Name: a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00
Duration: 8 min 1 s
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O reconhecimento é feito aos Doadores do Fundo de Pesquisa de Petróleo da American Chemical Society pelo apoio a esta pesquisa (Grant número 60191-UNI5). Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Ido Braslavsky pelo pioneirismo no uso de dispositivos microfluídicos para estudar proteínas anticongelantes e gelo. Os autores são gratos ao Prof. Arthur DeVries, Prof. Konrad Meister e Prof. Peter Davies por fornecerem amostras de proteína anticongelante.

1. Fabricação de dispositivos microfluídicos
<ol><li>Cubra a superfície interna de uma placa de Petri com papel alumínio e coloque o molde pré-preparado na placa de Petri.<ol><li>Fabricar os moldes utilizando as técnicas de litografia descritas nas referências. Os dois projetos de dispositivos utilizados no presente trabalho estão representados na Figura 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar 30-40 ml da mistura PDMS pesando uma mistura 1:10 (em peso) do agente de cura e do elastômero (ver Tabela de Materiais) e misturando continuamente por aproximadamente 5 minutos até que a mistura pareça branca e quase opaca. NOTA: Coloque um copo de plástico na balança, despeje o elastômero no copo e, em seguida, adicione o agente de cura para obter uma proporção de peso de 1:10.</li>
	<li>Despeje a mistura PDMS na placa de Petri com o molde e desgaseifique em um exsicador até que não restem bolhas (aproximadamente 30 min).</li>
	<li>Asse o molde com o PDMS líquido num forno ou numa placa quente a 70 °C até obter uma consistência semelhante a borracha. Esse processo leva cerca de uma hora.</li>
	<li>Corte o dispositivo traçando as características com um bisturi, tomando o cuidado de avançar com o bisturi em vez de para baixo, uma vez que o molde é frágil. Remova o dispositivo PDMS recortado, colocando-o de cabeça para baixo em uma nova placa de Petri. Remova a poeira e as partículas de sujeira da superfície inferior anexando e removendo um pedaço de fita adesiva (consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Use uma agulha de seringa contundente (20 G) para perfurar furos no dispositivo com base no padrão impresso, usando um microscópio, se necessário. Certifique-se de que o orifício penetra pelo outro lado do dispositivo e use uma pinça para remover as peças perfuradas.</li>
	<li>Lave cuidadosamente uma folha de cobertura (18 x 18 mm, 0,14 mm de espessura) com água e sabão e, em seguida, com isopropanol. Use a pressão do ar para secar a tampa limpa.</li>
	<li>Insira o PDMS limpo e a tampa no limpador a plasma, feche as válvulas e ligue a energia, o aspirador e a bomba. Permita que o limpador de plasma funcione por cerca de um minuto, defina o RF como HI e permita que um pouco de ar entre no limpador de plasma usando a válvula fina.<ol><li>Quando a cor da janela de visualização mudar de roxo para rosa, deixe o limpador de plasma trabalhar por 50 s e desligue a RF. Mantenha a bomba ligada por um minuto e, depois de desligá-la, abra gradualmente a válvula principal para permitir que o ar entre no limpador de plasma. NOTA: Um método alternativo para alcançar resultados comparáveis é a ligação térmica. Para este método, coloque o molde sobre a tampa e coloque-o em uma placa quente ajustada a 70-80 °C por aproximadamente 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Pressione a superfície do PDMS sobre a tampa limpa e confirme que eles estão colados observando que não há descolamento ao puxar ligeiramente para cima na tampa.</li>
	<li>Prenda a agulha de uma agulha contundente de 90° (18 G) com um par de alicates e retire o conector da seringa de plástico para removê-la. Insira uma extremidade da agulha em um tubo Tygon (0,020" ID, 0,060" OD, consulte Tabela de materiais) e a outra extremidade em um dos orifícios perfurados do dispositivo. Repita o processo para os outros furos.</li>
	<li>Para remover bolhas de ar, injete água/tampão nos canais com uma seringa de vidro (uma bomba é opcional, mas nenhuma bomba foi usada aqui). Filtre todos os líquidos com um filtro de 0,22 μm antes de os injetar no dispositivo.</li>
	<li>Use um agente bloqueador, como uma solução de BSA a 1%, para evitar a ligação de AFPs marcadas com fluorescência nas paredes do PDMS. Injete o agente bloqueador no canal de entrada e deixe-o permanecer nos microcanais por 20 minutos. Em seguida, injete a solução tampão no canal de entrada para liberar a solução BSA. NOTA: O dispositivo PDMS resultante é anexado a uma tampa ao longo de sua superfície inferior, conectado à tubulação em seus orifícios de entrada e saída e revestido com um agente bloqueador em seus canais.</li>
</ol>2. Configuração do dispositivo microfluídico
<ol><li>Aplique uma pequena quantidade de óleo de imersão na superfície do estágio frio de cobre (consulte Tabela de materiais) e espalhe-o usando um lenço sem fiapos para criar uma fina camada de óleo. Em seguida, coloque um disco de safira limpo (consulte Tabela de materiais) na camada de óleo criada. Aplique uma gota de óleo de imersão no centro do disco de safira e posicione o dispositivo PDMS na gota de modo que as características do dispositivo estejam alinhadas sobre o orifício de visualização do estágio frio.</li>
	<li>Segure o dispositivo no lugar e prenda a tubulação às paredes externas da caixa de alumínio que abriga o estágio frio usando fita adesiva. Anote a colocação de cada tubo específico.</li>
	<li>Utilize uma seringa de vidro para injetar 4-5 μL de solução de AF(G)P (ver Tabela de Materiais) no canal de entrada. Feche a tampa do estágio frio. NOTA: A concentração das soluções de AFP pode ser variada e decidida com base na sua intensidade de fluorescência. No presente protocolo, a faixa de concentrações foi de 5-40 μL.</li>
</ol>3. Formação de cristais únicos nos canais microfluídicos
<ol><li>Purge o estágio frio com ar seco / nitrogênio para evitar a formação de condensação dentro dele. Ative um banho de resfriamento circulante para circular a água através do estágio frio e servir como um dissipador de calor.</li>
	<li>Inicie o programa de controle de temperatura e defina a temperatura para -25 °C. NOTA: O congelamento ocorrerá à medida que a amostra atingir uma temperatura de ~-20 °C, que pode ser observada como um escurecimento e rugosidade súbitos da amostra. Qualquer objetivo pode ser usado neste ponto, de preferência o objetivo 4x, que permite ao usuário observar a totalidade dos canais microfluídicos.</li>
	<li>Lentamente, aumentando a temperatura em aproximadamente 1 °C/5 s, aproximam-se do ponto de fusão da amostra, que pode variar de -1 a -0,2 °C, dependendo do tampão utilizado na solução de AF(G)P. À medida que a temperatura se aproxima do ponto de fusão, espere até que alguns cristais únicos sejam isolados. NOTA: Se necessário, o gelo indesejado pode ser derretido localmente usando um laser IR (980 nm) (ver Tabela de Materiais), que é fixado no microscópio. O laser derrete cristais de gelo próximos, desde que esteja ligado.</li>
	<li>Neste ponto, recomenda-se mudar para objetivos de 10x ou 20x para observar melhor os cristais únicos. Depois de obter um único cristal no local desejado, aumente o cristal diminuindo ligeiramente a temperatura (em ~0,01 °C) até que as bordas do cristal encontrem as paredes do canal.</li>
	<li>Mude para o objetivo de 50x, injete a solução AF(G)P nos canais e observe o aumento da intensidade de fluorescência, indicando que a solução proteica foi injetada com sucesso nos canais. Execute esta etapa com cuidado para evitar o derretimento do cristal de gelo durante a troca de soluções. Monitorize e ajuste de perto o caudal (aplicando mais/menos pressão na seringa de vidro) e a temperatura durante o processo de troca de solução.</li>
	<li>Permita que as proteínas tenham tempo suficiente para se acumular e se ligar à superfície do cristal. NOTA: Isso varia de acordo com as taxas de acumulação e adsorção do AF(G)P 5,25. Em um experimento típico, 5-10 min são permitidos para o acúmulo de AFP</li>
</ol>4. Medição da atividade da histerese térmica (HT)
Observação : esta etapa é opcional.
<ol><li>Determine o ponto de fusão do cristal ajustando a temperatura com pequenos passos de 0,002 °C e observando a temperatura mais alta a que um pequeno cristal pode ser submetido sem derreter.</li>
	<li>Na função RAMP do controlador de temperatura, defina a taxa de resfriamento para -0,05 a -0,01 °C/4 s e ative o RAMP. Observe a temperatura exata na qual ocorre o crescimento súbito do cristal. NOTA: Este valor é chamado de temperatura de ruptura e corresponde à temperatura de congelamento. A diferença entre as temperaturas de fusão e congelamento é a atividade TH25.</li>
</ol>5. Troca de soluções em torno de cristais únicos
<ol><li>Certifique-se de que a temperatura da amostra esteja no intervalo TH para evitar o derretimento ou crescimento do cristal durante o experimento.</li>
	<li>Registre o processo de troca de soluções usando o programa de imagem NIS Elements (consulte Tabela de materiais) para posterior análise de dados de fluorescência. Injete lentamente a solução tampão na segunda entrada do dispositivo microfluídico e observe uma diminuição no sinal fluorescente a uma taxa que depende da pressão aplicada à seringa.<ol><li>Use essa representação visual para garantir que a pressão aplicada não seja muito alta para não causar o derretimento do cristal. Consulte a Figura 2 para obter uma sequência de imagens que demonstram o processo de troca de soluções.</li>
	</ol></li>
	<li>Meça a intensidade de fluorescência no canal microfluídico usando o programa de imagem. NOTA: O sinal deve atingir o pico na região próxima à superfície do cristal, indicando ligação AFP, e deve ser relativamente baixo na solução circundante, que foi lavada com tampão.</li>
	<li>Meça a atividade de TH após a troca de soluções seguindo a etapa 4.</li>
	<li>Repita o experimento isolando um novo cristal (etapas 3.3-3.5). Injetar a solução de AFP com uma seringa de vidro e repetir a troca da solução (passos 5.1-5.3). Obter um novo cristal único (passos 3.3-3.5) e fluir a solução de AFP para os canais utilizando a seringa de vidro.</li>
</ol>6. Experimentos com hidratos de clatratos
<ol><li>Para obter hidratos de THF, prepare uma solução de THF/água com uma relação molar de 1:15, que é uma relação de volume de 1:3,326. Manter esta proporção em todas as soluções utilizadas nas experiências seguintes, incluindo as que contêm AF(G)Ps ou outros inibidores.</li>
	<li>Siga os passos 1 e 2 para preparar o dispositivo microfluídico e colocá-lo na fase fria. Ajuste a temperatura para -25 °C; a amostra congelará a ~-20 °C, conforme descrito no passo 3.2.</li>
	<li>Depois que a solução de THF estiver congelada, aumente lentamente a temperatura até que todo o gelo tenha derretido. NOTA: O ponto de fusão do gelo é ligeiramente deprimido pelo THF.</li>
	<li>Para garantir que todos os cristais de gelo derreteram com a exclusão dos hidratos, mantenha a temperatura a 1 °C durante 3 min.</li>
	<li>Ajuste a temperatura para -2 °C e observe a abundância de hidratos que aparecem nos canais microfluídicos na ausência de inibidores. NOTA: Os hidratos THF são moldados como octaedros (Figura 2) e, em alguns casos, os cristais são muito finos; portanto, a observação clara pode ser um desafio. Nestes casos, recomenda-se repetir os passos 6.4-6.5 para obter novos cristais.</li>
	<li>Injetar o inibidor de AF(G)P/no canal microfluídico utilizando a seringa de vidro enquanto ajusta a temperatura para garantir que os cristais obtidos não derretam/crescem. Aguarde alguns minutos para que as moléculas inibidoras adsorvam na superfície do cristal.</li>
	<li>Se necessário, meça a atividade de HT após a etapa 4.</li>
	<li>Troque a solução em torno dos cristais, conforme descrito nas etapas 5.2-5.3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-Binding+Proteins+and+Their+Function.">Ice-Binding Proteins and Their Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).</li><li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+are+antifreeze+proteins+in+solution+essential+for+ice+growth+inhibition.">When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition.</a> Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).</li><li>Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+glycoproteins+bind+irreversibly+to+ice.">Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).</li><li>Braslavsky, I., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LabVIEW-operated+Novel+Nanoliter+Osmometer+for+Ice+Binding+Protein+Investigations.">LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).</li><li>Ruppel, C. D., Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+climate+change+and+methane+hydrates.">The interaction of climate change and methane hydrates.</a> Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).</li><li>Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alcohols+and+diols+on+PVCap-induced+hydrate+crystal+growth+patterns+in+methane+systems.">Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems.</a> Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).</li><li>Sa, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+methane+and+natural+gas+hydrate+formation+by+altering+the+structure+of+water+with+amino+acids.">Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids.</a> Scientific Reports. 6, 31582 (2016).</li><li>Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+kinetic+inhibitors+for+natural+gas+hydrates.">Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates.</a> Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).</li><li>Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Inhibition+of+Gas+Hydrates+by+&#945;-Helical+Antifreeze+Proteins.">Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by &#945;-Helical Antifreeze Proteins.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antifreeze+proteins+on+the+nucleation,+growth,+and+the+memory+effect+during+tetrahydrofuran+clathrate+hydrate+formation.">Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tetrahydrofuran+clathrate-hydrate+formation+with+antifreeze+protein.">The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein.</a> Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).</li><li>Walker, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+as+gas+hydrate+inhibitors.">Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors.</a> Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).</li><li>Gordienko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+green+hydrate+inhibitor:+imaging+antifreeze+proteins+on+clathrates.">Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates.</a> PloS One. 5 (2), 8953 (2010).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+generation+using+a+polydimethylsiloxane+(PDMS)+co-axial+flow+focus+device.">Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).</li><li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing:+An+overview.">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview.</a> Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).</li><li>Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+diagnostic+microfluidics.">Advances in diagnostic microfluidics.</a> Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).</li><li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography.">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).</li><li>Haleva, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cold-finger+device+for+the+investigation+of+ice-binding+proteins.">Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins.</a> Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).</li><li>Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THF+hydrates+as+model+systems+for+natural+gas+hydrates:+Comparing+their+mechanical+and+vibrational+properties.">THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties.</a> Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).</li><li>Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+crystallization+kinetics+of+methane+(sI)+hydrate+in+a+thermoelectrically-cooled+microreactor.">Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+that+accumulate+on+different+ice+crystal+planes+produce+distinct+thermal+hysteresis+dynamics.">Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).</li><li>Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption-inhibition+of+clathrate+hydrates+by+self-assembled+nanostructures.">Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures.</a> ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).</li><li>Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v., Ward, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+unsteady+morphologies+at+ice+interfaces+driven+by+D2O-H2O+exchange.">Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).</li><li>Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+growth+acceleration+by+antifreeze+proteins+leads+to+higher+thermal+hysteresis+activity.">Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity.</a> Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).</li></ol>

O presente protocolo foi projetado para utilizar a combinação de fluxo microfluídico com cristais microscópicos, a fim de revelar novos insights sobre o crescimento de cristais e sua inibição. Um estágio frio27 com temperatura controlada com resolução milikelvina permite o controle de cristais microscópicos únicos situados dentro de canais microfluídicos, permitindo assim a troca de soluções em torno deles. Embora a fabricação de dispositivos microfluídicos seja padrão e semelhante às práticas comuns17,18, o controle sobre o crescimento e o derretimento de cristais dentro do dispositivo é único e novo. O componente mais crítico neste sistema é o excelente controle de temperatura, que é alcançado usando resfriadores termoelétricos Peltier, feedback de um termistor localizado perto da amostra e um controlador de temperatura de alta resolução que governa o loop de feedback.
Outra etapa crítica é a própria troca de solução, pois os cristais podem derreter ou crescer durante esse processo; assim, a temperatura deve ser ajustada durante a troca de solução para evitar o crescimento/fusão. A formação de cristais em canais microfluídicos interfere no fluxo de líquidos e representa o principal desafio deste sistema; assim, o crescimento desses cristais deve ser controlado. Aqui, um laser IR (980 nm) foi montado no microscópio invertido e foi utilizado para derreter localmente gelo indesejado/hidratar cristais28. Se tal laser não puder ser usado, os conectores metálicos do dispositivo microfluídico podem ser aquecidos por um resfriador termoelétrico Peltier adicional, que derreterá o gelo na entrada / saída do dispositivo.
O método descrito aqui inclui instrumentos desenvolvidos em casa (estágio frio) e requer treinamento, pois algumas das etapas acima mencionadas são desafiadoras. Como a concentração da solução ao redor dos cristais pode mudar mesmo quando o fluxo não é pretendido, uma simples etapa de calibração 5 pode fornecer uma estimativa confiável da concentração com base no sinalde fluorescência. Outra possível solução para o fluxo indesejado (durante as medições de HT, por exemplo) são as válvulas microfluídicas, que são descritas na referência4.
Esse sistema também foi utilizado para explorar o comportamento de crescimento dogelo D 2 O em líquido H2O, um estudo que revelou um novo fenômeno de superfícies de gelo microscópicas e recortadas27. Assim, a microfluídica pode ser usada no estudo de vários sistemas cristalinos que respondem bem às mudanças de temperatura.

As proteínas anticongelantes (AFPs) e as glicoproteínas anticongelantes (AFGPs) protegem vários organismos adaptados ao frio dos danos causados pela geada1. AFPs e AFGPs (generalizados como AF(G)Ps) inibem o crescimento de cristais de gelo, ligando-se irreversivelmente às suas superfícies e inibindo o crescimento adicional devido ao efeito Gibbs-Thomson 2,3,4,5. A lacuna resultante que se forma entre a temperatura de fusão, que é em grande parte inalterada, e a temperatura de congelamento recém-deprimida é chamada de histerese térmica (TH) e representa um parâmetro mensurável correspondente à atividade da AFP6. O uso de AFPs para inibir o crescimento do gelo tem aplicações de longo alcance e diversas, oferecendo aprimoramento potencial em vários campos, incluindo criopreservação, qualidade de alimentos congelados e proteção de culturas expostas ao frio.
A cristalização da água a baixas temperaturas e altas pressões na presença de pequenas moléculas orgânicas resulta na formação de hidratos de clatratos (ou hidratos gasosos), onde o hidrato mais abundante é o hidrato de metano7. A cristalização de hidratos de metano em linhas de fluxo de gás/óleo pode causar plugues, o que pode causar explosões devido à ignição do gás 8,9,10. Os esforços atuais para prevenir a cristalização de hidratos em linhas de fluxo incluem o uso de inibidores termodinâmicos (álcoois e glicóis) e cinéticos (principalmente polímeros) 11,12,13,14. Verificou-se também que as AFPs se ligam aos cristais de hidrato de clatratos e inibem seu crescimento, o que aponta para o uso potencial de AFPs para dificultar a formação de tampões, proporcionando assim uma solução mais verde15.
A microfluídica é um método prevalente utilizado para estudar as propriedades de fluidos em volumes de amostra minúsculos (até fL) que são fluídos através de uma rede de microcanais16. Os microcanais seguem um padrão criado em uma bolacha de silício (o molde) utilizando litografia17. Um material comumente usado para fabricar dispositivos microfluídicos é o polidimetilsiloxano (PDMS), que é barato e relativamente simples de trabalhar em laboratórios de pesquisa. O design dos recursos (canais) é composto em relação à finalidade específica do dispositivo; assim, pode ser utilizado para uma variedade de aplicações, incluindo detecção de DNA18, diagnóstico médico19 e processos de cristalização 3,20,21.
O presente protocolo descreve um método microfluídico único de cultivo de cristais de gelo e hidrato do tamanho de mícrons com vários inibidores, incluindo AFPs e AFGPs. Para esses experimentos, hidratos de tetraidrofurano (THF) foram utilizados para mimetizar as propriedades dos hidratos gasosos de metano22, que requerem equipamentos especializados para controle de pressão e temperatura23. AF(G)Ps marcados fluorescentemente foram utilizados para visualizar e analisar a adsorção das proteínas à superfície cristalina e, juntamente com imagens fluorescentes, a abordagem microfluídica permitiu a obtenção de características-chave do processo de ligação dessas moléculas às superfícies cristalinas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

Uma descrição mecanicista precisa da cristalização da água é um desafio e requer alguns elementos-chave: excelente controle de temperatura para permitir a formação de cristais microscópicos únicos e um sistema de microscopia adequado acoplado ao estágio frio. O método aqui descrito acrescenta outra característica importante que inclui a troca de soluções em torno de cristais de gelo e clatrato hidratado. O sistema descrito compreende uma combinação de instrumentos únicos e desenvolvidos em casa, incluindo microfluídica, estágios frios de alta resolução e microscopia de fluorescência. O estágio frio foi projetado para dispositivos microfluídicos e permite a formação de cristais de gelo/hidrato do tamanho de mícrons dentro de canais microfluídicos e a troca de soluções em torno deles. A resolução da temperatura e a estabilidade do estágio frio é de um milikelvin, o que é crucial para controlar o crescimento desses pequenos cristais. Este sistema diversificado é usado para estudar os diferentes processos de cristalização de gelo e hidrato e o mecanismo pelo qual o crescimento desses cristais é inibido. O protocolo descreve como preparar dispositivos microfluídicos, como cultivar e controlar cristais microscópicos nos canais microfluídicos e como a utilização do fluxo de líquidos em torno de cristais de gelo / hidrato proporciona novos insights sobre a cristalização da água.

Troca de soluções com cristais de gelo Uma troca de solução bem-sucedida em torno de um cristal de gelo é apresentada na Figura 3. O carimbo de data/hora em cada snapshot indica que a troca de soluções foi relativamente rápida; no entanto, uma troca mais lenta é possível. A intensidade de fluorescência proveniente das moléculas AFGP adsorvidas de gelo é claramente observada após a troca estar completa (Figura 3, à direita). Uma análise quantitativa da concentração de AFP na superfície do gelo é monitorada usando uma ferramenta designada de região de interesse (ROI) (Figura 4). Neste experimento4, utilizou-se AFP tipo III (isoforma QAE) diluída em Tris-HCl de 50 mM (pH 7,8) e NaCl de 100 mM. A solução é trocada em torno de um cristal em forma bipiramidal, e a intensidade de fluorescência na solução e no gelo é monitorada. O gráfico vermelho que indica o sinal de fluorescência na solução é diminuído por um fator de 100 durante a troca da solução, enquanto o sinal calculado (gráfico verde) na superfície do gelo permanece constante. O sinal calculado das moléculas adsorvidas de gelo foi obtido subtraindo-se o sinal proveniente da solução (multiplicado por uma constante que se relaciona com a espessura do canal microfluídico) do sinal proveniente do gelo4.
Troca de soluções com hidratos THF Experimentos microfluídicos com hidratos de THF foram realizados de forma semelhante aos experimentos com gelo. Depois que os cristais de hidrato foram autorizados a adsorver as moléculas inibidoras da solução, uma solução livre de inibidores foi injetada nos canais. A Figura 5 apresenta os hidratos de THF após troca de solução com dois tipos de inibidores: AFGP1-5 marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 5A) e safranina O (ver Tabela de Materiais), que é um corante de fluorescência26 (Figura 5B). Esta é a primeira demonização de uma ligação AFGP à superfície de um hidrato de clatratos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática dos canais microfluídicos utilizados no presente estudo. Ambos os projetos incluem duas entradas e uma saída. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> Figura 2: Hidratos de THF formados no canal microfluídico após o resfriamento da temperatura a ~-2 °C. A morfologia de todos os cristais apresentados é um tetraedro; no entanto, alguns cristais são orientados de forma diferente. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> Figura 3: Um experimento representativo exibindo troca de solução em torno de um único cristal de gelo em um canal microfluídico. Inicialmente, a solução continha AFGP1-5 marcada com FITC, e AFGPs adsorvidos de gelo não foram observados. Depois que a solução foi trocada por uma solução livre de AFGP, as proteínas que haviam sido previamente adsorvidas à superfície do gelo foram claramente detectadas (imagem à direita). Barra de escala = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> Figura 4: Uma análise quantitativa e qualitativa da concentração de AFP na superfície do gelo. (A) Um cristal de gelo em alta concentração de solução de AFP (antes da troca de solução). (B) O mesmo cristal após a troca da solução de AFP por uma solução-tampão isenta de AFP. Barra de escala = 20 μm. (C) Análise quantitativa da intensidade de fluorescência na superfície do gelo (preto) e na solução (vermelho) durante uma troca de solução. A curva verde representa a intensidade calculada na superfície do gelo. A figura é adaptada com autorização da referência4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> Figura 5: Cristais de hidrato de THF simples em canais microfluídicos após a troca da solução ao seu redor (A, AFGP1-5) ou (B,Safranine  O). A imagem em (B) é reproduzida a partir da referência26. Barra de escala = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

O presente protocolo descreve a cristalização de cristais de gelo microscópicos e hidratos de clatratos em dispositivos microfluídicos, possibilitando a troca líquida ao redor dos cristais formados. Isso fornece possibilidades incomparáveis para examinar o processo de cristalização e os mecanismos de ligação dos inibidores.

Uma abordagem microfluídica para o estudo da cristalização de hidratos de gelo e clatrato

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Este protocolo é único, pois permite ao usuário estudar, examinar e medir a interação entre moléculas solúveis e superfícies cristalinas. Forte evidência de ligação irreversível de proteínas anticongelantes ao gelo ou obtida usando este método. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de controlar o crescimento de gelo de tamanho mícron e hidratar cristais e trocar a solução em torno deles de forma controlada.Para começar, coloque o molde pré-preparado em uma placa de Petri de vidro coberta com papel alumínio. Em seguida, prepare 30 a 40 mililitros da mistura PDMS pesando uma mistura de 1 a 10 do agente de cura e do elastômero e misturando continuamente por aproximadamente cinco minutos até que a mistura pareça branca e quase opaca. Em seguida, despeje a mistura PDMS na placa de Petri com o molde e desgaseifique em um exsicador até que não restem bolhas.Asse o molde com o PDMS líquido em um forno ou em uma placa quente a 70 graus Celsius até obter uma consistência semelhante à borracha. Em seguida, corte o dispositivo traçando as características com um bisturi, tomando o cuidado de empurrar para a frente com o bisturi em vez de para baixo, uma vez que o molde é frágil. Depois de remover o dispositivo PDMS recortado, coloque-o de cabeça para baixo em uma nova placa de Petri.Usando uma seringa contundente, agulha de calibre 20, faça furos no dispositivo com base no padrão impresso. Em seguida, insira o PDMS limpo e a tampa no limpador de plasma. Feche as válvulas e ligue a energia, o vácuo e a bomba.Deixe o limpador de plasma funcionar por cerca de um minuto. Defina o RF para alto e permita que um pouco de ar entre no limpador de plasma usando a válvula fina. Quando a cor das janelas de visualização mudar de roxo para rosa, deixe o limpador de plasma trabalhar por 50 segundos para desligar a RF.Mantenha a bomba ligada por um minuto e, depois de desligá-la, abra gradualmente a válvula principal para permitir que o ar entre no limpador de plasma. Em seguida, pressione a superfície do PDMS na tampa limpa e confirme que eles estão ligados observando que não há descolamento ao puxar ligeiramente para cima no deslizamento da tampa. Depois de fixar a agulha de uma agulha contundente de 90 graus com um par de alicates, insira uma extremidade da agulha em um tubo Tygon e a outra extremidade em um dos orifícios perfurados do dispositivo enquanto repete o processo para os outros furos.Aplique uma pequena quantidade de óleo de imersão na superfície do estágio frio de cobre e espalhe-o usando um lenço sem fiapos para criar uma fina camada de óleo. Em seguida, coloque o disco de safira limpo na camada de óleo criada. Em seguida, aplique uma gota de óleo de imersão no centro do disco de safira e posicione o dispositivo PDMS na gota de modo que as características do dispositivo estejam alinhadas sobre o orifício de visualização do estágio frio.Depois de manter o dispositivo no lugar, prenda a tubulação às paredes externas da caixa de alumínio que abriga a fita adesiva. Usando uma seringa de vidro, injete de quatro a cinco microlitros de solução de proteína anticongelante no canal de entrada e feche a tampa do estágio frio. Inicie o programa de controle de temperatura e defina a temperatura para menos 25 graus Celsius.Em seguida, aumente lentamente a temperatura em aproximadamente um grau Celsius por cinco segundos. Aproxime-se do ponto de fusão das amostras, que pode variar de menos 1 a menos 0,2 grau Celsius, dependendo do tampão usado na solução de proteína anticongelante. Para observar melhor os cristais únicos, mude para objetivos de 10x ou 20x.E depois de obter um único cristal no local desejado, cresça o cristal diminuindo ligeiramente a temperatura até que as extremidades do cristal encontrem as paredes do canal. Depois de mudar para o objetivo de 50x, injete a solução de proteína anticongelante nos canais e observe o aumento da intensidade de fluorescência, indicando que a solução proteica foi injetada com sucesso nos canais. Para registrar o processo de troca de solução, use o NIS-Elements Imaging Program, garantindo que a pressão aplicada não seja muito alta e injete lentamente a solução tampão na segunda entrada do dispositivo microfluídico.Observe uma diminuição no sinal fluorescente a uma taxa que depende da pressão aplicada à seringa. Para obter hidratos de THF após a preparação de uma solução de água de THF com uma relação molar de 1 para 15, injete a solução no dispositivo microfluídico. Depois que a solução de água THF estiver congelada, aumente lentamente a temperatura até que todo o gelo tenha derretido com a exclusão dos hidratos e mantenha a temperatura em um grau Celsius por três minutos.Defina a temperatura para menos dois graus Celsius e observe a abundância de hidratos que aparecem nos canais microfluídicos na ausência de inibidores. Em seguida, injete a proteína anticongelante ou inibidor no canal microfluídico usando a seringa de vidro enquanto ajusta a temperatura para garantir que os cristais obtidos não derretam ou cresçam e permitam alguns minutos para que as moléculas inibidoras adsorvam à superfície do cristal. Efectuar a troca de solução injectando a solução livre de inibidores no canal.Tire imagens do cristal antes e depois da troca de solução e analise a intensidade de fluorescência no cristal e na solução usando o programa de imagem. Uma troca de solução bem-sucedida em torno de um cristal de gelo foi realizada, indicando que a troca de solução foi relativamente rápida. No entanto, uma troca mais lenta é possível.A intensidade de fluorescência proveniente das moléculas de glicoproteínas anticongelantes adsorvidas de gelo foi claramente observada após a troca estar completa. Uma análise quantitativa da concentração de proteínas anticongelantes foi monitorada e a intensidade de fluorescência foi determinada na solução e no gelo, indicando que o sinal de fluorescência na solução é diminuído por um fator de 100 durante a troca da solução, enquanto o sinal calculado na superfície do gelo permanece constante. Experimentos microfluídicos com hidratos de THF foram realizados onde uma solução livre de inibidores foi injetada nos canais após os cristais de hidrato serem autorizados a adsorver as moléculas inibidoras.Os hidratos de THF foram observados após troca de solução com dois tipos de inibidores, incluindo glicoproteínas anticongelantes marcadas com isotiocianato de fluoresceína e Safranin O, um corante fluorescente. As etapas críticas deste procedimento são a formação e isolamento de um único cristal nos canais microfluídicos e a troca de solução em torno dele. Este método pode ser usado com outros materiais cristalinos que são altamente sensíveis à temperatura, em um esforço para entender o mecanismo pelo qual os inibidores interagem com esses cristais.A capacidade de trocar soluções em torno de cristais abriu o caminho para os pesquisadores identificarem os principais insights sobre o mecanismo de ligação das proteínas anticongelantes e descobrirem um novo fenômeno do efeito isótopo no crescimento do gelo.

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW operado Osmometer nanolitro Novel de Investigações de gelo ligação às proteínas

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Química

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

Uma abordagem de análise inversa à caracterização dos Transportes Química em Tintas

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Gaiolas pneumáticas microfluídicos: uma nova abordagem para In-chip de cristal Trapping, Manipulação e controlada Tratamento Químico

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Separação sulfato por cristalização selectiva com um ligando bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Microfluidic seco-fiação e caracterização de fibras regeneradas da fibroína de seda

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Sínteses, cristalização e caracterização espectroscópica de 3,5-Lutidine N-óxido de desidratar

The synthesis of 3,5-lutidine N-oxide dehydrate, 1, was achieved in the synthesis route of 2-amino-pyridine-3,5-dicarboxylic acid. Ochiai first used the ...