Name: viral transgene expression in rodent hearts and the assessment of cardiac arrhythmia risk
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00
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Ces travaux ont été financés par les subventions Projet des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (PJT-148918 et PJT-180533, à WL), la Bourse de chercheur en début de carrière des IRSC (AR8-162705, à WL), la Bourse McDonald et la Bourse de nouveau chercheur de la Fondation des maladies du cœur du Canada (FMCC) (S-17-LI-0866, à WL), des bourses d’études (à JW et YX) et une bourse postdoctorale (à AL) du Fonds de dotation en cardiologie de l’Université d’Ottawa à l’Institut de cardiologie. Les auteurs remercient M. Richard Seymour pour son soutien technique. La figure 2 a été créée avec Biorender.com avec des licences approuvées.

Toutes les méthodes et procédures décrites ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche animale de l’Université d’Ottawa et le comité d’examen de la biosécurité de l’Institut de cardiologie de l’Université d’Ottawa. Les protocoles de sécurité élaborés comprennent que toutes les procédures relatives à l’adénovirus recombinant ou au virus adéno-associé (AAV) ont été effectuées dans une enceinte de biosécurité de niveau II. Tous les objets en contact avec le virus ont...

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	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-specific+deletion+of+&#946;-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction.">Cardiomyocyte-specific deletion of &#946;-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5/BDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).</li><li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+Nod1/RIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance.">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-&#954;B+activation+and+atherogenesis+in+mice.">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-&#954;B activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li><li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm.">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).</li><li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na++channel+inhibition+by+Wnt+signalling.">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li><li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phosphoinositide+3-kinase+{alpha},+protein+kinase+C,+and+L-type+Ca2++channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility.">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li><li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18.">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li><li>Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+complete+atrioventricular+block+recapitulates+clinical+indices+of+bradycardia+and+provides+a+platform+to+test+disease-modifying+therapies.">A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).</li><li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit:+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy.">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li><li>Ionta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHOX2+overexpression+favors+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+pacemaker+cells,+improving+biological+pacing+ability.">SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).</li><li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length,+pacing+site+and+atropine.">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li><li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts.">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li><li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes.">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).</li><li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li><li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes:+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state.">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>Allison, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroconductive+nanoengineered+biomimetic+hybrid+fibers+for+cardiac+tissue+engineering.">Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+human+cardiac+myocytes+for+medical+research:+Promises+and+challenges.">De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges.</a> Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).</li><li>Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-based+treatment+of+acquired+heart+block:+The+battle+for+tomorrow+has+begun.">Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).</li><li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).</li><li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction.">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li><li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells.">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010 (2020).</li></ol>

Plusieurs étapes sont essentielles au succès de la préparation cardiaque isolée perfusée par Langendorff. Tout d’abord, il est important d’éviter tout dommage au cœur pendant la collecte du cœur (par exemple, en raison d’une compression accidentelle ou d’une coupure avec les ciseaux). Deuxièmement, il est essentiel de mettre le cœur recueilli dans une solution froide de Tyrode dès que possible, car cela arrêtera le rythme cardiaque et réduira la consommation d’oxygène du cœur. Troisièmement, l?...

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, coûtant la vie à 18 millions de personnes rien qu’en 20171. Les rongeurs, en particulier les souris et les rats, sont devenus le modèle le plus couramment utilisé dans la recherche cardiovasculaire en raison de la facilité de manipulation et de la disponibilité de diverses surexpressions transgéniques ou de lignes knockout. Les modèles de rongeurs ont été fondamentaux pour comprendre les mécanismes de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans l’infarctus du myocarde2, l’hypertension3, l’insuffisance cardiaque4 et l’athérosclérose5. Cependant, l’utilisation de rongeurs dans les études sur les arythmies cardiaques est limitée par leur petite taille cardiaque et leur fréquence cardiaque plus rapide par rapport aux modèles humains ou aux grands animaux. Par conséquent, les arythmies létales spontanées chez la souris ou le rat après un infarctus du myocarde sont rares2. Les chercheurs sont obligés de se concentrer sur les changements secondaires indirects qui pourraient refléter un substrat pro-arythmique, tels que la fibrose ou l’expression génique, sans montrer de changements significatifs dans la charge de l’arythmie ou les tendances pro-arythmiques. Pour surmonter cette limitation, une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité des cœurs de souris et de rats aux tachyarythmies ventriculaires après modification génétique 6,7 ou infarctus du myocarde2 est décrite dans le présent protocole. Cette méthode combine la stimulation des récepteurs adrénergiques avec la stimulation électrique programmée pour induire des tachyarythmies ventriculaires dans des cœurs isolés de souris et de rats perfuséspar Langendorff.
Les approches standard pour le transfert de gènes viraux dans le tissu myocardique des rongeurs impliquent souvent l’exposition du cœur par thoracotomie 9,10,11, qui est une procédure invasive et est associée à une récupération retardée des animaux après la procédure. Cet article décrit une méthode d’injection intramyocardique directe de virus sous guidage d’imagerie par ultrasons pour la surexpression de transgènes. Cette procédure moins invasive permet une récupération plus rapide de l’animal après une injection virale et moins de lésions tissulaires, par rapport à la thoracotomie, réduit la douleur postopératoire et l’inflammation chez l’animal et, ainsi, permet une meilleure évaluation des effets des gènes transgéniques sur la fonction cardiaque.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G 1/2 PrecisionGlide Needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adeno-associated virus (AAV9-GFP)</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenovirus (Ad-GFP)</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenovirus (Ad-Wnt3a)</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>ADV-276318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet (Level II)</td>
			<td>Microzone Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: BK-2-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Vetergesic</td>
			<td>DIN 02342510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clipper</td>
			<td>WAHL Clipper Corporation</td>
			<td>78001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20701</td>
			<td>705 LT, volume 50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Life Brand</td>
			<td>E12107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>DIN 02264315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi Ltd.</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1351005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart 8 software</td>
			<td>ADInstruments Inc.</td>
			<td>Version 8.1.5</td>
			<td>for ECG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Ctnnb1flox/flox)</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>4152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (&#945;MHC-MerCreMer)</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>5650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>for Langendorff system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS400 transducer</td>
			<td>VisualSonic Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Systane</td>
			<td>DIN 02444062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure meter</td>
			<td>NETECH</td>
			<td>DigiMano 1000</td>
			<td>for Langendorff system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-77924-65</td>
			<td>for Langendorff system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat (Sprague-Dawley, male)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Down Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>for Langendorff system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal ECG system</td>
			<td>ADInstruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>567530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MyoPacer EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO3100 Preclinical Imaging System</td>
			<td>VisualSonic Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral transgene expression in rodent hearts and the assessment of cardiac arrhythmia risk

Les maladies cardiaques sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. En raison de la facilité de manipulation et de l’abondance des souches transgéniques, les rongeurs sont devenus des modèles essentiels pour la recherche cardiovasculaire. Cependant, les arythmies cardiaques létales spontanées qui causent souvent la mortalité chez les patients atteints de maladies cardiaques sont rares chez les modèles de maladies cardiaques chez les rongeurs. Cela est principalement dû aux différences entre les espèces dans les propriétés électriques cardiaques entre les humains et les rongeurs et pose un défi à l’étude des arythmies cardiaques chez les rongeurs. Ce protocole décrit une approche permettant une expression transgénique efficace dans le myocarde ventriculaire de souris et de rat en utilisant des injections intramusculaires guidées par échocardiographie de virus recombinant (adénovirus et virus adéno-associé). Ce travail décrit également une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité cardiaque aux arythmies à l’aide de cœurs de souris et de rats isolés, perfusés par Langendorff, avec des stimulations électriques adrénergiques et programmées. Ces techniques sont essentielles pour étudier les troubles du rythme cardiaque associés à un remodelage cardiaque indésirable après des blessures, telles que l’infarctus du myocarde.

Lorsqu’il est perfusé suivant le protocole décrit ici (Figure 1), un cœur de rat ou de souris isolé bat de manière rythmique et stable pendant au moins 4 heures. Si la conception expérimentale nécessite une période plus longue de perfusion cardiaque, il est utile d’ajouter de l’albumine dans la solution de perfusion pour réduire l’apparition d’un œdème myocardique après une perfusion de longue durée14. L’inclusion d’isoprotérénol dans la s...

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Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Le présent protocole décrit des méthodes d’expression transgénique dans le cœur de rats et de souris par injection intramyocardique directe du virus sous guidage échocardiographique. Les méthodes d’évaluation de la susceptibilité des cœurs aux arythmies ventriculaires par la stimulation électrique programmée de cœurs isolés perfusés par Langendorff sont également expliquées ici.

Expression de transgènes viraux dans les cœurs de rongeurs et évaluation du risque d’arythmie cardiaque

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Ce protocole permet à l’utilisateur d’obtenir une expression transgénique efficace dans le myocarde ventriculaire, facilitant ainsi les études d’expression génique pour examiner les arythmies cardiaques et la fonction dans le tissu ventriculaire. La technique d’expression des transgènes viraux est peu invasive pour l’animal, causant moins de dommages et un temps de récupération réduit que les approches conventionnelles impliquant une thoracotomie. La technique pour induire des arythmies dans les petits cœurs de rongeurs est utile pour évaluer la susceptibilité aux arythmies dans les petits modèles animaux de maladie cardiaque.La démonstration de la procédure sera le docteur Alice Lu, une boursière postdoctorale du laboratoire. Pour commencer, stérilisez la région inférieure gauche de la poitrine de la souris anesthésiée avec des rondes alternées d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine, dans de l’alcool, trois fois dans un mouvement circulaire. Sous guidage par imagerie par ultrasons, insérer l’aiguille de la seringue contenant le virus dans la poitrine de l’animal.Approchez la pointe de l’aiguille dans la paroi libre avant ventriculaire gauche et injectez lentement 10 à 15 microlitres du virus. Vérifier la réussite de l’injection dans les images échographiques par la luminosité améliorée près de la pointe de l’aiguille. Retirez l’aiguille du cœur et insérez-la dans d’autres régions du ventricule gauche pour une deuxième et une troisième injection de la même quantité de virus.Pour effectuer une perfusion Langendorff du cœur de souris, placez le cœur canulé dans une boîte en plastique de 10 centimètres recouverte d’élastomère de silicone, avec le ventricule gauche vers le haut. Canuler l’aorte du cœur avec une aiguille émoussée reliée à un système de profusion Langendorff modifié en mode débit constant. Perfuser le cœur avec une solution Tyrode à bulles d’oxygène à 37 degrés Celsius.Au début de la perfusion, vérifiez la bonne canulation aortique en observant le lavage du sang du cœur pendant les deux ou trois premiers battements cardiaques et en changeant la couleur du cœur du rouge au pâle. Ajustez le débit pour maintenir la pression de perfusion à 70 à 80 millimètres de mercure. Après confirmation, placez les électrodes d’un système ECG pour petit animal autour du cœur en les insérant dans le revêtement en élastomère de silicone dans le plat.Ensuite, enregistrez l’ECG à l’aide d’un logiciel compatible. Ensuite, effectuez une stimulation des récepteurs adrénergiques et perfuser le cœur avec de l’isoprotérénol et une solution Tyrode. Après 10 minutes, effectuez une stimulation électrique programmée pour induire des tachyarythmies ventriculaires en stimulant le cœur à l’apex avec deux électrodes de platine reliées à un stimulateur électrique.Commencez la procédure de stimulation avec 10 stimuli initiaux consécutifs, S1, suivis d’un stimulus supplémentaire, S2, avec un intervalle initial de 80 millisecondes. Ensuite, réduisez à plusieurs reprises l’intervalle S2 de deux millisecondes à chaque fois jusqu’à ce que le rythme cardiaque ne puisse plus être capturé ou que la période réfractaire effective du cœur, ou ERP, soit atteinte. Surveiller toute tachyarythmie ventriculaire induite, y compris la tachycardie ventriculaire et la fibrillation, par ECG.Si aucune arythmie n’est induite. ajouter un autre stimulus supplémentaire, S3, après S2, avec les mêmes paramètres jusqu’à ce que l’ERP soit atteint. Si les tachyarythmies ventriculaires ne sont toujours pas induites, arrêtez la stimulation électrique et considérez le cœur comme non inductible.Au cours de la stimulation électrique programmée, la stimulation réussie du cœur est vérifiée par la capture individuelle du rythme cardiaque pendant les stimuli S1 consécutifs et le complexe QRS prolongé pendant la stimulation S1. Ces stimulations adrénergiques et électriques combinées n’ont induit aucune tachyarythmie ventriculaire chez les cœurs de souris de type sauvage sains et exploités de manière simulée, ou dans les cœurs de rats contrôlés injectés par un adénovirus et GFP. En revanche, le même protocole a induit des tachyarythmies ventriculaires chez 77% des cœurs de souris de type sauvage après un infarctus du myocarde et chez trois rats sur quatre après injection intramyocardique d’Ad-Wnt3a.Lors de l’insertion de l’aiguille, assurez-vous que l’extrémité de l’aiguille est encastrée dans la paroi libre et non à l’intérieur du ventricule. En outre, la sécurisation et la canulation de l’aorte du cœur est l’étape la plus critique. En suivant ces procédures, les cœurs peuvent être utilisés pour des études histologiques standard ou des tests de biologie moléculaire.Alternativement, les cellules vivantes peuvent être isolées afin d’effectuer des études électrophysiologiques unicellulaires.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Expression ciblée de la GFP dans le follicule pileux ex vivo utilisant transduction virale

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Recherche

Biologie

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Analyse semi-automatisée Heartbeat optique de petits coeurs

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Respirométriques évaluation phosphorylation oxydative dans la saponine perméabilisées fibres cardiaques

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Evaluation de l&#39;expression de GFP et viabilité en utilisant le Tali Image Based Cytomètre

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l&#39;analyse des souches périphériques migration cellulaire

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

La synthèse in vitro de l&#39;ARNm modifié pour l&#39;induction de l&#39;expression des protéines dans les cellules humaines

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...