Name: a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization at JoVE.com

Благодарность донорам Фонда нефтяных исследований Американского химического общества за поддержку этого исследования (номер гранта 60191-UNI5). Авторы хотели бы поблагодарить профессора Идо Браславского за новаторское использование микрофлюидных устройств для изучения антифризных белков и льда. Авторы благодарны профессору Артуру ДеВрису, профессору Конраду Майстеру и профессору Питеру Дэвису за предоставление образцов белка антифриза.

<ol>
	<li>Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-Binding+Proteins+and+Their+Function.">Ice-Binding Proteins and Their Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).</li><li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+are+antifreeze+proteins+in+solution+essential+for+ice+growth+inhibition.">When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition.</a> Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).</li><li>Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+glycoproteins+bind+irreversibly+to+ice.">Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).</li><li>Braslavsky, I., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LabVIEW-operated+Novel+Nanoliter+Osmometer+for+Ice+Binding+Protein+Investigations.">LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).</li><li>Ruppel, C. D., Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+climate+change+and+methane+hydrates.">The interaction of climate change and methane hydrates.</a> Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).</li><li>Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alcohols+and+diols+on+PVCap-induced+hydrate+crystal+growth+patterns+in+methane+systems.">Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems.</a> Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).</li><li>Sa, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+methane+and+natural+gas+hydrate+formation+by+altering+the+structure+of+water+with+amino+acids.">Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids.</a> Scientific Reports. 6, 31582 (2016).</li><li>Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+kinetic+inhibitors+for+natural+gas+hydrates.">Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates.</a> Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).</li><li>Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Inhibition+of+Gas+Hydrates+by+&#945;-Helical+Antifreeze+Proteins.">Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by &#945;-Helical Antifreeze Proteins.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antifreeze+proteins+on+the+nucleation,+growth,+and+the+memory+effect+during+tetrahydrofuran+clathrate+hydrate+formation.">Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).</li><li>Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tetrahydrofuran+clathrate-hydrate+formation+with+antifreeze+protein.">The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein.</a> Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).</li><li>Walker, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+as+gas+hydrate+inhibitors.">Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors.</a> Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).</li><li>Gordienko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+green+hydrate+inhibitor:+imaging+antifreeze+proteins+on+clathrates.">Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates.</a> PloS One. 5 (2), 8953 (2010).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+generation+using+a+polydimethylsiloxane+(PDMS)+co-axial+flow+focus+device.">Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).</li><li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing:+An+overview.">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview.</a> Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).</li><li>Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+diagnostic+microfluidics.">Advances in diagnostic microfluidics.</a> Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).</li><li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography.">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).</li><li>Haleva, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cold-finger+device+for+the+investigation+of+ice-binding+proteins.">Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins.</a> Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).</li><li>Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THF+hydrates+as+model+systems+for+natural+gas+hydrates:+Comparing+their+mechanical+and+vibrational+properties.">THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties.</a> Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).</li><li>Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+crystallization+kinetics+of+methane+(sI)+hydrate+in+a+thermoelectrically-cooled+microreactor.">Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+that+accumulate+on+different+ice+crystal+planes+produce+distinct+thermal+hysteresis+dynamics.">Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).</li><li>Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption-inhibition+of+clathrate+hydrates+by+self-assembled+nanostructures.">Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures.</a> ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).</li><li>Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v., Ward, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+unsteady+morphologies+at+ice+interfaces+driven+by+D2O-H2O+exchange.">Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).</li><li>Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+growth+acceleration+by+antifreeze+proteins+leads+to+higher+thermal+hysteresis+activity.">Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity.</a> Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).</li></ol>

Никакой

Настоящий протокол был разработан для использования комбинации микрофлюидного потока с микроскопическими кристаллами, чтобы выявить новое понимание роста кристаллов и его ингибирования. Холодная ступень27 с регулируемым температурным разрешением милликельвина позволяет управлять одиночными микроскопическими кристаллами, расположенными внутри микрофлюидных каналов, тем самым обеспечивая обмен растворами вокруг них. В то время как изготовление микрофлюидных устройств является стандартным и похожим на обычную практику17,18, контроль над ростом и плавлением кристаллов внутри устройства является уникальным и новым. Наиболее важным компонентом в этой системе является превосходный контроль температуры, который достигается за счет использования термоэлектрических охладителей Пельтье, обратной связи от термистора, расположенного близко к образцу, и регулятора температуры высокого разрешения, который управляет петлей обратной связи.
Другим важным этапом является сам обмен раствором, поскольку кристаллы могут плавиться или расти во время этого процесса; таким образом, температура должна регулироваться во время обмена раствором, чтобы предотвратить рост/плавление. Образование кристаллов в микрофлюидных каналах препятствует потоку жидкости и представляет собой основную проблему этой системы; таким образом, рост этих кристаллов должен контролироваться. Здесь ИК-лазер (980 нм) был установлен на инвертированном микроскопе и использовался для локального расплавления нежелательных кристаллов льда / гидрата28. Если такой лазер не может быть использован, металлические разъемы микрофлюидного устройства могут быть нагреты дополнительным термоэлектрическим охладителем Пельтье, который растопит лед во входе/выходе устройства.
Метод, описанный здесь, включает в себя инструменты домашней разработки (холодная стадия) и требует обучения, так как некоторые из вышеупомянутых шагов являются сложными. Поскольку концентрация раствора, окружающего кристаллы, может изменяться даже тогда, когда поток не предназначен, простая стадия калибровки5 может обеспечить надежную оценку концентрации на основе флуоресцентного сигнала. Другим возможным решением проблемы нежелательного потока (например, во время измерений TH) являются микрофлюидные клапаны, которые описаны в ссылке4.
Эта система также использовалась для изучения поведения роста льда D2O в жидкости H2O, исследование, которое выявило новое явление микроскопических, гребешковых ледяных поверхностей27. Таким образом, микрофлюидика может быть использована при изучении различных кристаллических систем, которые хорошо реагируют на изменения температуры.

Антифризные белки (АФП) и антифризные гликопротеины (АФГП) защищают различные адаптированные к холоду организмы от поврежденийморозом1. АФП и АФГП (обобщенные как AF(G)Ps) ингибируют рост кристаллов льда, необратимо связываясь с их поверхностями и ингибируя дальнейший рост из-за эффекта Гиббса-Томсона 2,3,4,5. Возникающий разрыв, который образуется между температурой плавления, которая в значительной степени неизменна, и вновь пониженной температурой замерзания, называется термическим гистерезисом (TH) и представляет собой измеримый параметр, соответствующий активностиAFP 6. Использование AFP для ингибирования роста льда имеет далеко идущие и разнообразные применения, предлагая потенциальное улучшение в различных областях, включая криоконсервацию, качество замороженных продуктов питания и защиту культур, подвергающихся воздействию холода.
Кристаллизация воды при низких температурах и высоких давлениях в присутствии малых органических молекул приводит к образованию клатратных гидратов (или газовых гидратов), где наиболее распространенным гидратом является гидрат метана7. Кристаллизация гидратов метана в линиях потока газа/нефти может привести к закупорке, которая может вызвать взрывы из-за воспламенения газа 8,9,10. Предпринимаемые в настоящее время усилия по предотвращению кристаллизации гидратов в проточных линиях включают использование термодинамических (спирты и гликоли) и кинетических (главным образом полимеров) ингибиторов 11,12,13,14. Было также обнаружено, что АФП связываются с кристаллами гидрата клатрата и ингибируют их рост, что указывает на потенциальное использование АФП для предотвращения образования пробок, тем самым обеспечивая более экологичный раствор15.
Микрофлюидика является распространенным методом, используемым для изучения свойств жидкостей при незначительных объемах образцов (вплоть до fL), которые протекают через сеть микроканалов16. Микроканалы следуют шаблону, созданному на кремниевой пластине (пресс-форме) с использованием литографии17. Широко используемым материалом для изготовления микрофлюидных устройств является полидиметилсилоксан (PDMS), который является недорогим и относительно простым в работе в исследовательских лабораториях. Конструкция признаков (каналов) составляется с учетом конкретного назначения устройства; таким образом, он может быть использован для различных применений, включая ДНК-зондирование18, медицинскую диагностику19 и процессы кристаллизации 3,20,21.
Настоящий протокол описывает уникальный микрофлюидный метод выращивания кристаллов льда и гидратов микронного размера с различными ингибиторами, включая АФП и АФГП. Для этих экспериментов гидраты тетрагидрофурана (ТГФ) использовались для имитации свойств газовых гидратов метана22, которые требуют специализированного оборудования для контроля давления и температуры23. Флуоресцентно меченые AF(G)Ps использовались для визуализации и анализа адсорбции белков к поверхности кристалла, а в сочетании с флуоресцентной визуализацией микрофлюидный подход позволил получить ключевые особенности процесса связывания этих молекул с кристаллическими поверхностями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

Точное механистическое описание кристаллизации воды является сложной задачей и требует нескольких ключевых элементов: превосходного контроля температуры, позволяющего формировать мономикроскопические кристаллы, и подходящей системы микроскопии, связанной с холодной стадией. Способ, описанный в настоящем описании, добавляет еще одну важную особенность, которая включает обмен растворами вокруг льда и кристаллов гидрата клатрата. Описанная система содержит комбинацию уникальных и отечественных приборов, включая микрофлюидику, холодные стадии высокого разрешения и флуоресцентную микроскопию. Холодная ступень предназначена для микрофлюидных устройств и позволяет формировать микронные кристаллы льда/гидрата внутри микрофлюидных каналов и обмениваться растворами вокруг них. Температурное разрешение и стабильность холодной стадии составляет один милликельвин, что имеет решающее значение для контроля роста этих мелких кристаллов. Эта разнообразная система используется для изучения различных процессов кристаллизации льда и гидратов и механизма, с помощью которого ингибируется рост этих кристаллов. Протокол описывает, как подготовить микрофлюидные устройства, как выращивать и контролировать микроскопические кристаллы в микрофлюидных каналах и как использование потока жидкостей вокруг кристаллов льда / гидрата дает новое представление о кристаллизации воды.

Обмен раствором с кристаллами льда Успешный обмен решениями вокруг кристалла льда представлен на рисунке 3. Отметка времени на каждом моментальном снимке указывает на то, что обмен решениями происходил относительно быстро; однако возможен более медленный обмен. Интенсивность флуоресценции, исходящей от адсорбированных льдом молекул AFGP, четко наблюдается после завершения обмена (рисунок 3, справа). Количественный анализ концентрации АФП на поверхности льда контролируется с помощью инструмента обозначенной области интереса (ROI) (рисунок 4). В этом эксперименте4 использовали АФП типа III (изоформа QAE), разбавленную в 50 мМ Tris-HCl (рН 7,8) и 100 мМ NaCl. Раствор обменивают вокруг кристалла бипирамидной формы, а интенсивность флуоресценции в растворе и на льду контролируют. Красный график, обозначающий флуоресцентный сигнал в растворе, уменьшается в 100 раз при обмене раствором, в то время как расчетный сигнал (зеленый график) на поверхности льда остается постоянным. Рассчитанный сигнал адсорбированных льдом молекул был получен путем вычитания сигнала, поступающего из раствора (умноженного на константу, относящуюся к толщине микрофлюидного канала) из сигнала, поступающего от льда4.
Замена раствора с гидратами ТГФ Микрофлюидные эксперименты с гидратами ТГФ проводились аналогично экспериментам со льдом. После того, как кристаллам гидрата позволили адсорбировать молекулы ингибитора из раствора, в каналы вводили раствор без ингибитора. На фиг.5 представлены гидраты ТГФ после обмена растворами с двумя типами ингибиторов: AFGP1-5 , меченым флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) (Фит.5А) и сафранином О (см. Таблицу материалов), который представляет собой флуоресцентный краситель26 (Фиг.5В). Это первое проявление связывания AFGP с поверхностью гидрата клатрата.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление микрофлюидных каналов, используемых в настоящем исследовании. Обе конструкции включают в себя два входа и одну розетку. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> Рисунок 2: Гидраты ТГФ образуются в микрофлюидном канале после охлаждения температуры до ~-2 °C. Морфология всех представленных кристаллов представляет собой тетраэдр; однако некоторые кристаллы ориентированы по-разному. Шкала = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> Рисунок 3: Репрезентативный эксперимент, демонстрирующий обмен раствором вокруг кристалла льда в микрофлюидном канале. Первоначально раствор содержал AFGP1-5 , помеченный FITC, и адсорбированные льдом АФГП не наблюдались. После того, как раствор обменяли на раствор без AFGP, белки, которые ранее адсорбировались на поверхности льда, были четко обнаружены (изображение справа). Шкала = 25 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> Рисунок 4: Количественный и качественный анализ концентрации АФП на поверхности льда. (А) Кристалл льда при высокой концентрации раствора АФП (до обмена раствором). (B) Тот же кристалл после того, как раствор АФП обменивали с буферным раствором без АФП. Шкала bar = 20 мкм. (C) Количественный анализ интенсивности флуоресценции на поверхности льда (черный) и в растворе (красный) при обмене раствором. Зеленая кривая представляет собой расчетную интенсивность на поверхности льда. Рисунок адаптирован с разрешения из ссылки4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> Рисунок 5: Одиночные кристаллы гидрата ТГФ в микрофлюидных каналах после обмена раствором вокруг них (A, AFGP1-5) или (B,Safranine  O). Изображение в пункте (B) воспроизводится из ссылки26. Шкала = 25 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization at JoVE.com

A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

Настоящий протокол описывает кристаллизацию микроскопических кристаллов льда и гидратов клатрата в микрофлюидных устройствах, обеспечивая жидкостный обмен вокруг сформированных кристаллов. Это обеспечивает беспрецедентные возможности для изучения процесса кристаллизации и механизмов связывания ингибиторов.

Микрофлюидный подход к изучению кристаллизации льда и клатратов

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

Этот протокол является уникальным, поскольку он позволяет пользователю изучать, исследовать и измерять взаимодействие между растворимыми молекулами и поверхностями кристаллов. Убедительные доказательства необратимого связывания антифризных белков со льдом или получены с помощью этого метода. Основным преимуществом данной методики является возможность контролировать рост микронного размера льда и гидратных кристаллов и контролируемо обмениваться раствором вокруг них.Для начала поместите предварительно подготовленную форму в стеклянную чашку Петри, покрытую алюминиевой фольгой. Затем приготовьте от 30 до 40 миллилитров смеси PDMS, взвесив от 1 до 10 смеси отверждающего агента и эластомера и непрерывно перемешивая в течение примерно пяти минут, пока смесь не станет белой и почти непрозрачной. Затем вылейте смесь PDMS в чашку Петри с формой и дегазируйте в осушителе, пока не останется пузырьков.Выпекайте форму с жидкой PDMS в духовке или на конфорке при температуре 70 градусов Цельсия до получения резиноподобной консистенции. Затем вырежьте устройство, проследив вокруг объектов скальпелем, позаботившись о том, чтобы продвинуться вперед скальпелем, а не вниз, так как плесень хрупкая. После снятия вырезанного устройства PDMS поместите его вверх ногами в новую чашку Петри.Используя тупой шприц, иглу 20 калибра, пробивайте отверстия в устройстве на основе отпечатанного рисунка. Затем вставьте очищенный PDMS и крышку в плазмоочиститель. Закройте клапаны и включите питание, вакуум и насос.Дайте плазменному очистителю работать около минуты. Установите ВЧ на высокий уровень и позвольте некоторому количеству воздуха войти в плазмоочиститель с помощью тонкого клапана. Когда цвет окон просмотра изменится с фиолетового на розовый, дайте плазменному очистителю поработать в течение 50 секунд, чтобы выключить радиочастоту.Держите насос включенным в течение минуты, а после его выключения постепенно открывайте главный клапан, чтобы воздух поступал в плазмоочиститель. Затем прижмите поверхность PDMS к очищенному крышке и убедитесь, что они склеены, не наблюдая отслоения при небольшом подтягивании на крышке. После закрепления иглы тупой иглой на 90 градусов с помощью пары плоскогубцев, вставьте один конец иглы в трубку Tygon, а другой конец в одно из выбитых отверстий устройства, повторяя процесс для других отверстий.Нанесите небольшое количество погружного масла на поверхность медной холодной ступени и распределите его с помощью безворсовой салфетки, чтобы создать тонкий слой масла. Далее поместите чистый сапфировый диск на созданный масляный слой. Затем нанесите каплю погружного масла на центр сапфирового диска и поместите устройство PDMS на каплю таким образом, чтобы особенности устройства были выровнены над смотровым отверстием холодной ступени.Удерживая устройство на месте, закрепите трубку на внешних стенках алюминиевой коробки, в которой находится клейкая лента. Используя стеклянный шприц, вводят четыре-пять микролитров раствора антифриза белка во входной канал и закрывают крышку холодной стадии. Запустите программу контроля температуры и установите температуру до минус 25 градусов по Цельсию.Затем медленно увеличивайте температуру примерно на один градус Цельсия за пять секунд. Подойдите к образцам температура плавления, которая может составлять от минус 1 до минус 0,2 градуса Цельсия, в зависимости от буфера, используемого в растворе белка антифриза. Чтобы лучше наблюдать за монокристаллами, переключитесь на 10-кратные или 20-кратные цели.А после получения монокристалла в нужном месте вырастите кристалл, немного снизив температуру, пока концы кристалла не встретятся со стенками канала. После переключения на объектив 50x вводят раствор белка антифриза в каналы и наблюдают увеличение интенсивности флуоресценции, указывая на то, что белковый раствор был успешно введен в каналы. Чтобы записать процесс обмена раствором, используйте программу ВИЗУАЛИЗАЦИИ NIS-Elements, следя за тем, чтобы приложенное давление не было слишком высоким, и медленно вводите буферный раствор во второе входное отверстие микрофлюидного устройства.Наблюдают снижение флуоресцентного сигнала со скоростью, которая зависит от давления, приложенного к шприцу. Для получения гидратов ТГФ после приготовления водного раствора ТГФ с молярным соотношением от 1 до 15 вводят раствор в микрофлюидное устройство. После того, как водный раствор THF заморожен, медленно увеличивайте температуру, пока весь лед не растает при исключении гидратов, и удерживайте температуру на уровне одного градуса Цельсия в течение трех минут.Установите температуру до минус двух градусов Цельсия и наблюдайте за обилием гидратов, которые появляются в микрофлюидных каналах при отсутствии ингибиторов. Затем вводят антифризный белок или ингибитор в микрофлюидный канал с помощью стеклянного шприца, регулируя температуру, чтобы убедиться, что полученные кристаллы не плавятся или не растут, и дайте молекулам ингибитора несколько минут адсорбироваться на поверхности кристалла. Осуществляют обмен раствором путем введения свободного раствора ингибитора в канал.Сделайте снимки кристалла до и после обмена раствором и проанализируйте интенсивность флуоресценции на кристалле и в растворе с помощью программы визуализации. Был проведен успешный обмен раствором вокруг кристалла льда, что указывает на то, что обмен раствором был относительно быстрым. Однако возможен более медленный обмен.Интенсивность флуоресценции, исходящей от адсорбированных льдом молекул антифризных гликопротеинов, четко наблюдалась после завершения обмена. Проведен количественный анализ концентрации белков антифриза и определена интенсивность флуоресценции в растворе и на льду, что указывает на то, что сигнал флуоресценции в растворе уменьшается в 100 раз при обмене раствором, в то время как расчетный сигнал на поверхности льда остается постоянным. Проводились микрофлюидные эксперименты с гидратами ТГФ, где в каналы вводили раствор без ингибитора после того, как кристаллам гидратов позволили адсорбировать молекулы ингибитора.Гидраты ТГФ наблюдались после обмена растворами с двумя типами ингибиторов, включая антифризные гликопротеины, меченные изотиоцианатом флуоресцеина и сафранином О, флуоресцентным красителем. Критическими этапами этой процедуры являются образование и выделение монокристалла в микрофлюидных каналах и обмен раствором вокруг него. Этот метод может быть использован с другими кристаллическими материалами, которые очень чувствительны к температуре, в попытке понять механизм, с помощью которого ингибиторы взаимодействуют с этими кристаллами.Способность обмениваться растворами вокруг кристаллов проложила путь для исследователей, чтобы определить ключевые идеи в механизме связывания белков антифриза и открыть новое явление изотопного влияния на рост льда.

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW управлением Романа Nanoliter Осмометр для Ice привязки исследования белков

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Ковалентного связывания БМП-2 на поверхностях Использование самоорганизующихся монослоя подход

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Определение ледовязающих плоскостей антифризовых белков с помощью флуоресценции на основе аффинити ледовой плоскости

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

Обратная Анализ подход к характеризации химической транспорта в красках

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glycan Узел Анализ: снизу вверх подход к Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

Микрожидком Пневматические Садки: Новый подход к В микросхеме Кристал Trapping, манипуляция и управляемому Химическая обработка

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Сульфат Разделение селективной кристаллизацией с Бис-iminoguanidinium-лигандом

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Microfluidic сухой-спиннинг и характеристика регенерированного шелка Фиброин волокон

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic чипы для In Situ кристалл рентгеновской дифракции и на месте Динамическое рассеяние света для последовательного кристаллографии

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Синтез, кристаллизации и спектральные характеристики 3,5-Lutidine N-оксид дигидрат

The synthesis of 3,5-lutidine N-oxide dehydrate, 1, was achieved in the synthesis route of 2-amino-pyridine-3,5-dicarboxylic acid. Ochiai first used the ...