente, einschließlich Mikrofluidik, hochauflösender Kaltstufen und Fluoreszenzmikroskopie. Die kalte Stufe wurde für mikrofluidische Geräte entwickelt und ermöglicht die Bildung von mikrometergroßen Eis-/Hydratkristallen in mikrofluidischen Kanälen und den Austausch von Lösungen um sie herum. Die Temperaturauflösung und Stabilität der kalten Stufe beträgt ein Millikelvin, das für die Kontrolle des Wachstums dieser kleinen Kristalle entscheidend ist. Dieses vielfältige System wird verwendet, um die verschiedenen Prozesse der Eis- und Hydratkristallisation und den Mechanismus zu untersuchen, durch den das Wachstum dieser Kristalle gehemmt wird. Das Protokoll beschreibt, wie mikrofluidische Geräte hergestellt werden, wie mikroskopisch kleine Kristalle in den mikrofluidischen Kanälen gezüchtet und kontrolliert werden können und wie die Nutzung des Flusses von Flüssigkeiten um Eis- / Hydratkristalle neue Einblicke in die Kristallisation von Wasser ermöglicht.

Lösungsaustausch mit Eiskristallen Ein erfolgreicher Lösungsaustausch um einen Eiskristall ist in Abbildung 3 dargestellt. Der Zeitstempel auf jedem Snapshot zeigt an, dass der Lösungsaustausch relativ schnell war. Ein langsamerer Austausch ist jedoch möglich. Die Fluoreszenzintensität, die von den eisadsorbierten AFGP-Molekülen ausgeht, wird nach Abschluss des Austauschs deutlich beobachtet (Abbildung 3, rechts). Eine quantitative Analyse der AFP-Konzentration auf der Eisoberfläche wird mit einem ROI-Tool (Designated Region of Interest) überwacht (Abbildung 4). In diesem Experiment4 wurde AFP Typ III (QAE-Isoform) verdünnt in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) und 100 mM NaCl verwendet. Die Lösung wird um einen bipyramidalen Kristall ausgetauscht und die Fluoreszenzintensität in der Lösung und auf dem Eis überwacht. Das rote Diagramm, das das Fluoreszenzsignal in der Lösung anzeigt, wird während des Lösungsaustauschs um den Faktor 100 verringert, während das berechnete Signal (grüner Plot) auf der Eisoberfläche konstant bleibt. Das berechnete Signal der eisadsorbierten Moleküle wurde erhalten, indem das von der Lösung kommende Signal (multipliziert mit einer Konstante, die sich auf die Dicke des mikrofluidischen Kanals bezieht) von demvom Eis 4 kommenden Signal subtrahiert wurde.
Lösungsaustausch mit THF-Hydraten Mikrofluidische Experimente mit THF-Hydraten wurden ähnlich wie die Experimente mit Eis durchgeführt. Nachdem die Hydratkristalle die Inhibitormoleküle aus der Lösung adsorbieren durften, wurde eine inhibitorfreie Lösung in die Kanäle injiziert. Abbildung 5 zeigt THF-Hydrate nach Lösungsaustausch mit zwei Arten von Inhibitoren: AFGP1-5, markiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Abbildung 5A) und Safranine O (siehe Tabelle der Materialien), das ein Fluoreszenzfarbstoff26 ist (Abbildung 5B). Dies ist der erste Dämonenstart einer AFGP-Bindung an die Oberfläche eines Clathrathydrats.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der in der vorliegenden Studie verwendeten mikrofluidischen Kanäle. Beide Designs verfügen über zwei Einlässe und einen Auslass. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> Abbildung 2: THF-Hydrate bildeten sich im mikrofluidischen Kanal nach Abkühlung der Temperatur auf ~-2 °C. Die Morphologie aller dargestellten Kristalle ist ein Tetraeder; Einige Kristalle sind jedoch unterschiedlich ausgerichtet. Maßstabsbalken = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> Abbildung 3: Ein repräsentatives Experiment mit Lösungsaustausch um einen einzelnen Eiskristall in einem mikrofluidischen Kanal. Anfangs enthielt die Lösung AFGP1-5 , das mit FITC markiert war, und eisadsorbierte AFGPs wurden nicht beobachtet. Nachdem die Lösung gegen eine AFGP-freie Lösung ausgetauscht wurde, wurden die zuvor an der Eisoberfläche adsorbierten Proteine eindeutig nachgewiesen (Bild rechts). Maßstabsbalken = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Eine quantitative und qualitative Analyse der AFP-Konzentration auf der Eisoberfläche. (A) Ein Eiskristall mit hoher AFP-Lösungskonzentration (vor Lösungsaustausch). (B) Derselbe Kristall, nachdem die AFP-Lösung gegen eine AFP-freie Pufferlösung ausgetauscht wurde. Maßstabsbalken = 20 μm. (C) Quantitative Analyse der Fluoreszenzintensität auf der Eisoberfläche (schwarz) und in der Lösung (rot) während eines Lösungsaustausches. Die grüne Kurve stellt die berechnete Intensität auf der Eisoberfläche dar. Die Figur ist mit Genehmigung von Referenz4 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> Abbildung 5: Einzelne THF-Hydratkristalle in mikrofluidischen Kanälen nach Austausch der Lösung um sie herum (A, AFGP1-5) oder (B,Safranine  O). Das Bild in (B) ist aus Referenz26 wiedergegeben. Maßstabsbalken = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Kristallisation von mikroskopisch kleinen Eiskristallen und Clathrathydraten in mikrofluidischen Geräten, die einen Flüssigkeitsaustausch um die gebildeten Kristalle ermöglichen. Dies bietet beispiellose Möglichkeiten, den Kristallisationsprozess und die Bindungsmechanismen der Inhibitoren zu untersuchen.

Ein mikrofluidischer Ansatz zur Untersuchung der Eis- und Clathrathydratkristallisation

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Dieses Protokoll ist einzigartig, da es dem Benutzer ermöglicht, die Wechselwirkung zwischen löslichen Molekülen und Kristalloberflächen zu untersuchen, zu untersuchen und zu messen. Starke Beweise für eine irreversible Bindung von Frostschutzproteinen an Eis oder erhalten mit dieser Methode. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, das Wachstum von mikrometergroßem Eis zu kontrollieren und Kristalle zu hydratisieren und die Lösung um sie herum kontrolliert auszutauschen.Um zu beginnen, legen Sie die vorbereitete Form in eine Glas-Petrischale, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist. Bereiten Sie dann 30 bis 40 Milliliter der PDMS-Mischung vor, indem Sie eine 1 bis 10 Mischung aus Härter und Elastomer wiegen und etwa fünf Minuten lang kontinuierlich mischen, bis die Mischung weiß und nahezu undurchsichtig erscheint. Als nächstes gießen Sie die PDMS-Mischung in die Petrischale mit der Form und entgasen in einem Exsikkator, bis keine Blasen mehr übrig sind.Backen Sie die Form mit dem flüssigen PDMS im Ofen oder auf einer heißen Platte bei 70 Grad Celsius, bis eine gummiartige Konsistenz erhalten ist. Schneiden Sie dann das Gerät aus, indem Sie die Merkmale mit einem Skalpell nachzeichnen, und achten Sie darauf, mit dem Skalpell nach vorne statt nach unten zu drücken, da die Form zerbrechlich ist. Nachdem Sie das ausgeschnittene PDMS-Gerät entfernt haben, legen Sie es kopfüber in eine neue Petrischale.Mit einer stumpfen Spritze, 20-Gauge-Nadel, stanzen Sie Löcher in das Gerät basierend auf dem aufgedruckten Muster. Führen Sie dann das gereinigte PDMS und das Deckglas in den Plasmareiniger ein. Schließen Sie die Ventile und schalten Sie Strom, Vakuum und Pumpe ein.Lassen Sie den Plasmareiniger etwa eine Minute laufen. Stellen Sie die HF auf hoch und lassen Sie mit dem Feinventil etwas Luft in den Plasmareiniger eindringen. Wenn sich die Farbe des Sichtfensters von lila zu rosa ändert, lassen Sie den Plasmareiniger 50 Sekunden lang arbeiten, um den RF auszuschalten.Lassen Sie die Pumpe eine Minute lang eingeschaltet und öffnen Sie nach dem Ausschalten allmählich das Hauptventil, um Luft in den Plasmareiniger zu lassen. Drücken Sie dann die PDMS-Oberfläche auf das gereinigte Deckglas und bestätigen Sie, dass sie verbunden sind, indem Sie beim leichten Hochziehen auf dem Deckglas keine Ablösung beobachten. Nachdem Sie die Nadel einer 90-Grad-Stumpfnadel mit einer Zange gesichert haben, führen Sie ein Ende der Nadel in ein Tygon-Rohr und das andere Ende in eines der ausgestanzten Löcher des Geräts ein, während Sie den Vorgang für die anderen Löcher wiederholen.Tragen Sie eine kleine Menge Tauchöl auf die Oberfläche der Kupferkaltstufe auf und verteilen Sie es mit einem fusselfreien Wischtuch, um eine dünne Ölschicht zu erzeugen. Als nächstes legen Sie eine saubere Saphirscheibe auf die erzeugte Ölschicht. Tragen Sie dann einen Tropfen Tauchöl auf die Mitte der Saphirscheibe auf und positionieren Sie das PDMS-Gerät so auf dem Tropfen, dass die Merkmale des Geräts über dem Sichtloch der kalten Bühne ausgerichtet sind.Nachdem Sie das Gerät an Ort und Stelle gehalten haben, befestigen Sie den Schlauch an den Außenwänden der Aluminiumbox, in der sich das Klebeband befindet. Injizieren Sie mit einer Glasspritze vier bis fünf Mikroliter Frostschutzproteinlösung in den Einlasskanal und schließen Sie den Deckel der kalten Stufe. Starten Sie das Temperaturregelprogramm und stellen Sie die Temperatur auf minus 25 Grad Celsius ein.Dann erhöhen Sie langsam die Temperatur um etwa ein Grad Celsius pro fünf Sekunden. Nähern Sie sich dem Schmelzpunkt der Probe, der je nach Puffer in der Frostschutzproteinlösung zwischen minus 1 und minus 0,2 Grad Celsius liegen kann. Um Einkristalle besser zu beobachten, wechseln Sie zu 10x- oder 20x-Objektiven.Und nachdem Sie einen Einkristall an der gewünschten Stelle erhalten haben, wachsen Sie den Kristall, indem Sie die Temperatur leicht senken, bis die Enden des Kristalls die Kanalwände treffen. Nach dem Wechsel zum 50x-Objektiv injizieren Sie die Frostschutzproteinlösung in die Kanäle und beobachten Sie die Erhöhung der Fluoreszenzintensität, was darauf hinweist, dass die Proteinlösung erfolgreich in die Kanäle injiziert wurde. Um den Lösungsaustauschprozess aufzuzeichnen, verwenden Sie das NIS-Elements Imaging-Programm, um sicherzustellen, dass der angelegte Druck nicht zu hoch ist, und injizieren Sie die Pufferlösung langsam in den zweiten Einlass des mikrofluidischen Geräts.Beobachten Sie eine Abnahme des Fluoreszenzsignals mit einer Geschwindigkeit, die vom Druck abhängt, der auf die Spritze ausgeübt wird. Um THF-Hydrate nach Herstellung einer THF-Wasserlösung mit einem molaren Verhältnis von 1 zu 15 zu erhalten, injizieren Sie die Lösung in das mikrofluidische Gerät. Nachdem die THF-Wasserlösung gefroren ist, erhöhen Sie langsam die Temperatur, bis das gesamte Eis unter Ausschluss der Hydrate geschmolzen ist, und halten Sie die Temperatur drei Minuten lang bei einem Grad Celsius.Stellen Sie die Temperatur auf minus zwei Grad Celsius ein und beobachten Sie die Fülle von Hydraten, die in den mikrofluidischen Kanälen in Abwesenheit von Inhibitoren auftreten. Dann injizieren Sie das Frostschutzprotein oder den Inhibitor mit der Glasspritze in den mikrofluidischen Kanal, während Sie die Temperatur einstellen, um sicherzustellen, dass die erhaltenen Kristalle nicht schmelzen oder wachsen, und lassen Sie den Inhibitormolekülen einige Minuten, um an der Kristalloberfläche zu adsorbieren. Führen Sie den Lösungsaustausch durch, indem Sie die inhibitorfreie Lösung in den Kanal injizieren.Machen Sie Bilder des Kristalls vor und nach dem Lösungsaustausch und analysieren Sie die Fluoreszenzintensität auf dem Kristall und in der Lösung mit dem Bildgebungsprogramm. Ein erfolgreicher Lösungsaustausch um einen Eiskristall wurde durchgeführt, was darauf hindeutet, dass der Lösungsaustausch relativ schnell war. Ein langsamerer Austausch ist jedoch möglich.Die Fluoreszenzintensität, die von den eisadsorbierten Frostschutz-Glykoproteinmolekülen ausgeht, wurde nach Abschluss des Austauschs deutlich beobachtet. Eine quantitative Analyse der Frostschutzproteinkonzentration wurde überwacht und die Fluoreszenzintensität in der Lösung und auf dem Eis bestimmt, was darauf hindeutet, dass das Fluoreszenzsignal in der Lösung während des Lösungsaustauschs um den Faktor 100 verringert wird, während das berechnete Signal auf der Eisoberfläche konstant bleibt. Es wurden mikrofluidische Experimente mit THF-Hydraten durchgeführt, bei denen eine inhibitorfreie Lösung in die Kanäle injiziert wurde, nachdem die Hydratkristalle die Inhibitormoleküle adsorbieren durften.Die THF-Hydrate wurden nach Lösungsaustausch mit zwei Arten von Inhibitoren beobachtet, einschließlich Frostschutzglykoproteinen, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Safranin O, einem Fluoreszenzfarbstoff, markiert sind. Die kritischen Schritte dieses Verfahrens sind die Bildung und Isolierung eines Einkristalls in den mikrofluidischen Kanälen und der Austausch der Lösung um ihn herum. Diese Methode kann mit anderen Kristallmaterialien verwendet werden, die sehr temperaturempfindlich sind, um den Mechanismus zu verstehen, durch den Inhibitoren mit diesen Kristallen interagieren.Die Fähigkeit, Lösungen um Kristalle herum auszutauschen, ebnete den Forschern den Weg, wichtige Einblicke in den Bindungsmechanismus von Frostschutzproteinen zu gewinnen und ein neues Phänomen des Isotopeneffekts auf das Eiswachstum zu entdecken.

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW-betriebenen Novel Nanoliter Osmometer für Ice Binding Protein Untersuchungen

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Forschung

Chemie

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Die kovalente Bindung von BMP-2 auf Oberflächen mit einem selbstorganisierten Monoschicht-Ansatz

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

Eine inverse Analyse Ansatz zur Charakterisierung von chemischen Transport in Farben

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Mikrofluidik Pneumatische Käfige: Ein neuer Ansatz für In-Chip-Kristall-Trapping, Manipulation und Steuerung chemischer Behandlung

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Sulfate Trennung durch selektive Kristallisation mit einer Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Mikrofluidische trocken-Spinnen und Charakterisierung von regenerierten Seide Fibroin Fasern

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Synthesen, Kristallisation und spektroskopische Charakterisierung von 3,5-Lutidine- N-Oxid zu entwässern

The synthesis of 3,5-lutidine N-oxide dehydrate, 1, was achieved in the synthesis route of 2-amino-pyridine-3,5-dicarboxylic acid. Ochiai first used the ...