Name: a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization at JoVE.com

Giverne av American Chemical Society Petroleum Research Fund gis en bekreftelse på støtte til denne forskningen (Grant number 60191-UNI5). Forfatterne vil gjerne takke prof. Ido Braslavsky for banebrytende bruk av mikrofluidiske enheter for å studere frostvæskeproteiner og is. Forfatterne er takknemlige for prof. Arthur DeVries, prof. Konrad Meister og prof. Peter Davies for å gi frostvæskeproteinprøver.

1. Mikrofluidisk enhetsfabrikasjon
<ol><li>Dekk innsiden av en petriskål med aluminiumsfolie og legg den ferdig tilberedte formen i petriskålen.<ol><li>Fremstill formene ved hjelp av litografiteknikkene beskrevet i referanser. De to enhetsdesignene som brukes i det foreliggende arbeidet er avbildet i figur 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered 30-40 ml av PDMS-blandingen ved å veie en 1:10 (etter vekt) blanding av herdemiddelet og elastomeren (se Materialfortegnelse) og bland kontinuerlig i ca. 5 minutter til blandingen virker hvit og nesten ugjennomsiktig. MERK: Plasser en plastkopp på veieskalaen, hell elastomeren i koppen, og tilsett deretter herdemiddelet for å oppnå et vektforhold på 1:10.</li>
	<li>Hell PDMS-blandingen i petriskålen med formen og degaene i en tørkemiddel til det ikke er noen bobler igjen (ca. 30 min).</li>
	<li>Stek formen med flytende PDMS i en ovn eller på en kokeplate ved 70 °C til en gummilignende konsistens er oppnådd. Denne prosessen tar omtrent en time.</li>
	<li>Klipp enheten ut ved å spore rundt funksjonene med en skalpell, og pass på å skyve fremover med skalpellen i stedet for ned siden formen er skjør. Fjern den utskårne PDMS-enheten, og plasser den opp-ned i en ny petriskål. Fjern støv og smusspartikler fra bunnoverflaten ved å feste og fjerne et stykke tape (se Materialfortegnelse).</li>
	<li>Bruk en stump sprøytekanyle (20 G) for å slå ut hull i enheten basert på det trykte mønsteret, ved hjelp av et mikroskop om nødvendig. Forsikre deg om at hullet trenger gjennom den andre siden av enheten, og bruk pinsett for å fjerne de utstansede bitene.</li>
	<li>Vask grundig en deksel (18 x 18 mm, 0,14 mm tykk) med vann og såpe, og deretter med isopropanol. Bruk lufttrykk til å tørke det rensede dekselet.</li>
	<li>Sett den rensede PDMS og dekselet inn i plasmarenseren, lukk ventilene og slå på strøm, vakuum og pumpe. La plasmarenseren gå i omtrent et minutt, sett RF til HI, og la litt luft komme inn i plasmarenseren ved hjelp av den fine ventilen.<ol><li>Når visningsvinduets farge endres fra lilla til rosa, la plasmarenseren jobbe i 50 s og slå av RF-en. Hold pumpen på i et minutt, og etter at du har slått den av, åpner du gradvis hovedventilen for å slippe luft inn i plasmarenseren. MERK: En alternativ metode for å oppnå sammenlignbare resultater er varmebinding. For denne metoden, legg formen på dekselet og legg den på en kokeplate satt til 70-80 ° C i ca. 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Trykk PDMS-overflaten på den rengjorte dekselet og bekreft at de er bundet ved å observere ingen løsrivelse når du trekker litt opp på dekselet.</li>
	<li>Fest kanylen på en 90° butt nål (18 G) med en tang og trekk av plastsprøytekoblingen for å fjerne den. Sett den ene enden av kanylen inn i et Tygon-rør (0,020" ID, 0,060" OD, se Materialfortegnelse) og den andre enden i et av de utstansede hullene på enheten. Gjenta prosessen for de andre hullene.</li>
	<li>For å fjerne luftbobler, injiser vann/buffer i kanalene med en glasssprøyte (en pumpe er valgfritt, men ingen pumpe ble brukt her). Filtrer alle væsker med et 0,22 μm filter før du injiserer dem i enheten.</li>
	<li>Bruk et blokkeringsmiddel som en 1% BSA-løsning for å forhindre binding av fluorescensmerkede AFPer på PDMS-veggene. Injiser blokkeringsmiddelet i innløpskanalen og la det forbli i mikrokanalene i 20 minutter. Injiser deretter bufferløsningen i innløpskanalen for å skylle ut BSA-oppløsningen. MERK: Den resulterende PDMS-enheten er festet til en deksel langs bunnoverflaten, koblet til rør i innløps- og utløpshullene, og belagt med et blokkeringsmiddel i kanalene.</li>
</ol>2. Sette opp den mikrofluidiske enheten
<ol><li>Påfør en liten mengde nedsenkningsolje på overflaten av kobberkulden (se Materialfortegnelse) og spred den med en lofri klut for å lage et tynt lag olje. Deretter plasserer du en ren safirskive (se materialfortegnelse) på det opprettede oljelaget. Påfør en dråpe nedsenkningsolje på midten av safirskiven og plasser PDMS-enheten på dråpen slik at funksjonene til enheten er justert over visningshullet i kuldetrinnet.</li>
	<li>Hold enheten på plass og fest slangen til ytterveggene på aluminiumsboksen som inneholder det kalde stadiet ved hjelp av tape. Noter plasseringen av hvert enkelt rør.</li>
	<li>Bruk en glasssprøyte til å injisere 4-5 μL AF(G)P oppløsning (se Materialfortegnelse) i innløpskanalen. Lukk lokket på det kalde stadiet. MERK: Konsentrasjonen av AFP-løsningene kan varieres og bestemmes basert på deres fluorescensintensitet. I denne protokollen var konsentrasjonsområdet 5-40 μL.</li>
</ol>3. Dannelse av enkeltkrystaller i mikrofluidiske kanaler
<ol><li>Rens det kalde stadiet med tørr luft/nitrogen for å forhindre at det dannes kondens inne i det. Aktiver et sirkulerende kjølebad for å sirkulere vann gjennom det kalde stadiet og fungere som en kjøleribbe.</li>
	<li>Start temperaturkontrollprogrammet og sett temperaturen til -25 °C. MERK: Frysing vil skje når prøven når en temperatur på ~-20 °C, som kan observeres som en plutselig mørkning og grovhet av prøven. Ethvert mål kan brukes på dette punktet, helst 4x-målet, som gjør det mulig for brukeren å observere helheten av de mikrofluidiske kanalene.</li>
	<li>Sakte, øker temperaturen med ca. 1 °C/5 s, nærmer du seg prøvens smeltepunkt, som kan variere fra -1 til -0,2 °C, avhengig av bufferen som brukes i AF(G)P-løsningen. Når temperaturen nærmer seg smeltepunktet, vent til noen få enkeltkrystaller er isolert. MERK: Om nødvendig kan uønsket is smeltes lokalt ved hjelp av en IR-laser (980 nm) (se Materialtabell), som er festet på mikroskopet. Laseren smelter nærliggende iskrystaller så lenge den er på.</li>
	<li>På dette tidspunktet anbefales det å bytte til 10x eller 20x mål for bedre å observere enkeltkrystaller. Etter å ha oppnådd en enkelt krystall på ønsket sted, vokser krystallet ved å redusere temperaturen litt (med ~ 0,01 ° C) til krystallens kanter møter kanalveggene.</li>
	<li>Bytt til 50x-målet, injiser AF (G) P-løsningen i kanalene, og observer fluorescensintensitetsøkningen, noe som indikerer at proteinoppløsningen ble injisert i kanalene. Utfør dette trinnet nøye for å unngå smelting av iskrystallen under utveksling av løsninger. Overvåk og juster både strømningshastigheten nøye (ved å påføre mer/mindre trykk på glasssprøyten) og temperaturen under løsningsutvekslingsprosessen.</li>
	<li>La proteinene få nok tid til å samle seg og binde seg til krystalloverflaten. MERK: Dette varierer basert på akkumulerings- og adsorpsjonshastighetene til AF(G)P 5,25. I et typisk eksperiment er 5-10 min tillatt for AFP-akkumulering</li>
</ol>4. Termisk hysterese (TH) aktivitetsmåling
MERK: Dette trinnet er valgfritt.
<ol><li>Bestem krystallens smeltepunkt ved å justere temperaturen med små trinn på 0,002 °C og observere den høyeste temperaturen som en liten krystall kan utsettes for uten at den smelter.</li>
	<li>På RAMP-funksjonen til temperaturregulatoren stiller du kjølehastigheten til -0,05 til -0,01 °C/4 s og aktiverer RAMP . Legg merke til den nøyaktige temperaturen der plutselig krystallvekst oppstår. MERK: Denne verdien kalles burst temperatur og tilsvarer temperaturen på frysing. Forskjellen mellom smelte- og frysetemperaturer er TH-aktiviteten25.</li>
</ol>5. Løsningsutveksling rundt enkeltkrystaller
<ol><li>Sørg for at prøvetemperaturen er i TH-gapet for å forhindre smelting eller vekst av krystallet under forsøket.</li>
	<li>Registrer løsningsutvekslingsprosessen ved hjelp av NIS Elements bildebehandlingsprogram (se Materialtabell) for senere fluorescensdataanalyse. Injiser bufferløsningen sakte inn i det andre innløpet til den mikrofluidiske enheten, og observer en reduksjon i fluorescerende signal med en hastighet som avhenger av trykket som påføres sprøyten.<ol><li>Bruk denne visuelle representasjonen for å sikre at det påførte trykket ikke er for høyt for ikke å få krystallet til å smelte. Se figur 2 for en sekvens med bilder som demonstrerer løsningsutvekslingsprosessen.</li>
	</ol></li>
	<li>Mål fluorescensintensiteten i den mikrofluidiske kanalen ved hjelp av bildebehandlingsprogrammet. MERK: Signalet skal toppe i regionen nær overflaten av krystallet, noe som indikerer AFP-binding, og bør være relativt lavt i den omkringliggende løsningen, som har blitt spylt med buffer.</li>
	<li>Mål TH-aktiviteten etter løsningsutvekslingen etter trinn 4.</li>
	<li>Gjenta eksperimentet ved å isolere en ny krystall (trinn 3,3-3,5). Injiser AFP-oppløsningen med en glasssprøyte og gjenta oppløsningsutvekslingen (trinn 5.1-5.3). Få en ny enkeltkrystall (trinn 3.3-3.5) og flyt AFP-løsningen inn i kanalene ved hjelp av glasssprøyten.</li>
</ol>6. Eksperimenter med clathrate hydrater
<ol><li>For å oppnå THF-hydrater, lag en THF / vannløsning med et molforhold på 1:15, som er et volumforhold på 1: 3,326. Oppretthold dette forholdet i alle oppløsninger som brukes i følgende forsøk, inkludert de som inneholder AF(G)Ps eller andre hemmere.</li>
	<li>Følg trinn 1 og 2 for å klargjøre den mikrofluidiske enheten og plassere den i det kalde stadiet. Sett temperaturen til -25 °C; prøven fryser ved ~-20 °C som beskrevet i trinn 3.2.</li>
	<li>Etter at THF-løsningen er frosset, øker temperaturen sakte til all isen har smeltet. MERK: Smeltepunktet for is trykkes litt ned av THF.</li>
	<li>For å sikre at alle iskrystallene smeltet ved utelukkelse av hydratene, hold temperaturen på 1 ° C i 3 minutter.</li>
	<li>Sett temperaturen til -2 ° C og observer overflod av hydrater som vises i mikrofluidiske kanaler i fravær av hemmere. MERK: THF-hydrater er formet som oktaeder (figur 2), og i noen tilfeller er krystallene veldig tynne; Dermed kan klar observasjon være utfordrende. I disse tilfellene anbefales det å gjenta trinn 6,4-6,5 for å oppnå nye krystaller.</li>
	<li>Injiser AF(G)P/inhibitoren i den mikrofluidiske kanalen ved hjelp av glasssprøyten mens temperaturen justeres for å sikre at de oppnådde krystallene ikke smelter/vokser. La det gå noen minutter for inhibitormolekylene å adsorbere til krystalloverflaten.</li>
	<li>Om nødvendig måler du TH-aktiviteten etter trinn 4.</li>
	<li>Bytt løsningen rundt krystallene som beskrevet i trinn 5.2-5.3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-Binding+Proteins+and+Their+Function.">Ice-Binding Proteins and Their Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).</li><li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+are+antifreeze+proteins+in+solution+essential+for+ice+growth+inhibition.">When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition.</a> Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).</li><li>Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+glycoproteins+bind+irreversibly+to+ice.">Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).</li><li>Braslavsky, I., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LabVIEW-operated+Novel+Nanoliter+Osmometer+for+Ice+Binding+Protein+Investigations.">LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).</li><li>Ruppel, C. D., Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+climate+change+and+methane+hydrates.">The interaction of climate change and methane hydrates.</a> Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).</li><li>Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alcohols+and+diols+on+PVCap-induced+hydrate+crystal+growth+patterns+in+methane+systems.">Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems.</a> Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).</li><li>Sa, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+methane+and+natural+gas+hydrate+formation+by+altering+the+structure+of+water+with+amino+acids.">Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids.</a> Scientific Reports. 6, 31582 (2016).</li><li>Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+kinetic+inhibitors+for+natural+gas+hydrates.">Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates.</a> Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).</li><li>Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Inhibition+of+Gas+Hydrates+by+&#945;-Helical+Antifreeze+Proteins.">Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by &#945;-Helical Antifreeze Proteins.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antifreeze+proteins+on+the+nucleation,+growth,+and+the+memory+effect+during+tetrahydrofuran+clathrate+hydrate+formation.">Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tetrahydrofuran+clathrate-hydrate+formation+with+antifreeze+protein.">The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein.</a> Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).</li><li>Walker, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+as+gas+hydrate+inhibitors.">Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors.</a> Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).</li><li>Gordienko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+green+hydrate+inhibitor:+imaging+antifreeze+proteins+on+clathrates.">Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates.</a> PloS One. 5 (2), 8953 (2010).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+generation+using+a+polydimethylsiloxane+(PDMS)+co-axial+flow+focus+device.">Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).</li><li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing:+An+overview.">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview.</a> Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).</li><li>Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+diagnostic+microfluidics.">Advances in diagnostic microfluidics.</a> Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).</li><li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography.">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).</li><li>Haleva, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cold-finger+device+for+the+investigation+of+ice-binding+proteins.">Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins.</a> Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).</li><li>Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THF+hydrates+as+model+systems+for+natural+gas+hydrates:+Comparing+their+mechanical+and+vibrational+properties.">THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties.</a> Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).</li><li>Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+crystallization+kinetics+of+methane+(sI)+hydrate+in+a+thermoelectrically-cooled+microreactor.">Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+that+accumulate+on+different+ice+crystal+planes+produce+distinct+thermal+hysteresis+dynamics.">Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).</li><li>Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption-inhibition+of+clathrate+hydrates+by+self-assembled+nanostructures.">Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures.</a> ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).</li><li>Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v., Ward, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+unsteady+morphologies+at+ice+interfaces+driven+by+D2O-H2O+exchange.">Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).</li><li>Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+growth+acceleration+by+antifreeze+proteins+leads+to+higher+thermal+hysteresis+activity.">Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity.</a> Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).</li></ol>

Denne protokollen ble designet for å utnytte kombinasjonen av mikrofluidisk strømning med mikroskopiske krystaller for å avsløre ny innsikt i krystallvekst og dens inhibering. Et temperaturkontrollert kuldetrinn27 med millikelvinoppløsning muliggjør kontroll av enkeltmikroskopiske krystaller som ligger inne i mikrofluidiske kanaler, og tillater dermed utveksling av løsninger rundt dem. Mens fabrikasjon av mikrofluidiske enheter er standard og ligner på vanlig praksis17,18, er kontrollen over vekst og smelting av krystaller inne i enheten unik og ny. Den mest kritiske komponenten i dette systemet er den suverene temperaturkontrollen, som oppnås ved å bruke Peltier termoelektriske kjølere, tilbakemelding fra en termistor som ligger nær prøven, og en høyoppløselig temperaturregulator som styrer tilbakemeldingssløyfen.
Et annet kritisk skritt er selve løsningsutvekslingen, da krystallene kan smelte eller vokse under denne prosessen; Temperaturen må derfor justeres under løsningsutvekslingen for å hindre vekst/smelting. Dannelsen av krystaller i mikrofluidiske kanaler forstyrrer væskestrømmen og utgjør hovedutfordringen i dette systemet; Dermed må veksten av disse krystallene kontrolleres. Her ble en IR-laser (980 nm) montert på det inverterte mikroskopet og ble brukt til å lokalt smelte uønsket is / hydratkrystaller28. Hvis en slik laser ikke kan brukes, kan metallkontaktene til den mikrofluidiske enheten oppvarmes av en ekstra Peltier termoelektrisk kjøler, som vil smelte isen i innløpet / utløpet til enheten.
Metoden beskrevet her inkluderer hjemmeutviklede instrumenter (cold stage) og krever trening, da noen av de ovennevnte trinnene er utfordrende. Siden konsentrasjonen av løsningen som omgir krystallene kan endres selv når strømmen ikke er ment, kan et enkelt kalibreringstrinn5 gi en pålitelig estimering av konsentrasjonen basert på fluorescenssignalet. En annen mulig løsning på uønsket strømning (for eksempel under TH-målinger) er mikrofluidiske ventiler, som er beskrevet i referanse4.
Dette systemet ble også brukt til å utforske vekstoppførselen til D 2O-is i H2O-væske, en studie som avslørte et nytt fenomen med mikroskopiske, kamskjellede isflater27. Dermed kan mikrofluidikk brukes i studiet av forskjellige krystallinske systemer som reagerer godt på temperaturendringer.

Frostvæskeproteiner (AFPs) og frostvæskeglykoproteiner (AFGPs) beskytter ulike kuldetilpassede organismer mot frostskader1. AFPs og AFGPs (generalisert som AF (G) Ps) hemmer veksten av iskrystaller ved å binde seg irreversibelt til overflatene og hemme ytterligere vekst på grunn av Gibbs-Thomson-effekten 2,3,4,5. Det resulterende gapet som dannes mellom smeltetemperaturen, som i stor grad er uendret, og den nylig deprimerte frysetemperaturen kalles termisk hysterese (TH) og representerer en målbar parameter som tilsvarer AFP-aktivitet6. Bruken av AFP for å hemme isvekst har vidtrekkende og varierte applikasjoner, og tilbyr potensiell forbedring på ulike felt, inkludert kryopreservering, frossen matkvalitet og beskyttelse av kaldt eksponerte avlinger.
Krystalliseringen av vann ved lave temperaturer og høyt trykk i nærvær av små organiske molekyler resulterer i dannelse av clathrathydrater (eller gasshydrater), hvor det mest omfattende hydratet er metanhydrat7. Krystallisering av metanhydrater i gass / oljerørledninger kan forårsake plugger, noe som kan forårsake eksplosjoner på grunn av gassantennelse 8,9,10. Nåværende innsats for å forhindre hydratkrystallisering i strømningsrør inkluderer bruk av termodynamiske (alkoholer og glykoler) og kinetiske (hovedsakelig polymerer) hemmere11,12,13,14. AFP har også vist seg å binde seg til clathrate hydratkrystaller og hemme veksten, noe som peker på potensiell bruk av AFP for å hindre dannelsen av plugger, og dermed gi en grønnere løsning15.
Mikrofluidikk er en utbredt metode som brukes til å studere egenskapene til væsker ved små prøvevolumer (ned til fL) som strømmer gjennom et nettverk av mikrokanaler16. Mikrokanalene følger et mønster opprettet på en silisiumskive (formen) ved hjelp av litografi17. Et vanlig materiale for å fremstille mikrofluidiske enheter er polydimetylsiloksan (PDMS), som er billig og relativt enkelt å jobbe med i forskningslaboratorier. Utformingen av funksjonene (kanalene) er sammensatt med hensyn til det spesifikke formålet med enheten; dermed kan den brukes til en rekke applikasjoner, inkludert DNA-sensing18, medisinsk diagnose19 og krystalliseringsprosesser 3,20,21.
Denne protokollen beskriver en unik mikrofluidisk metode for dyrking av is- og hydratkrystaller på mikronstørrelse med forskjellige hemmere, inkludert AFP og AFGP. For disse forsøkene ble tetrahydrofuran (THF) hydrater brukt til å etterligne egenskapene til metangasshydrater22, som krever spesialutstyr for trykk og temperaturkontroll23. Fluorescerende merket AF (G) Ps ble brukt til å visualisere og analysere adsorpsjonen av proteinene til krystalloverflaten, og kombinert med fluorescerende avbildning tillot den mikrofluidiske tilnærmingen oppnåelse av nøkkelegenskaper ved bindingsprosessen av disse molekylene til krystalloverflater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

En nøyaktig mekanistisk beskrivelse av vannkrystallisering er utfordrende og krever noen få nøkkelelementer: suveren temperaturkontroll for å tillate dannelse av enkeltmikroskopiske krystaller og et passende mikroskopisystem koblet til det kalde stadiet. Metoden beskrevet her legger til en annen viktig funksjon som inkluderer utveksling av løsninger rundt is og clathrate hydratkrystaller. Det beskrevne systemet består av en kombinasjon av unike og hjemmeutviklede instrumenter, inkludert mikrofluidikk, høyoppløselige kalde stadier og fluorescensmikroskopi. Det kalde stadiet ble designet for mikrofluidiske enheter og muliggjør dannelse av is- / hydratkrystaller av mikronstørrelse inne i mikrofluidiske kanaler og utveksling av løsninger rundt dem. Temperaturoppløsningen og stabiliteten til det kalde stadiet er en millikelvin, noe som er avgjørende for å kontrollere veksten av disse små krystallene. Dette mangfoldige systemet brukes til å studere de forskjellige prosessene for is- og hydratkrystallisering og mekanismen der veksten av disse krystallene hemmes. Protokollen beskriver hvordan man tilbereder mikrofluidiske enheter, hvordan man dyrker og kontrollerer mikroskopiske krystaller i de mikrofluidiske kanalene, og hvordan utnyttelsen av væskestrømmen rundt is / hydratkrystaller gir ny innsikt i krystallisering av vann.

Løsningsutveksling med iskrystaller En vellykket løsningsutveksling rundt en iskrystall er presentert i figur 3. Tidsstempelet på hvert øyeblikksbilde indikerer at løsningsutvekslingen var relativt rask; En langsommere utveksling er imidlertid mulig. Fluorescensintensiteten som kommer fra de isadsorberte AFGP-molekylene, observeres tydelig etter at utvekslingen er fullført (figur 3, til høyre). En kvantitativ analyse av AFP-konsentrasjonen på isoverflaten overvåkes ved hjelp av et verktøy for utpekt interesseområde (ROI) (figur 4). I dette eksperimentet4 ble AFP type III (QAE isoform) fortynnet i 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) og 100 mM NaCl brukt. Løsningen utveksles rundt en bipyramidalformet krystall, og fluorescensintensiteten i løsningen og på isen overvåkes. Det røde plottet som indikerer fluorescenssignalet i løsningen reduseres med en faktor på 100 under løsningsutvekslingen, mens det beregnede signalet (grønt plott) på isoverflaten forblir konstant. Det beregnede signalet til de isadsorberte molekylene ble oppnådd ved å trekke signalet som kommer fra løsningen (multiplisert med en konstant som relaterer seg til tykkelsen på den mikrofluidiske kanalen) fra signalet som kommer fra isen4.
Løsningsutveksling med THF-hydrater Mikrofluidiske eksperimenter med THF-hydrater ble utført på samme måte som forsøkene med is. Etter at hydratkrystallene fikk adsorbere inhibitormolekylene fra løsningen, ble en inhibitorfri løsning injisert i kanalene. Figur 5 presenterer THF-hydrater etter løsningsutveksling med to typer hemmere: AFGP1-5 merket med fluoresceinisotiocyanat (FITC) (figur 5A) og safranine O (se materialtabell), som er et fluorescensfargestoff26 (figur 5B). Dette er den første demonstartionen av en AFGP-binding til overflaten av et clathrathydrat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> Figur 1: En skjematisk fremstilling av de mikrofluidiske kanalene som ble brukt i denne studien. Begge designene inkluderer to innløp og ett uttak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> Figur 2: THF-hydrater dannet i den mikrofluidiske kanalen etter at temperaturen ble avkjølt til ~-2 °C. Morfologien til alle krystaller som presenteres er en tetraeder; Noen krystaller er imidlertid orientert annerledes. Skala bar = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> Figur 3: Et representativt eksperiment som viser løsningsutveksling rundt en enkelt iskrystall i en mikrofluidisk kanal. I utgangspunktet inneholdt løsningen AFGP1-5 merket med FITC, og isadsorberte AFGP-er ble ikke observert. Etter at løsningen ble byttet ut med en AFGP-fri løsning, ble proteinene som tidligere hadde blitt adsorbert til isoverflaten tydelig oppdaget (bilde til høyre). Skala bar = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> Figur 4: En kvantitativ og kvalitativ analyse av AFP-konsentrasjonen på isoverflaten. (A) En iskrystall ved høy AFP-løsningskonsentrasjon (før løsningsutveksling). (B) Den samme krystallen etter at AFP-løsningen ble byttet ut med en AFP-fri bufferløsning. Skalalinje = 20 μm. (C) Kvantitativ analyse av fluorescensintensiteten på isoverflaten (svart) og i løsningen (rød) under en løsningsutveksling. Den grønne kurven representerer den beregnede intensiteten på isoverflaten. Figuren er tilpasset med tillatelse fra referanse4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> Figur 5: Enkle THF-hydratkrystaller i mikrofluidiske kanaler etter at løsningen rundt dem (A, AFGP1-5) eller (B,Safranine  O) ble utvekslet. Bildet i (B) er gjengitt fra referanse26. Skala bar = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization at JoVE.com

A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

Denne protokollen beskriver krystallisering av mikroskopiske iskrystaller og clathrate hydrater i mikrofluidiske enheter, noe som muliggjør væskeutveksling rundt de dannede krystallene. Dette gir enestående muligheter til å undersøke krystallisasjonsprosessen og bindingsmekanismene til inhibitorene.

En mikrofluidisk tilnærming for studier av is og koagulathydratkrystallisering

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Denne protokollen er unik fordi den lar brukeren studere og undersøke og måle samspillet mellom løselige molekyler og krystalloverflater. Sterke bevis for irreversibel binding av frostvæskeproteiner til is eller oppnådd ved bruk av denne metoden. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å kontrollere veksten av is- og hydratkrystaller av mikronstørrelse og utveksle løsningen rundt dem på en kontrollert måte.For å begynne, legg den ferdig forberedte formen i en glasspetriskål dekket med aluminiumsfolie. Tilbered deretter 30 til 40 ml av PDMS-blandingen ved å veie en 1 til 10 blanding av herdemiddelet og elastomeren og blande kontinuerlig i omtrent fem minutter til blandingen virker hvit og nesten ugjennomsiktig. Hell deretter PDMS-blandingen i petriskålen med formen og degaene i en tørkemiddel til ingen bobler forblir.Stek formen med flytende PDMS i en ovn eller på en kokeplate ved 70 grader Celsius til en gummilignende konsistens er oppnådd. Klipp deretter enheten ut ved å spore rundt funksjonene med en skalpell, og pass på å skyve fremover med skalpellen i stedet for ned, siden formen er skjør. Etter å ha fjernet den utskårne PDMS-enheten, legg den opp ned i en ny petriskål.Bruk en stump sprøyte, 20 gauge nål, slå ut hull i enheten basert på det påtrykte mønsteret. Sett deretter den rensede PDMS og dekselet inn i plasmarenseren. Lukk ventilene og slå på strøm, vakuum og pumpe.La plasmarenseren kjøre i omtrent et minutt. Sett RF til høy og la litt luft komme inn i plasmarenseren ved hjelp av den fine ventilen. Når fargen på visningsvinduene endres fra lilla til rosa, la plasmarenseren virke i 50 sekunder for å slå av RF-en.Hold pumpen på i et minutt, og etter at du har slått den av, åpner du gradvis hovedventilen for å slippe luft inn i plasmarenseren. Trykk deretter PDMS-overflaten på den rensede dekselet og bekreft at de er bundet ved å observere ingen løsrivelse når du trekker litt opp på dekselet. Etter å ha sikret nålen på en 90 grader stump nål med en tang, sett den ene enden av nålen inn i et Tygon-rør og den andre enden i et av de stansede hullene på enheten mens du gjentar prosessen for de andre hullene.Påfør en liten mengde nedsenkningsolje på overflaten av kobberkulden og spred den med en lofri klut for å lage et tynt lag olje. Plasser deretter ren safirskive på det opprettede oljelaget. Påfør deretter en dråpe nedsenkningsolje på midten av safirskiven og plasser PDMS-enheten på dråpen slik at funksjonene til enheten er justert over visningshullet i kuldetrinnet.Etter å ha holdt enheten på plass, fest slangen til ytterveggene på aluminiumsboksen som inneholder tape. Bruk en glasssprøyte til å injisere fire til fem mikroliter frostvæskeproteinoppløsning i innløpskanalen og lukk lokket på det kalde stadiet. Start temperaturkontrollprogrammet og sett temperaturen til minus 25 grader Celsius.Deretter øker temperaturen sakte med omtrent en grad Celsius per fem sekunder. Tilnærming til prøvesmeltepunktet, som kan variere fra minus 1 til minus 0, 2 grader Celsius, avhengig av bufferen som brukes i frostvæskeproteinoppløsningen. For bedre å observere enkeltkrystaller, bytt til 10x eller 20x mål.Og etter å ha oppnådd en enkelt krystall på ønsket sted, vokser krystallet ved å redusere temperaturen litt til endene av krystallet møter kanalveggene. Etter å ha byttet til 50x-målet, injiser frostvæskeproteinoppløsningen i kanalene og observer fluorescensintensitetsøkningen, noe som indikerer at proteinoppløsningen ble injisert i kanalene. For å registrere løsningsutvekslingsprosessen, bruk NIS-Elements Imaging Program, sørg for at det påførte trykket ikke er for høyt og injiser bufferløsningen sakte inn i det andre innløpet til den mikrofluidiske enheten.Vær oppmerksom på en reduksjon i fluorescerende signal med en hastighet som avhenger av trykket som påføres sprøyten. For å oppnå THF-hydrater etter fremstilling av en THF-vannløsning med et molforhold på 1 til 15, injiser løsningen i den mikrofluidiske enheten. Etter at THF-vannløsningen er frosset, øk temperaturen sakte til all isen har smeltet ved utelukkelse av hydratene og hold temperaturen på en grad Celsius i tre minutter.Sett temperaturen til minus to grader Celsius og observer overflod av hydrater som vises i mikrofluidiske kanaler i fravær av inhibitorer. Injiser deretter frostvæskeproteinet eller inhibitoren i den mikrofluidiske kanalen ved hjelp av glasssprøyten mens du justerer temperaturen for å sikre at de oppnådde krystallene ikke smelter eller vokser og la noen få minutter for inhibitormolekylene å adsorbere til krystalloverflaten. Utfør løsningsutvekslingen ved å injisere den inhibitorfrie oppløsningen i kanalen.Ta bilder av krystallet før og etter løsningsutvekslingen og analyser fluorescensintensiteten på krystallet og i løsningen ved hjelp av bildebehandlingsprogrammet. En vellykket løsningsutveksling rundt en iskrystall ble utført som indikerte at løsningsutvekslingen var relativt rask. Imidlertid er en langsommere utveksling mulig.Fluorescensintensiteten som kommer fra de isadsorberte frostvæskeglykoproteinmolekylene ble tydelig observert etter at utvekslingen var fullført. En kvantitativ analyse av frostvæskeproteinkonsentrasjonen ble overvåket og fluorescensintensiteten ble bestemt i løsningen og på isen, noe som indikerer at fluorescenssignalet i løsningen reduseres med en faktor på 100 under løsningsutvekslingen, mens det beregnede signalet på isoverflaten forblir konstant. Mikrofluidiske eksperimenter med THF-hydrater ble utført der en inhibitorfri løsning ble injisert i kanalene etter at hydratkrystallene fikk adsorbere inhibitormolekylene.THF-hydratene ble observert etter oppløsningsutveksling med to typer hemmere, inkludert frostvæskeglykoproteiner merket med fluoresceinisotiocyanat og Safranin O, et fluorescerende fargestoff. De kritiske trinnene i denne prosedyren er dannelsen og isoleringen av en enkelt krystall i de mikrofluidiske kanalene og utvekslingen av løsningen rundt den. Denne metoden kan brukes med andre krystallmaterialer som er svært temperaturfølsomme, i et forsøk på å forstå mekanismen der inhibitorer interagerer med disse krystallene.Evnen til å utveksle løsninger rundt krystaller banet vei for forskere å identifisere nøkkelinnsikt i bindingsmekanismen til frostvæskeproteiner og å oppdage et nytt fenomen med isotopeffekt på isvekst.

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW-opererte Novel nanoliter osmometer for Ice Binding Protein Undersøkelser

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Covalent Binding av BMP-2 på overflater Bruke en Self-montert med ett lag Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestemme isbindende fly av frostvæskeproteiner ved fluorescensbasert isplanaffinitet

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

En invers Analyse Tilnærming til Karakterisering av Chemical Transport i Maling

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycan Node analyse: En bottom-up tilnærming til glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Microfluidic Pneumatiske Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulasjon og kontrollert kjemisk behandling

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Sulfat Separasjon ved Selektiv Krystallisering med en Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Microfluidic tørr-spinning og karakterisering av gjenfødte silke Fibroin fiber

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic brikker for In Situ Crystal X-ray Diffraksjon og In Situ dynamisk lysspredning for føljetong krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Synteser og krystallisering spektroskopiske karakteristikk av 3,5-Lutidine N-oksid tørke

The synthesis of 3,5-lutidine N-oxide dehydrate, 1, was achieved in the synthesis route of 2-amino-pyridine-3,5-dicarboxylic acid. Ochiai first used the ...