Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Ik ben Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) en Brian Haarer (SUNY Upstate) dankbaar voor hun nuttige opmerkingen over dit protocol. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (GM133485).

1. Wassen van de coverslips
OPMERKING: Was (24 mm x 60 mm, #1,5) coverslips volgens Smith et al., 201328.
<ol><li>Schik coverslips in een plastic slide mailer container.</li>
	<li>Dompel coverslips sequentieel onder in de volgende oplossingen en soniceer gedurende 30-60 minuten, spoel met ddH2O 10 keer tussen elke oplossing: ddH2O met één druppel afwasmiddel; 0,1 M KOH. Bewaar coverslips in 100% ethanol gedurende maximaal 6 maanden. OPMERKING: Raak glazen oppervlakken niet aan met onbeminde vingers. Gebruik in plaats daarvan een tang.</li>
</ol>2. Coating gereinigd (24 mm x 60 mm, #1.5) coverslips met mPEG- en biotine-PEG-silaan
OPMERKING: Dit protocol maakt specifiek gebruik van een biotine-streptavidin-systeem om actine en microtubuli in het TIRF-beeldvormingsvlak te positioneren. Andere coatings en systemen kunnen worden gebruikt (bijv. antilichamen, poly-L-lysine, NEM-myosine, enz.).
<ol><li>Ontdooi aliquots van PEG-silaan en biotine-PEG-silaanpoeders.</li>
	<li>Los PEG-poeders op in 80% ethanol (pH 2,0) om coating stockoplossingen van 10 mg / ml mPEG-silaan en 2-4 mg / ml biotine-PEG-silaan te genereren, net voor het gebruik. OPMERKING: PEG-poeders lijken vaak opgelost, maar bevinden zich mogelijk niet op microscopisch niveau. Een goede resuspensie duurt ~ 1-2 minuten met constant pipetteren. Gebruikers worden aangemoedigd om nog eens 10 keer te pipetteren na het verschijnen van poederoplossing. LET OP: Draag handschoenen om de huid te beschermen tegen geconcentreerde HCl bij het maken van 80% ethanol (pH 2,0).</li>
	<li>Verwijder de schone (24 mm x 60 mm, #1,5) afdeksel uit de ethanolopslag met behulp van een tang. Droog met stikstofgas en bewaar in een schone petrischaal.</li>
	<li>Coat coverslips met 100 μL coatingoplossing: een mengsel van 2 mg/ml mPEG-silaan (MW 2.000) en 0,04 mg/ml biotine-PEG-silaan (MW 3.400) in 80% ethanol (pH 2,0). OPMERKING: Gebruik voor schaarse coating (aanbevolen) 2 mg / ml mPEG-silaan en 0, 04 mg / ml biotine-PEG-silaan. Gebruik voor dichte coating 2 mg/ml mPEG-silaan, 4 mg/ml biotine-PEG-silaan.</li>
	<li>Incubeer dekzeilen bij 70 °C gedurende ten minste 18 uur of tot gebruik. OPMERKING: Gecoate coverslips degraderen als ze langer dan 2 weken bij 70 °C worden bewaard.</li>
</ol>3. Assembleren van imaging flow kamers
<ol><li>Knip 12 stroken dubbelzijdige tape met dubbele rug tot een lengte van 24 mm. Verwijder één kant van de taperug en bevestig stukjes tape naast de zes groeven die aanwezig zijn op een schone beeldkamer. OPMERKING: Tape moet plat zijn voor een goede montage, anders zullen beeldkamers lekken. Verwijder voorzichtig de taperug om hobbels te voorkomen. Het wordt aanbevolen om getapete kamers op een schoon oppervlak te schuiven naar gladde tape-kamercontacten.</li>
	<li>Verwijder het tweede stuk taperug om de kleverige kant van de tape langs elke kamergroef bloot te leggen. Plaats kamertape met de zijkant naar boven op een schoon oppervlak.</li>
	<li>Meng epoxyhars en verharderoplossingen 1:1 (of volgens de instructies van de fabrikant) in een kleine weegboot.</li>
	<li>Gebruik een P1000-tip om een druppel gemengde epoxy tussen de tapestrips aan het einde van elke groef van de beeldkamer te plaatsen (rode pijl; Figuur 1A). Plaats kamertape/epoxyzijde naar boven op een schoon oppervlak.</li>
	<li>Verwijder een gecoate coverslip uit de incubator van 70 °C. Spoel gecoate en ongecoate oppervlakken van coverslips zes keer af met ddH2O, droog met gefilterd stikstofgas en bevestig vervolgens aan de beeldvormingskamer met de coverslip-coatingzijde naar de tape.</li>
	<li>Gebruik een P200- of P1000-pipetpunt om druk uit te oefenen op de tape-glasinterface om een goede afdichting tussen de tape en de coverslip te garanderen. OPMERKING: Met een goede afdichting wordt dubbelzijdige tape doorschijnend. Beeldvormende kamers zonder voldoende tape-kamercontacten zullen lekken.</li>
	<li>Incubeer geassembleerde kamers bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5-10 minuten om de epoxy in staat te stellen kamerputten volledig af te dichten voor gebruik. Perfusiekamers verlopen binnen 12-18 uur na montage. OPMERKING: Afhankelijk van de plaatsing van de tape en de dikte van de dubbelzijdige tape die wordt gebruikt, heeft de geassembleerde kamer een eindvolume van 20-50 μL.</li>
</ol>4. Conditionering van perfusiekamers
<ol><li>Gebruik een perfusiepomp (snelheid ingesteld op 500 μL/min) om sequentieel conditioneringsoplossingen in de perfusiekamer als volgt uit te wisselen:<ol>
<li>Stroom 50 μL van 1% BSA om de beeldkamer te primen. Verwijder overtollige buffer uit het Luer lock fitting reservoir.</li>
		<li>Stroom 50 μL van 0,005 mg/ml streptavidin. Incubeer gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder overtollige buffer uit het reservoir.</li>
		<li>Stroom 50 μL van 1% BSA om niet-specifieke binding te blokkeren. Incubeer gedurende 10-30 s. Verwijder overtollige buffer uit het reservoir.</li>
		<li>Debiet 50 μL warme (37 °C) 1x TIRF-buffer (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glucose, 0,25% (v/v) methylcellulose (4.000 cp)). OPMERKING: Verwijder geen overtollige buffer uit het reservoir. Dit voorkomt dat de kamer uitdroogt, waardoor luchtbellen in het systeem kunnen komen.</li>
		<li>Optioneel: Stroom 50 μL gestabiliseerde29 en 50% gebiotinyleerde microtubulizaden verdund in 1x TIRF-buffer. OPMERKING: De juiste verdunning moet empirisch worden bepaald en batch-tot-batchvariabiliteit bevatten. Protocollen van 27,29 worden aanbevolen als uitgangspunten. Een verdunning die 10-30 zaden per gezichtsveld oplevert, werkt goed met deze opstelling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Microscoop voorbereiding
OPMERKING: Biochemische reacties die dynamische actinefilamenten en microtubuli bevatten, worden gevisualiseerd/uitgevoerd met behulp van een omgekeerde Tirf-microscoop (Total Internal Reflection Fluorescence) die is uitgerust met 120-150 mW solid-state lasers, een temperatuurgecorrigeerde 63x olie-onderdompeling TIRF-objectief en een EMCCD-camera. Eiwitten in dit voorbeeld worden gevisualiseerd op de volgende golflengten: 488 nm (microtubuli) en 647 nm (actine).
<ol><li>Stel de podium-/objectiefverwarmingsinrichting in op 35-37 °C ten minste 30 minuten voordat de eerste biochemische reactie in beeld wordt gebracht.</li>
	<li>Stel de parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen als volgt in:<ol>
<li>Stel het acquisitie-interval in op elke 5 s gedurende 15-20 minuten.</li>
		<li>Stel 488 en 647 laserblootstellingen in op 50-100 ms bij 5%-10% vermogen. Stel de juiste TIRF-hoek in voor de microscoop. OPMERKING: Ongeacht de opstelling van de microscoop, is de eenvoudigste manier om het laservermogen, de belichting en de TIRF-hoek in te stellen, het maken van aanpassingen op afbeeldingen van beide polymeren alleen (zie 5.2.2.1 en 5.2.2.2, hieronder). Gebruikers worden sterk aangemoedigd om de laagste laservermogens en belichtingsinstellingen te gebruiken die nog steeds detectie mogelijk maken.<ol>
<li>Pas de polymerisatiereactie aan (figuur 1C) om actinefilamentassemblage te starten en beelden te verkrijgen bij 647 nm. Breng de juiste aanpassingen aan.</li>
			<li>Pas de polymerisatiereactie aan in een tweede geconditioneerde perfusieput om de assemblage van microtubuli te initiëren (figuur 1C) en visualiseer bij 488 nm. Breng de juiste aanpassingen aan.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Bereiding van eiwitreactiemengsels
<ol><li>Bereid de stamoplossing van fluorescerend geëtiketteerd tubuline.<ol>
<li>Bepaal de concentratie van zelfgemaakte ongelabelde tubuline via spectrofotometrie bij Abs280, als volgt:<ol>
<li>Lege spectrofotometer met 1xBRB80 zonder GTP.</li>
			<li>Bereken de concentratie tubuline met behulp van de vastgestelde extinctiecoëfficiënt van 115.000 M-1 cm-1 en de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq01.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Resuspendeer commercieel gemaakte gelyofiliseerde lysine-gelabelde 488-tubuline tot 10 μM (1 mg / ml; 100% label) met 20 μL van 1x BRB80 zonder GTP.</li>
		<li>Ontdooi een aliquot van 7,2 μL van 100 μM ongelabeld gerecycled tubuline29 op ijs. OPMERKING: Gerecyclede tubuline is van cruciaal belang voor een succesvolle assemblage van microtubuli in vitro omdat het polymerisatie-incompetente dimeren verwijdert die zijn gevormd in bevroren eiwitvoorraden29,30.</li>
		<li>Combineer 3 μL 10 μM 488-tubuline met de 7,2 μL aliquot van 100 μM ongelabelde tubuline, niet meer dan 15 minuten voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de stamoplossing van fluorescerend geëtiketteerd actine.<ol>
<li>Bepaal voor zelfgemaakte eiwitten de concentratie en het percentage label van actine via spectrofotometrie Abs290 en Abs650, als volgt:<ol>
<li>Blanco spectrofotometer met G-buffer.</li>
			<li>Bereken de concentratie van niet-geëtiketteerd actine met behulp van de vastgestelde extinctiecoëfficiënt van 25,974 M-1 cm-1 en de volgende formule: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
			<li>Bereken de concentratie van lysine gelabeld Alexa-647-actine met behulp van de extinctiecoëfficiënt van niet-gelabeld actine, de fluorcorrectiefactor van 0,03 en de volgende formule: [Alexa-647 actine], μM = (Abs290 - <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq03.jpg" style="opacity: 0.9; margin: auto;">
</li>
			<li>Bereken het procentuele label van Alexa-647-actin met behulp van de bepaalde ε voor Alexa-647 van 239.000 M-1 cm-1, als volgt: % label van Alexa-647-actine = (Abs290 - (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq04.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ontdooi één aliquot van 2 μL van 3 μM 100% gelabeld biotine-actine (geëtiketteerd op lysineresiduen). Verdun 10-voudig door 18 μL G-buffer toe te voegen.</li>
		<li>Combineer 3 μL verdund gebiotinyleerd actine, geschikte volumes ongelabelde en gelabelde actine (hierboven) zodat de uiteindelijke mix 12,5 μM totaal actine met 10% -30% fluorescerend label zal zijn. OPMERKING: Meer dan 30% procent fluorescerende actinemonomeren (final) kunnen de beeldresolutie in gevaar brengen, omdat filamenten moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrond.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid reactiemixen voor (figuur 1C).<ol>
<li>Bereid cytoskeletmengsel (buis A) door 2 μL van de 12,5 μM actinemix (6.2.3) te combineren met het tubulinebouillonmengsel (6.1.4), niet meer dan 15 minuten voorafgaand aan de beeldvorming. Bewaren op ijs tot gebruik.</li>
		<li>Bereid eiwitreactiemix (buis B) voor door alle andere experimentele componenten en eiwitten te combineren, waaronder: 2x TIRF-buffer, antibleekmiddel, nucleotiden, buffers en accessoire-eiwitten. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 1C. OPMERKING: De uiteindelijke verdunning resulteert in een 1x TIRF-buffer die ATP, GTP en ionische sterkte bevat binnen het geschatte fysiologische bereik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer buis A en buis B afzonderlijk bij 37 °C gedurende 30-60 s. Om de reactie op gang te brengen, mengt u en voegt u de inhoud van buis B toe aan buis A (hieronder).</li>
</ol>7. Beeld actine en microtubule dynamiek
<ol><li>Conditie perfusieput (figuur 1B; stap 4, hierboven).</li>
	<li>Start de assemblage van actine en microtubuli gelijktijdig door de inhoud van buis B (reactiemengsel) toe te voegen aan buis A (cytoskeletmengsel) (figuur 1C).</li>
	<li>Stroom 50 μL reactie met 1x TIRF-buffer aangevuld met 15 μM vrije tubuline, 1 mM GTP en 0,5 μM actinemonomeren en geschikte volumes buffercontroles.</li>
	<li>Neem time-lapse-film op met behulp van microscoopsoftware om elke 5 s gedurende 15-20 minuten te verkrijgen. OPMERKING: Initiatie van actine- en microtubuledynamica vindt plaats binnen 2-5 minuten (figuur 2). Langere vertragingen duiden op problemen met temperatuurregeling of concentratiegerelateerde problemen van eiwitten in de reactiemix.</li>
	<li>Conditioneer een nieuwe perfusieput (stap 4) en vervang het buffervolume door regulerende eiwitten van belang (d.w.z. Tau) en buffercontroles (figuur 1C). Verwerven zoals beschreven in stap 7 (hierboven) om regulerende eiwitten te beoordelen voor emergente actine-microtubule-functies.</li>
</ol>8. Verwerk en analyseer afbeeldingen met FIJI-software31
<ol><li>Open opgeslagen TIRF-films en bekijk deze als een compositie.</li>
	<li>Analyseer de dynamiek van microtubuli (figuur 3A), als volgt:<ol>
<li>Genereer een op tijd gebaseerde maximale Z-projectie vanuit het menu afbeeldingsstapels.</li>
		<li>Synchroniseer het Z-projectievenster met de originele TIRF-film vanuit het menu Analyze> Tools> Windows synchroniseren .</li>
		<li>Teken een lijn met het rechte lijngereedschap langs een microtubule die van belang is op de tijd geprojecteerde afbeelding.<ol>
<li>Open de regio van belang (ROI) manager vanuit het analyseren menu (Analyseren> Tools> ROI Manager).</li>
			<li>Sla individuele microtubulilocaties op door op "t" te drukken. Herhaal dit voor alle microtubuli van belang.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plot kymografen van geselecteerde lijnen met behulp van "/" of voer de multi-kymo macro uit die een video en kymograaf genereert voor elke microtubuli in de ROI manager31.<ol>
<li>Voeg zowel lengte- (μm) als tijd (min) schaalbalken toe aan kymografen vanuit het menu Balken Analyseren> Extra> Schalen .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Meet de groeisnelheden van microtubuli vanaf kymograafhellingen (figuur 3A, 1-2; helling van zwarte lijnen).</li>
		<li>Tel dynamische microtubulegebeurtenissen (catastrofe of hergroei) van de gegenereerde kymograaf of met behulp van beschikbare analysemacro's 5,8,18,25. Rode stippellijnen in figuur 3A, 1-2 vertegenwoordigen catastrofe/snelle demontagegebeurtenissen.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer de actinedynamiek (figuur 3B), als volgt:<ol>
<li>Meet actine-nucleatie als volgt:<ol>
<li>Tel het aantal actinefilamenten dat 100 s na het initiëren van de reactie in het gezichtsveld aanwezig is en druk uit door het gebied (filamenten per μm2).</li>
			<li>Registreer en bewaar gegevens in ROI Manager, zoals in stap 8.2.3.1 hierboven.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Meet de reksnelheid van actinefilamenten (figuur 3B), als volgt:<ol>
<li>Teken een lijn langs een interessant actinefilament met behulp van het gereedschap gesegmenteerde lijn.</li>
			<li>Voeg regel toe aan ROI-manager zoals in stap 8.2.3.1 hierboven.</li>
			<li>Herhaal het volgen van de regel (elke meting toevoegen aan ROI-manager) voor ten minste vier filmframes. OPMERKING: Het meten van zeven tot acht opeenvolgende frames wordt aanbevolen, maar sommige omstandigheden vertragen de actinepolymerisatie onder de detecteerbare limiet die kan worden opgelost door objectieve / microscoopopopstellingen. In een dergelijk geval kunnen metingen worden uitgevoerd met regelmatige tussenpozen over niet-opeenvolgende frames (bijvoorbeeld om de vijf frames).</li>
			<li>Plot gemeten lengtewaarden over verstreken tijd. De helling van de gegenereerde lijn is de actine-reksnelheid in micron/s.</li>
			<li>Breng de uiteindelijke berekende snelheden over als subeenheden s-1 μM-1 met behulp van een correctiefactor van 370 subeenheden om rekening te houden met het aantal actinemonomeren in een micron filament32.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Voer correlatieve analyse uit voor regio's van parallelle actine-microtubule associatie (figuur 3C), als volgt:<ol>
<li>Teken een lijn langs een microtubuli van belang op een specifiek tijdstip (d.w.z. 300 s na het initiëren van de reactie), met behulp van het rechtlijnige gereedschap.<ol>
<li>Voeg regel toe aan ROI-manager zoals in stap 8.2.3.1 hierboven.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zet de fluorescentie-intensiteit langs de lijn in elk kanaal uit.<ol>
<li>Selecteer elk kanaal met de afbeeldingsschuifregelaar en plot de intensiteiten langs de lijn met behulp van "command k".</li>
			<li>Sla waarden op of exporteer ze door op de knop "lijst" in het uitvoervenster te klikken.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Druk actine-microtubule-koppelingsgebeurtenissen uit als een verhouding (actine die overlapt met microtubuli) van individuele gebeurtenissen of als een telling van gebeurtenissen in een bepaald gezichtsveld op een consistent tijdstip (figuur 3C).</li>
		<li>Alternatief: Gebruik software om de procentuele overlap van beide kanalen te bepalen 5,12.</li>
	</ol></li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten bekend te maken.

Het gebruik van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie om gevisualiseerde gezuiverde eiwitten te visualiseren is een vruchtbare en overtuigende benadering geweest om unieke mechanismen van cytoskeletale regulatie te ontleden 5,23,24,25,26,27,35. In vergelijking met traditionele biochemische assays vereisen TIRF-reacties zeer kleine volumes (50-100 μL) en kwantitatieve metingen van cytoskeletale dynamica kunnen worden afgeleid uit een individuele test. De meeste studies van cytoskeletale dynamica richten zich op een enkel polymeersysteem (d.w.z. actinefilamenten of microtubuli), dus gedetailleerde metingen van de kruisverwijzing of emergent gedrag tussen actinefilamenten en microtubuli die typisch in cellen worden gezien, zijn ongrijpbaar gebleven en moeilijk te recapituleren in de reageerbuis. Om dit probleem op te lossen, beschrijft dit protocol een TIRF-microscopiesysteem met één filament dat de directe visualisatie van dynamische actine- en microtubulepolymeren in dezelfde biochemische reactie mogelijk maakt. Deze methode gaat dus verder dan traditionele testen die het dynamische gedrag van actinefilamenten of microtubuli alleen samenvatten. Deze techniek werd ook uitgevoerd met Tau als voorbeeld van hoe verschillende dynamische eigenschappen veranderen in de aanwezigheid van een cytoskeletkoppelingsfactor. Dit protocol kan worden gebruikt met extra eiwitten waarvan bekend is of vermoed wordt dat ze de dynamiek van actine of microtubuli coördineren, inclusief (maar niet beperkt tot) MACF, GAS, formins en meer. Ten slotte kunnen voorbeeldanalyses worden gebruikt als leidraad om gegevens te kwantificeren die met dit protocol zijn verkregen.
"Zien is geloven" is een dwingende reden om op microscopie gebaseerde testen uit te voeren. Voorzichtigheid is echter geboden bij de uitvoering en interpretatie van TIRF-microscopie-experimenten. Een grote uitdaging van cytoskeletale co-assemblagetests is dat veel veelgebruikte beeldvormingsomstandigheden niet compatibel zijn met elk polymeer. Microtubuli en actine hebben meestal verschillende buffer-, temperatuur-, zout-, nucleotide- en concentratievereisten voor polymerisatie. Actine, tubuline, regulerende eiwitten van belang en de buffers die in dit protocol worden gebruikt, zijn gevoelig voor vries-dooicycli. Daarom is een zorgvuldige omgang met eiwitten en buffers noodzakelijk om dit protocol met succes uit te voeren. Om veel van deze zorgen weg te nemen, wordt het gebruik van vers gerecyclede tubuline (<6 weken ingevroren) en het vooraf opruimen van bevroren / geresuspendeerde actines via ultracentrifugatie sterk aanbevolen. Deze overwegingen zijn ook van toepassing op de talloze regulerende eiwitten die met deze procedure moeten worden beoordeeld, die gevoelig kunnen zijn voor vries-dooicycli of de concentratie van bufferzouten 5,11,36.
Helaas bestaat er geen one-size-fits-all buffer zonder experimentele afwegingen. Om meer volume toe te eigenen voor eiwitten met een lagere concentratie, kunnen ATP en GTP worden opgenomen in de 2x TIRF-bufferoplossing (figuur 1C). Omdat deze nucleotiden echter extreem gevoelig zijn voor vries-dooicycli, wordt dit niet aanbevolen. De zuurstofopruimingsverbindingen die hier worden gebruikt (d.w.z. catalase en glucose-oxidase) zijn nodig om eiwitten gedurende lange tijd (minuten tot uren) te visualiseren, maar het is bekend dat ze de polymerisatie van microtubuli bij hoge concentraties beperken5. In verband met deze bufferoverwegingen is een beperking van dit protocol dat sommige canonieke microtubule-geassocieerde regulerende eiwitten meer of minder zout nodig kunnen hebben om functies in cellen of assays met alleen microtubuli (zonder actine) te recapituleren. Het veranderen van de aard of concentratie van zout om deze zorgen aan te pakken, zal waarschijnlijk van invloed zijn op de polymerisatie van actinefilamenten en / of parameters van de dynamiek van microtubuli. Metingen van meerdere beschrijvende parameters (minimaal, nucleatie, reksnelheden en stabiliteit) (figuur 3) zijn vereist om het succes van het protocol te bevestigen of om de effecten van specifieke buffers of regulerende eiwitten expliciet te documenteren. Te veel actinefilamentpolymerisatie kan bijvoorbeeld actine-microtubule-koppelingsgebeurtenissen binnen enkele seconden verdoezelen. Bijgevolg zal het verfijnen van experimentele omstandigheden door de totale concentratie van actine te verlagen of extra eiwitten op te nemen om actine-nucleatie te onderdrukken (d.w.z. profiline) de totale periode verlengen dat gecoördineerde actine-microtubule-activiteiten duidelijk kunnen worden bekeken. Besturingselementen die aan deze vereisten voldoen, en technische replicaties (buiten meerdere gezichtsvelden) zijn van cruciaal belang voor gebruikers om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te genereren.
Celgebaseerde studies bieden beperkte mogelijkheden om directe eiwit-eiwitrelaties of de werking van regulerende complexen te observeren. Daarentegen weerspiegelen sommige van de mechanismen die zijn verkregen uit in vitro assays niet altijd het exacte gedrag van eiwitten die in cellen worden gezien. Dit klassieke biochemische dilemma kan worden aangepakt in toekomstige toepassingen van deze techniek met specifieke aanpassingen. Het toevoegen van functionele fluorescerend gelabelde koppelingseiwitten breidt deze methode bijvoorbeeld uit van studies met één filament naar studies met één molecuul. Assays kunnen verder worden aangepast om celextracten te gebruiken die de "ontbrekende" onbekende sleutelfactoren kunnen toevoegen die nodig zijn om celachtige verschijnselen samen te vatten. Tirf-gebaseerde assays met behulp van gist of Xenopus-extracten hebben bijvoorbeeld contractiele actomyosineringen37, mitotische spindels26,38, componenten van actine of microtubuliassemblage39,40 gereconstitueerd, en zelfs dynamiek bij het centrosoom en kinetochoren 36,41,42,43 . Bovendien kunnen dergelijke systemen de weg vrijmaken voor kunstmatige celsystemen met lipiden of signaalfactoren die 44,45,46 aanwezig zijn.

Historisch gezien worden actine en microtubuli gezien als afzonderlijke entiteiten, elk met hun eigen set regulerende eiwitten, dynamisch gedrag en verschillende cellulaire locaties. Overvloedig bewijs toont nu aan dat actine- en microtubulepolymeren zich bezighouden met functionele overspraakmechanismen die essentieel zijn voor het uitvoeren van tal van celprocessen, waaronder migratie, mitotische spindelpositionering, intracellulair transport en celmorfologie 1,2,3,4. De diverse gecoördineerde gedragingen die aan deze voorbeelden ten grondslag liggen, zijn afhankelijk van een ingewikkelde balans van koppelingsfactoren, signalen en fysieke eigenschappen. De moleculaire details die aan deze mechanismen ten grondslag liggen, zijn echter nog grotendeels onbekend omdat de meeste studies zich richten op een enkel cytoskeletaal polymeer tegelijk 1,2,5.
Actine en microtubuli werken niet direct opelkaar in 6,7,8. De gecoördineerde dynamiek van actine en microtubuli in cellen wordt gemedieerd door aanvullende factoren. Veel eiwitten waarvan wordt gedacht dat ze actine-microtubule-overspraak reguleren, zijn geïdentificeerd en hun activiteiten zijn goed gekarakteriseerd met betrekking tot beide cytoskeletale polymeren alleen 1,2. Groeiend bewijs suggereert dat deze benadering met één polymeer de dubbele functies van sommige van de eiwitten / complexen heeft verborgen die actine-microtubule-koppelingsgebeurtenissen mogelijk maken 7,8,9,10,11,12,13. Experimenten waarbij beide polymeren aanwezig zijn, zijn zeldzaam en definiëren vaak mechanismen met een enkele dynamische polymeer en statische gestabiliseerde versie van de andere 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Er zijn dus methoden nodig om de emergente eigenschappen van actine-microtubuli coördinerende eiwitten te onderzoeken die mogelijk alleen volledig worden begrepen in experimentele systemen die beide dynamische polymeren gebruiken.
De combinatie van directe eiwitetiketteringsbenaderingen, genetisch gecodeerde affiniteitstags en total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie is met groot succes toegepast in biomimetische reconstitutiesystemen 19,20,21,22,23. Veel bottom-up schema's bevatten niet alle factoren die eiwitten in cellen reguleren. De "biochemie op een dekglass"-technologie heeft echter veel mechanismen van actine- en microtubuledynamica verfijnd op hoge ruimtelijke en temporele schalen, inclusief de componenten die nodig zijn voor polymeerassemblage of -demontage, en motoreiwitbeweging 5,12,23,24,25,26,27 . Hier wordt een minimale component single-filament benadering beschreven om actine-microtubule koppeling in vitro te onderzoeken. Dit protocol kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare of zeer zuivere gezuiverde eiwitten, fluorescerend gelabelde eiwitten, perfusiekamers en uitgebreid naar meer gecompliceerde schema's met celextracten of synthetische systemen. Hier wordt commercieel beschikbaar Tau-eiwit gebruikt om aan te tonen hoe cytoskeletale dynamiek verandert in de aanwezigheid van een actine-microtubule koppelingseiwit, maar kan worden vervangen door andere vermeende actine-microtubule coördinerende factoren. Het grote voordeel van dit systeem ten opzichte van andere benaderingen is de mogelijkheid om tegelijkertijd de dynamiek van meerdere cytoskeletale polymeren in één reactie te volgen. Dit protocol biedt gebruikers ook voorbeelden en eenvoudige hulpmiddelen om veranderingen in cytoskeletale polymeren te kwantificeren. Zo zullen protocolgebruikers betrouwbare, kwantitatieve gegevens met één filamentresolutie produceren om mechanismen te beschrijven die ten grondslag liggen aan hoe diverse regulerende eiwitten de dynamiek van actine-microtubuli coördineren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Traditioneel zijn de actine- en microtubulecytoskeletten bestudeerd als afzonderlijke entiteiten, beperkt tot specifieke cellulaire regio's of processen en gereguleerd door verschillende suites van bindende eiwitten die uniek zijn voor elk polymeer. Veel studies tonen nu aan dat de dynamiek van beide cytoskeletale polymeren met elkaar verweven is en dat deze kruisverwijzing nodig is voor de meeste cellulaire gedragingen. Een aantal eiwitten die betrokken zijn bij actine-microtubule interacties zijn al geïdentificeerd (d.w.z. Tau, MACF, GAS, formins en meer) en zijn goed gekarakteriseerd met betrekking tot actine of microtubuli alleen. Relatief weinig studies toonden echter testen van actine-microtubulecoördinatie met dynamische versies van beide polymeren. Dit kan emergente verbindingsmechanismen tussen actine en microtubuli uitsluiten. Hier maakt een op in vitro reconstitutie gebaseerde in vitro reconstitutietechniek op basis van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) de visualisatie van zowel actine- als microtubulidynamiek van de ene biochemische reactie mogelijk. Deze techniek behoudt de polymerisatiedynamiek van actinefilament of microtubuli afzonderlijk of in aanwezigheid van het andere polymeer. Commercieel beschikbaar Tau-eiwit wordt gebruikt om aan te tonen hoe actine-microtubule gedrag verandert in de aanwezigheid van een klassiek cytoskeletaal crosslinking-eiwit. Deze methode kan betrouwbare functionele en mechanistische inzichten bieden in hoe individuele regulerende eiwitten de dynamiek van actine-microtubuli coördineren met een resolutie van enkele filamenten of complexen van hogere orde.

Onder de hierboven beschreven omstandigheden (figuur 1) moeten actine- en microtubulepolymeren binnen 2 minuten na beeldacquisitie zichtbaar (en dynamisch) zijn (figuur 2). Zoals met elk op biochemie gebaseerd protocol, kan optimalisatie vereist zijn voor verschillende regulerende eiwitten of batches eiwit. Om deze redenen worden de TIRF-hoek en beeldbelichtingen eerst ingesteld met reacties die elk afzonderlijk polymeer bevatten. Dit bevestigt dat opgeslagen eiwitten functioneel zijn en dat er voldoende gelabeld eiwit aanwezig is voor detectie. Hoewel niet altijd noodzakelijk (en hier niet uitgevoerd), kan nabewerking van films (d.w.z. achtergrondaftrek, middeling of Fouriertransformaties) worden gebruikt om het beeldcontrast (met name van microtubuli) te verbeteren 5,25,33. De directe visualisatie van enkelvoudige actinefilamenten en microtubuli die door deze test wordt geboden, ondersteunt de kwantitatieve bepaling van verschillende dynamische metingen voor cytoskeletcomponenten alleen of samen, waaronder polymerisatieparameters (d.w.z. nucleatie- of reksnelheid), demontageparameters (d.w.z. krimpsnelheden of catastrofegebeurtenissen) en polymeer coalignment / overlap (figuur 3 ). Verder kunnen deze maatregelen worden gebruikt als uitgangspunt om de binding of invloed van regulerende liganden zoals Tau te ontcijferen (figuur 3). Veel metingen van enkelvoudige actinefilamenten of microtubuli kunnen worden gemaakt van één TIRF-film. Vanwege variaties in coverslipcoating, pipetteren en andere factoren, moeten betrouwbare metingen echter ook meerdere technische replicatiereacties / films omvatten.
Veel facetten van de dynamiek van microtubuli kunnen worden bepaald aan de hand van voorbeeld-kymografen, waaronder de snelheid van microtubule-rek, evenals de frequentie van catastrofe- en reddingsgebeurtenissen (figuur 3A). Het gebruik van kymografen om actinedynamiek in dit systeem te meten is niet zo eenvoudig omdat actinefilamenten ingewikkelder zijn dan microtubuli. Als gevolg hiervan worden parameters van actinefilamentdynamica met de hand gemeten, wat tijdrovend en arbeidsintensief is. Nucleatietellingen worden gemeten als het aantal actinefilamenten dat aanwezig is op een consistent tijdstip voor alle omstandigheden. Deze tellingen variëren sterk tussen TIRF-beeldvormingsvelden, maar kunnen worden gebruikt met veel replicaties of als aanvulling op waarnemingen van andere polymerisatietests. Nucleatietellingen kunnen ook worden gebruikt voor microtubuli als de proefomstandigheden geen gestabiliseerde microtubulizaden hebben. De reksnelheid van actinefilamentfilamenten wordt gemeten als de lengte van het filament in de loop van de tijd van ten minste vier filmframes. Snelheidswaarden worden per micromolair actine overgebracht met een correctiefactor van 370 subeenheden om rekening te houden met het aantal actinemonomeren in een micron filament (figuur 3B)32. Metingen om het gecoördineerde gedrag tussen actine en microtubuli te definiëren zijn minder goed gedefinieerd. Er zijn echter correlatieve analyses toegepast om het toeval van beide polymeren te meten, inclusief lijnscans (figuur 3C) of overlapsoftware 5,11,34.
Beschikbaarheid van gegevens: Alle datasets in verband met dit werk zijn gedeponeerd in Zenodo en zijn met redelijk verzoek beschikbaar op: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> Figuur 1. Experimentele schema's: flow chamber assembly naar image acquisition. (A) Beeldvormingskamerassemblage. Van boven naar beneden: IBIDI-beeldvormingskamers worden langs perfusieputten geplakt (aangeduid met pijl); de tweede (witte) laag taperug (links op de getoonde afbeelding om gebruikers beter te oriënteren) wordt verwijderd en Epoxy wordt aangebracht aan de rand van de perfusiekamer (pijl). Opmerking: Om gebruikers gemakkelijker te oriënteren waar ze de epoxy moeten plaatsen, is de witte achterkant op deze afbeelding blijven staan. De gereinigde en gecoate coverslip wordt bevestigd aan de beeldkamer met de coatingzijde naar de binnenkant van de perfusieput. (B) Stroomdiagram ter illustratie van de stappen voor conditionering van beeldvormingskamers voor biotine-streptavidin-verbindingen. (C) Voorbeelden van reacties die worden gebruikt om TIRF-films van dynamische microtubuli en actinefilamenten te verkrijgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> Figuur 2. Beeldsequenties van groeiende actinefilamenten en microtubuli in afwezigheid of aanwezigheid van Tau. Time-lapse beeldmontage van TIRF-assays met 0,5 μM actine (10% Alexa-647-actine en 0,09% biotine-actine gelabeld) en 15 μM vrij tubuline (4% HiLyte-488 gelabeld) in afwezigheid (A) of aanwezigheid (B) van 250 nM Tau. De tijd die is verstreken vanaf de reactie-initiatie (mengen van buis A en buis B) wordt weergegeven. Schaalbalken, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> Figuur 3. Voorbeeldmetingen van microtubuli en actinefilamentdynamica. (A) Gemiddelde tijdprojectie van het tubulinekanaal visualiseert efficiënt de totale microtubulilengtes voor de lijnscans die worden gebruikt om kymografische plots te genereren. Zwarte stippellijnen komen overeen met de twee voorbeeld kymografen van dynamische microtubuli die rechts worden weergegeven. De groeifasen (effen zwarte lijnen) en demontagefasen (gedopeerde roze lijnen; twee aangeduid met roze pijlen) van microtubuli worden op elke kymograaf weergegeven. Tijdschaalbalk, 3 min. Lengte schaalbalk, 10 μm. Reaction bevat 0,5 μM actine (10% 647-label) en 15 μM vrij tubuline (4% 488-HiLyte label). Alleen het tubulinekanaal wordt weergegeven. (B) Twee voorbeeld time-lapse beeldmontages die single-actine filamenten weergeven die actief polymeriseren. Reksnelheden worden berekend als de helling van plots van de lengte van actinefilamenten in de loop van de tijd per micromolair actine. Daarom moet een correctiefactor van twee worden toegepast op actinereacties van 0,5 μM ter vergelijking voor snelheden die doorgaans worden bepaald bij de actineconcentratie van 1 μM. Voorbeelden van vijf filamenten zijn rechts weergegeven. Schaalstaven, 10 μm. Reaction bevat 0,5 μM actine (10% 647-label) en 15 μM vrij tubuline (4% 488-HiLyte label). Alleen het actinekanaal wordt weergegeven. (C) TIRF-beelden van dynamische microtubuli (MT) (groen) en actinefilamenten (paars) die polymeriseren in afwezigheid (links) of aanwezigheid van 250 nM Tau (midden). Blauwe stippellijnen en pijlen markeren waar een lijn is getekend voor de lijnscanplots die overeenkomen met elke voorwaarde (onder elke afbeelding). Overlap tussen microtubuli en actineregio's (weergegeven als zwart) kan worden gescoord op een bepaald tijdstip per gebied (rechts). Schaalbalken, 25 μm. Reacties bevatten 0,5 μM actine (10% 647-label) en 15 μM vrij tubuline (4% 488-HiLyte label) met of zonder 250 nM Tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Ondanks vele voorbeelden van coördinatie, onderzoeken de meeste studies de actine- of microtubule-eiwitten individueel. Deze methode maakt de visualisatie van beide dynamische polymeren in één reactie mogelijk. Deze techniek stelt de gebruiker in staat om diverse regulerende eiwitten te beoordelen op emergente eigenschappen die alleen kunnen worden gezien met dynamische versies van actine en microtubuli.Deze techniek kan worden uitgebreid met lipiden of extracten om dichter bij het bouwen van een synthetische cel te komen. Begin met het ontdooien van aliquots van PEG-Silaan en Biotine-PEG-Silaanpoeders en los de PEG-poeders op in 80% ethanol om de coatingvoorraadoplossingen van 10 milligram per milliliter mPEG-Silaan en twee tot vier milligram per milliliter Biotine-PEG-Silaan te genereren. Verwijder de schone afdekslip uit de ethanolopslag met behulp van een tang.Droog met stikstofgas en bewaar in een schone petrischaal. Bedek de afdekslips met 100 microliter coatingoplossing en incubeer ze bij 70 graden Celsius gedurende ten minste 18 uur of tot gebruik. Knip 12 stroken dubbelzijdige tape met dubbele rug tot een lengte van 24 millimeter.Verwijder één kant van de taperug en bevestig stukjes tape naast de zes groeven die aanwezig zijn op een schone beeldkamer. Verwijder het tweede stuk taperug om de kleverige kant van de tape langs elke kamergroef bloot te leggen en plaats de kamertape met de zijkant naar boven op een schoon oppervlak. Meng epoxyhars en verharderoplossingen één-op-één in een kleine weegboot en gebruik een P1000-tip om een druppel gemengde epoxy tussen de tapestrips aan het einde van elke groef van de beeldkamer te plaatsen.Plaats vervolgens de kamer, tape of epoxy met de zijkant naar boven, op een schoon oppervlak. Verwijder een gecoate afdekslip uit de incubator van 70 graden Celsius en spoel de gecoate en ongecoate oppervlakken van de afdekslip zes keer af met dubbel gedestilleerd water. Droog met gefilterd stikstofgas en bevestig vervolgens aan de beeldkamer met de cover slip coating kant naar de tape.Gebruik een P200- of P1000-pipetpunt om druk uit te oefenen op de interface van getapete glas om een goede afdichting tussen de tape en de afdekslip te garanderen. Incubeer de geassembleerde kamers bij kamertemperatuur gedurende ten minste vijf tot 10 minuten om de epoxy in staat te stellen de kamerputten volledig af te dichten voor gebruik. Perfusiekamers verlopen binnen 12 tot 18 uur na montage.Gebruik een perfusiepomp en wissel sequentieel conditioneringsoplossingen uit in de perfusiekamer door 50 microliter van 1% BSA te laten stromen om de beeldkamer te primen. Verwijder de overtollige buffer uit het reservoir van de kunstaasvergrendeling. Laat vervolgens 50 microliter van 0,005 milligram per milliliter streptavidin stromen en incubeer gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur.Verwijder de overtollige buffer uit het reservoir. Stroom 50 microliter van 1% BSA om de niet-specifieke binding te blokkeren en gedurende 10 tot 30 seconden te incuberen. Verwijder de overtollige buffer uit het reservoir.Vervolgens vloei 50 microliter warme 1x TIRF-buffer en vervolgens 50 microliter gestabiliseerde en 50% gebiotinyleerde microtubulizaden verdund in 1x TIRF-buffer. Stel het podium of het objectiefverwarmingsapparaat in om de temperatuur van 35 tot 37 graden Celsius gedurende 30 minuten te handhaven voordat de eerste biochemische reactie in beeld wordt gebracht. Stel vervolgens het acquisitie-interval in op elke vijf seconden gedurende 15 tot 20 minuten.Stel vervolgens 488 en 647 laserblootstellingen in op 50 tot 100 milliseconden bij 5% tot 10% vermogen door eerst de polymerisatiereactie aan te passen om de actinefilamentassemblage te initiëren. Verkrijg de beelden op 647 nanometer en breng de juiste aanpassingen aan. Pas vervolgens de polymerisatiereactie aan in een tweede geconditioneerde perfusieput om de assemblage van microtubuli te initiëren.Visualiseer op 488 nanometer en breng de juiste aanpassingen aan. Combineer drie microliter van 10 micromolair 488 tubuline met de 7,2 microliter aliquot van 100 micromolair fluorescerend ongelabeld tubuline niet meer dan 15 minuten voor gebruik. Combineer vervolgens drie microliter verdunde biotine-gerelateerde actine in geschikte volumes fluorescerend ongelabeld en gelabeld actine, zodat de uiteindelijke mix 12,5 micromolair totaal actine zal zijn met 10% tot 30% fluorescerend label.Bereid het cytoskeletmengsel door twee microliter van de 12,5 micromolaire actinemix niet meer dan 15 minuten voorafgaand aan de beeldvorming te combineren met de tubuline-bouillonmix. Bewaren op ijs tot gebruik. Bereid de eiwitreactiemix voor door alle andere experimentele componenten en eiwitten te combineren, waaronder 2x TIRF-buffer, antibleekmiddel, nucleotiden, buffers en accessoire-eiwitten.Incubeer het cytoskeletmengsel en de eiwitreactiemix afzonderlijk bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 60 seconden. Om de reactie in gang te zetten, voegt u de inhoud van het eiwitreactiemengsel toe aan het cytoskeletmengsel en mengt u het. Stroom 50 microliter van het reactiemengsel met 1x TIRF-buffer aangevuld met 15 micromolaire vrije tubuline, één millimol gtp, 0,5 micromolaire actinemonomeren en geschikte volumes bufferregelaars naar de perfusiekamer.Neem een time-lapse-film op met behulp van microscoopsoftware om elke vijf seconden gedurende 15 tot 20 minuten te verkrijgen. Conditioneer een nieuwe perfusieput en vervang het buffervolume door het regulerende eiwit van belang en buffercontroles. Verwerven om de regulerende eiwitten voor emergente actine microtubule functies te beoordelen.Voorbeeldmetingen van microtubuli en actinefilamentdynamiek worden in deze afbeeldingen getoond. De gemiddelde tijdprojectie van het tubulinekanaal visualiseert efficiënt de totale microtubulilengtes voor de lijnscans die worden gebruikt om de Kymograafplots te genereren. Zwarte stippellijnen komen overeen met de twee voorbeeld Kymografen van de dynamische microtubuli.De groei- en demontagefasen van microtubuli worden op elke Kymograaf weergegeven. Twee voorbeelden van timelapse-beeldmontages van enkele actinefilamenten die actief polymeriseren, worden hier weergegeven. Reksnelheden worden berekend als de helling van de plots van de lengte van actinefilamenten in de loop van de tijd per micromolaire actine.Er moet dus een correctiefactor van twee worden toegepast op 0,5 micromolaire actinereacties om de snelheden te vergelijken die typisch worden bepaald bij de ene micromolaire actineconcentratie. Voorbeelden van vijf filamenten worden hier getoond. Totale interne reflectiefluorescentie, of TIRF-beelden van de dynamische microtubuli in actinefilamenten die polymeriseren in afwezigheid of aanwezigheid van 250 nanomolaire Tau worden hier weergegeven.Blauwe stippellijnen en pijlen markeren dat er een lijn is getekend voor de lijnscanplots die overeenkomen met elke voorwaarde. Overlap tussen de microtubuli in de actineregio's kan worden gescoord op een bepaald tijdstip per gebied. Cytoskeletale eiwitten, met name actine, microtubuli en hun regulatoren zijn erg gevoelig voor vries- / dooicycli.Gebruik voor consistentie en succes zeer zuivere en goed opgeslagen eiwitten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Diffusional Dynamics of Gold Nanorods visualiseren op celmembraan met behulp van Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Beeldvorming van Podocytische eiwitten Nephrin, Actine en Podocine met expansiemicroscopie

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...