Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Je suis reconnaissant à Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) et Brian Haarer (SUNY Upstate) pour leurs commentaires utiles sur ce protocole. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (GM133485).

Il n’y a pas de conflits d’intérêts à divulguer.

L’utilisation de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser des protéines purifiées a été une approche fructueuse et convaincante pour disséquer des mécanismes uniques de régulation du cytosquelette 5,23,24,25,26,27,35. Par rapport aux essais biochimiques traditionnels, les réactions TIRF nécessitent de très petits volumes (50-100 μL), et des mesures quantitatives de la dynamique du cytosquelette peuvent être glanées à partir d’un essai individuel. La plupart des études sur la dynamique du cytosquelette se concentrent sur un seul système polymère (c’est-à-dire les filaments d’actine ou les microtubules), de sorte que les mesures détaillées de la diaphonie ou des comportements émergents entre les filaments d’actine et les microtubules généralement observés dans les cellules sont restées insaisissables et difficiles à récapituler dans le tube à essai. Pour résoudre ce problème, ce protocole décrit un système de microscopie TIRF à filament unique qui permet la visualisation directe d’actine dynamique et de polymères de microtubules dans la même réaction biochimique. Ainsi, cette méthode va au-delà des essais traditionnels qui récapitulent le comportement dynamique des filaments d’actine ou des microtubules seuls. Cette technique a également été réalisée avec Tau comme exemple de la façon dont plusieurs propriétés dynamiques changent en présence d’un facteur de couplage du cytosquelette. Ce protocole peut être utilisé avec des protéines supplémentaires connues ou soupçonnées de coordonner la dynamique de l’actine ou des microtubules, y compris (mais sans s’y limiter) MACF, GAS, formines, etc. Enfin, les exemples d’analyses fournis peuvent être utilisés comme guide pour quantifier les données acquises avec ce protocole.
« Voir, c’est croire » est une raison impérieuse d’effectuer des tests basés sur la microscopie. Toutefois, la prudence est de mise dans l’exécution et l’interprétation des expériences de microscopie de la FRBR. L’un des principaux défis des tests de co-assemblage du cytosquelette est que de nombreuses conditions d’imagerie couramment utilisées ne sont pas compatibles avec chaque polymère. Les microtubules et l’actine ont généralement des exigences différentes en matière de tampon, de température, de sel, de nucléotide et de concentration pour la polymérisation. L’actine, la tubuline, les protéines régulatrices d’intérêt et les tampons utilisés dans ce protocole sont sensibles aux cycles de gel-dégel. Par conséquent, une manipulation prudente des protéines et des tampons est nécessaire pour exécuter avec succès ce protocole. Pour atténuer bon nombre de ces préoccupations, il est fortement recommandé d’utiliser de la tubuline fraîchement recyclée (congelée pendant <6 semaines) et de pré-éliminer les actines congelées/remises en suspension par ultracentrifugation. Ces considérations s’appliquent également à la myriade de protéines régulatrices à évaluer avec cette procédure, qui peuvent être sensibles aux cycles de gel-dégel ou à la concentration de sels tampons 5,11,36.
Malheureusement, il n’existe pas de tampon unique sans compromis expérimentaux. Pour s’approprier plus de volume pour les protéines de concentration plus faible, l’ATP et le GTP peuvent être inclus dans la solution tampon 2x TIRF (figure 1C). Cependant, comme ces nucléotides sont extrêmement sensibles aux cycles de gel-dégel, il n’est pas recommandé. Les composés piégeurs d’oxygène utilisés ici (c.-à-d. la catalase et la glucose-oxydase) sont nécessaires pour visualiser les protéines pendant de longues périodes de temps (de quelques minutes à quelques heures), mais sont connus pour restreindre la polymérisation des microtubules à des concentrations élevées5. En ce qui concerne ces considérations de tampon, une limitation de ce protocole est que certaines protéines régulatrices canoniques associées aux microtubules peuvent nécessiter plus ou moins de sel pour récapituler les fonctions trouvées dans les cellules ou les essais utilisant des microtubules seuls (sans actine). La modification de la nature ou de la concentration du sel pour répondre à ces préoccupations influencera probablement les taux de polymérisation des filaments d’actine et/ou les paramètres de la dynamique des microtubules. Des mesures de plusieurs paramètres descriptifs (minimal, nucléation, taux d’allongement et stabilité) (figure 3) sont nécessaires pour confirmer le succès du protocole ou pour documenter explicitement les effets de tampons ou de protéines régulatrices spécifiques. Par exemple, une trop grande polymérisation de filaments d’actine peut masquer les événements de couplage actine-microtubule en quelques secondes. Par conséquent, le réglage fin des conditions expérimentales en abaissant la concentration globale d’actine ou en incluant des protéines supplémentaires pour supprimer la nucléation de l’actine (c.-à-d. la profiline) prolongera la période globale pendant laquelle les activités coordonnées actine-microtubule peuvent être vues clairement. Les contrôles répondant à ces conditions préalables et les réplications techniques (au-delà de plusieurs champs de vision) sont essentiels pour que les utilisateurs génèrent des résultats fiables et reproductibles.
Les études cellulaires offrent une possibilité limitée d’observer les relations directes protéine-protéine ou l’action des complexes régulateurs. En revanche, certains des mécanismes glanés dans les essais in vitro ne reflètent pas toujours les comportements exacts des protéines observées dans les cellules. Ce dilemme biochimiste classique peut être abordé dans les applications futures de cette technique avec des modifications spécifiques. Par exemple, l’ajout de protéines de couplage fonctionnelles marquées par fluorescence élargit cette méthode des études à filament unique aux études à molécule unique. Les essais peuvent être modifiés pour utiliser des extraits cellulaires qui peuvent ajouter les facteurs clés inconnus « manquants » nécessaires pour récapituler les phénomènes cellulaires. Par exemple, les essais à base de TIRF utilisant des extraits de levure ou de Xenopus ont reconstitué les anneaux d’actomyosine contractile37, les fuseaux mitotiques26,38, les composants de l’assemblage d’actine ou de microtubule39,40, et même la dynamique au niveau du centrosome et des kinétochores 36,41,42,43 . De plus, de tels systèmes peuvent ouvrir la voie à des systèmes cellulaires artificiels qui ont des lipides ou des facteurs de signalisation présents 44,45,46.

Historiquement, l’actine et les microtubules ont été considérés comme des entités distinctes, chacune avec son propre ensemble de protéines régulatrices, de comportements dynamiques et d’emplacements cellulaires distincts. De nombreuses preuves démontrent maintenant que les polymères d’actine et de microtubules s’engagent dans des mécanismes de diaphonie fonctionnels qui sont essentiels à l’exécution de nombreux processus cellulaires, notamment la migration, le positionnement du fuseau mitotique, le transport intracellulaire et la morphologie cellulaire 1,2,3,4. Les divers comportements coordonnés qui sous-tendent ces exemples dépendent d’un équilibre complexe de facteurs de couplage, de signaux et de propriétés physiques. Cependant, les détails moléculaires qui sous-tendent ces mécanismes sont encore largement inconnus car la plupart des études se concentrent sur un seul polymère cytosquelettique à la fois 1,2,5.
L’actine et les microtubules n’interagissent pas directement 6,7,8. La dynamique coordonnée de l’actine et des microtubules observée dans les cellules est médiée par d’autres facteurs. De nombreuses protéines censées réguler la diaphonie actine-microtubule ont été identifiées et leurs activités sont bien caractérisées en ce qui concerne l’un ou l’autre polymère cytosquelettique seul 1,2. De plus en plus de preuves suggèrent que cette approche à polymère unique a dissimulé les doubles fonctions de certaines des protéines / complexes qui permettent les événements de couplage actine-microtubule 7,8,9,10,11,12,13. Les expériences où les deux polymères sont présents sont rares et définissent souvent des mécanismes avec un seul polymère dynamique et une version stabilisée statique de l’autre 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Ainsi, des méthodes sont nécessaires pour étudier les propriétés émergentes des protéines de coordination actine-microtubule qui ne peuvent être pleinement comprises que dans les systèmes expérimentaux qui utilisent les deux polymères dynamiques.
La combinaison d’approches de marquage direct des protéines, de marqueurs d’affinité génétiquement codés et de microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) a été appliquée avec beaucoup de succès dans les systèmes de reconstitution biomimétique 19,20,21,22,23. De nombreux schémas ascendants ne contiennent pas tous les facteurs qui régulent les protéines dans les cellules. Cependant, la technologie de la « biochimie sur un verre de couverture » a affiné de nombreux mécanismes de la dynamique de l’actine et des microtubules à des échelles spatiales et temporelles élevées, y compris les composants nécessaires à l’assemblage ou au démontage des polymères et au mouvement des protéines motrices 5,12,23,24,25,26,27 . Ici, une approche monofila filamenteuse à composant minimal pour étudier le couplage actine-microtubule in vitro est décrite. Ce protocole peut être utilisé avec des protéines purifiées disponibles dans le commerce ou très pures, des protéines marquées par fluorescence, des chambres de perfusion, et étendu à des schémas plus complexes contenant des extraits de cellules ou des systèmes synthétiques. Ici, la protéine Tau disponible dans le commerce est utilisée pour démontrer comment la dynamique du cytosquelette change en présence d’une protéine de couplage actine-microtubule, mais peut être substituée à d’autres facteurs de coordination actine-microtubule putatifs. L’avantage majeur de ce système par rapport à d’autres approches est la possibilité de surveiller simultanément la dynamique de plusieurs polymères cytosquelettiques en une seule réaction. Ce protocole fournit également aux utilisateurs des exemples et des outils simples pour quantifier les changements dans les polymères cytosquelettiques. Ainsi, les utilisateurs du protocole produiront des données fiables, quantitatives et de résolution d’un seul filament pour décrire les mécanismes qui sous-tendent la façon dont diverses protéines régulatrices coordonnent la dynamique actine-microtubule.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Traditionnellement, les cytosquelettes d’actine et de microtubules ont été étudiés en tant qu’entités distinctes, limitées à des régions ou des processus cellulaires spécifiques et régulées par différentes suites de protéines de liaison uniques pour chaque polymère. De nombreuses études démontrent maintenant que la dynamique des deux polymères cytosquelettiques est entrelacée et que cette diaphonie est nécessaire pour la plupart des comportements cellulaires. Un certain nombre de protéines impliquées dans les interactions actine-microtubule ont déjà été identifiées (c.-à-d. Tau, MACF, GAS, formines, etc.) et sont bien caractérisées en ce qui concerne l’actine ou les microtubules seuls. Cependant, relativement peu d’études ont montré des tests de coordination actine-microtubule avec des versions dynamiques des deux polymères. Cela peut entraîner des mécanismes de liaison émergents entre l’actine et les microtubules. Ici, une technique de reconstitution in vitro basée sur la microscopie par fluorescence interne totale (TIRF) permet de visualiser à la fois la dynamique de l’actine et des microtubules à partir d’une seule réaction biochimique. Cette technique préserve la dynamique de polymérisation du filament d’actine ou des microtubules individuellement ou en présence de l’autre polymère. La protéine Tau disponible dans le commerce est utilisée pour démontrer comment les comportements actine-microtubule changent en présence d’une protéine de réticulation cytosquelettique classique. Cette méthode peut fournir des informations fonctionnelles et mécanistes fiables sur la façon dont les protéines régulatrices individuelles coordonnent la dynamique actine-microtubule à une résolution de filaments uniques ou de complexes d’ordre supérieur.

Dans les conditions décrites ci-dessus (Figure 1), les polymères d’actine et de microtubules doivent être visibles (et dynamiques) dans les 2 minutes suivant l’acquisition de l’image (Figure 2). Comme pour tout protocole basé sur la biochimie, une optimisation peut être nécessaire pour différentes protéines régulatrices ou lots de protéines. Pour ces raisons, l’angle TIRF et les expositions d’image sont définis en premier avec des réactions contenant chaque polymère individuel. Cela confirme que les protéines stockées sont fonctionnelles et qu’une quantité suffisante de protéines marquées est présente pour la détection. Bien qu’il ne soit pas toujours nécessaire (et non effectué ici), le post-traitement des films (c’est-à-dire la soustraction d’arrière-plan, la moyenne ou les transformations de Fourier) peut être utilisé pour améliorer le contraste de l’image (en particulier des microtubules)5,25,33. La visualisation directe des filaments d’actine simples et des microtubules offerte par ce test permet de déterminer quantitativement plusieurs mesures dynamiques pour l’un ou l’autre composant du cytosquelette seul ou ensemble, y compris les paramètres de polymérisation (c.-à-d. la vitesse de nucléation ou d’allongement), les paramètres de désassemblage (c.-à-d. les taux de retrait ou les catastrophes) et le coalignage/chevauchement des polymères (figure 3). ). De plus, ces mesures peuvent servir de point de départ pour déchiffrer la liaison ou l’influence de ligands régulateurs comme Tau (Figure 3). De nombreuses mesures de filaments d’actine simples ou de microtubules peuvent être effectuées à partir d’un seul film TIRF. Cependant, en raison des variations dans le revêtement de couverture, le pipetage et d’autres facteurs, des mesures fiables devraient également inclure de multiples réactions / films de réplication technique.
De nombreuses facettes de la dynamique des microtubules peuvent être déterminées à partir d’exemples de kymographes, y compris le taux d’allongement des microtubules, ainsi que la fréquence des catastrophes et des événements de sauvetage (Figure 3A). L’utilisation de kymographes pour mesurer la dynamique de l’actine dans ce système n’est pas aussi simple car les filaments d’actine sont plus alambiqués que les microtubules. En conséquence, les paramètres de la dynamique des filaments d’actine sont mesurés à la main, ce qui prend du temps et demande beaucoup de travail. Les numérations sont mesurées comme le nombre de filaments d’actine présents à un point temporel cohérent pour toutes les conditions. Ces comptes varient considérablement d’un domaine d’imagerie TIRF à l’autre, mais peuvent être utilisés avec de nombreux réplicats ou pour compléter les observations d’autres essais de polymérisation. Les numérations de nucléation peuvent également être utilisées pour les microtubules si les conditions d’essai manquent de graines de microtubules stabilisées. Les taux d’allongement du filament d’actine sont mesurés comme la longueur du filament au fil du temps à partir d’au moins quatre images de film. Les valeurs de vitesse sont transmises par actine micromolaire avec un facteur de correction de 370 sous-unités pour tenir compte du nombre de monomères d’actine dans un micron de filament (Figure 3B)32. Les mesures permettant de définir les comportements coordonnés entre l’actine et les microtubules sont moins bien définies. Cependant, des analyses corrélatives ont été appliquées pour mesurer la coïncidence des deux polymères, y compris les balayages linéaires (Figure 3C) ou les logiciels de chevauchement 5,11,34.
Disponibilité des données : Tous les ensembles de données associés à ce travail ont été déposés dans Zenodo et sont disponibles sur demande raisonnable à l’adresse suivante: 10.5281 / zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> Graphique 1. Schémas expérimentaux : assemblage de la chambre d’écoulement à l’acquisition d’images. (A) Assemblage de la chambre d’imagerie. De haut en bas : les chambres d’imagerie IBIDI sont scotchées le long des puits de perfusion (désignés par une flèche) ; la deuxième couche (blanche) de support de bande (laissée sur l’image montrée pour mieux orienter les utilisateurs) est retirée et l’époxy est appliqué au bord de la chambre de perfusion (flèche). Remarque: Pour orienter plus facilement les utilisateurs où placer l’époxy, le support blanc a été laissé sur cette image. Le couvercle nettoyé et revêtu est fixé à la chambre d’imagerie avec le côté revêtement orienté vers l’intérieur du puits de perfusion. (B) Organigramme illustrant les étapes du conditionnement des chambres d’imagerie pour les liaisons biotine-streptavidine. C) Exemples de réactions utilisées pour acquérir des films TIRF de microtubules dynamiques et de filaments d’actine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> Graphique 2. Séquences d’images de filaments d’actine et de microtubules en croissance en l’absence ou en présence de Tau. Montage d’images en accéléré à partir de tests TIRF contenant 0,5 μM d’actine (10 % d’Alexa-647-actine et 0,09 % de biotine-actine marquée) et 15 μM de tubuline libre (4 % marquée HiLyte-488) en l’absence (A) ou en présence (B) de 250 nM Tau. Le temps écoulé depuis l’amorçage de la réaction (mélange du tube A et du tube B) est indiqué. Barres d’échelle, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> Graphique 3. Exemples de mesures de microtubules et de dynamique des filaments d’actine. (A) La projection temporelle moyenne du canal de tubuline permet de visualiser efficacement les longueurs totales de microtubules pour les balayages linéaires utilisés pour générer des diagrammes kymographiques. Les lignes pointillées noires correspondent aux deux exemples de kymographes de microtubules dynamiques représentés à droite. Les phases de croissance (lignes noires pleines) et de démontage (lignes roses pointillées; deux signalées par des flèches roses) des microtubules sont indiquées sur chaque kymographe. Barre d’échelle de temps, 3 min. Barre d’échelle de longueur, 10 μm. La réaction contient 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte). Seul le canal de la tubuline est affiché. (B) Deux exemples de montages d’images en accéléré représentant des filaments à actine unique polymérisés activement. Les taux d’allongement sont calculés comme la pente des placettes de la longueur des filaments d’actine au fil du temps par actine micromolaire. Ainsi, un facteur de correction de deux doit être appliqué aux réactions d’actine de 0,5 μM pour comparaison des taux généralement déterminés à la concentration d’actine de 1 μM. Des exemples de cinq filaments sont montrés à droite. Barres d’échelle, 10 μm. La réaction contient 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte). Seul le canal d’actine est affiché. C) Images TIRF de microtubules dynamiques (MT) (vert) et de filaments d’actine (violet) polymérisés en l’absence (à gauche) ou en présence de 250 nM Tau (au milieu). Des lignes pointillées bleues et des flèches marquent l’endroit où une ligne a été tracée pour les tracés de balayage de ligne correspondant à chaque condition (sous chaque image). Le chevauchement entre les microtubules et les régions d’actine (en noir) peut être noté à un point de temps défini par zone (à droite). Barres d’échelle, 25 μm. Les réactions contiennent 0,5 μM d’actine (10 % d’étiquette 647) et 15 μM de tubuline libre (étiquette 4 % 488-HiLyte) avec ou sans 250 nM De Tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Ce protocole est un guide pour visualiser l’actine dynamique et les microtubules à l’aide d’un test de microscopie à fluorescence interne totale (TIRF) in vitro .

Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Malgré de nombreux exemples de coordination, la plupart des études examinent individuellement les protéines d’actine ou de microtubules. Cette méthode permet de visualiser les deux polymères dynamiques en une seule réaction. Cette technique permet à l’utilisateur d’évaluer diverses protéines régulatrices pour des propriétés émergentes qui ne pouvaient être observées qu’avec des versions dynamiques d’actine et de microtubules.Cette technique peut être étendue pour inclure des lipides ou des extraits pour se rapprocher de la construction d’une cellule synthétique. Commencez par décongeler les aliquotes de poudres PEG-Silane et Biotin-PEG-Silane, et dissolvez les poudres PEG dans de l’éthanol à 80% pour générer les solutions mères de revêtement de 10 milligrammes par millilitre mPEG-Silane et de deux à quatre milligrammes par millilitre Biotine-PEG-Silane. Retirez le couvercle propre du stockage de l’éthanol à l’aide d’une pince.Sécher avec de l’azote gazeux et conserver dans une boîte de Pétri propre. Enduisez les couvercles de 100 microlitres de solution de revêtement et incuvrez-les à 70 degrés Celsius pendant au moins 18 heures ou jusqu’à utilisation. Coupez 12 bandes de ruban adhésif double face à double dos sur une longueur de 24 millimètres.Retirez un côté du support de bande et fixez des morceaux de ruban adhésif adjacents aux six rainures présentes sur une chambre d’imagerie propre. Retirez le deuxième morceau de support de bande pour exposer le côté collant de la bande le long de chaque rainure de chambre et placez le côté de la bande de chambre vers le haut sur une surface propre. Mélangez la résine époxy et les solutions de durcisseur un à un dans un petit bateau de pesage et utilisez une pointe P1000 pour placer une goutte d’époxy mélangé entre les bandes de ruban à l’extrémité de chaque rainure de la chambre d’imagerie.Ensuite, placez la chambre, le ruban adhésif ou le côté époxy vers le haut, sur une surface propre. Retirez un couvercle enduit de l’incubateur à 70 degrés Celsius et rincez les surfaces enduites et non revêtues des couvercles avec de l’eau distillée double six fois. Sécher avec de l’azote gazeux filtré, puis fixer à la chambre d’imagerie avec le revêtement de glissement du couvercle vers le ruban adhésif.Utilisez une pointe de pipette P200 ou P1000 pour appliquer une pression sur l’interface en verre collé afin d’assurer une bonne étanchéité entre le ruban adhésif et le glissement du couvercle. Incuber les chambres assemblées à température ambiante pendant au moins cinq à 10 minutes pour permettre à l’époxy de sceller complètement les puits de la chambre avant utilisation. Les chambres de perfusion expirent dans les 12 à 18 heures suivant l’assemblage.Utilisez une pompe de perfusion et échangez séquentiellement des solutions de conditionnement dans la chambre de perfusion en faisant couler 50 microlitres de 1% BSA pour amorcer la chambre d’imagerie. Retirez l’excès de tampon du réservoir de verrouillage du leurre. Ensuite, faites couler 50 microlitres de 0,005 milligramme par millilitre de streptavidine et incubez pendant une à deux minutes à température ambiante.Retirez l’excès de tampon du réservoir. Débitez 50 microlitres de 1% BSA pour bloquer la liaison non spécifique et incuber pendant 10 à 30 secondes. Retirez l’excès de tampon du réservoir.Ensuite, faites circuler 50 microlitres de tampon CHAUD 1x TENF, puis 50 microlitres de graines de microtubules stabilisées et biotinylées à 50% diluées dans 1x tampon TIRF. Réglez la scène ou le dispositif de chauffage de l’objectif pour maintenir une température de 35 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant d’imager la première réaction biochimique. Ensuite, réglez l’intervalle d’acquisition à toutes les cinq secondes pendant 15 à 20 minutes.Ensuite, réglez les expositions laser 488 et 647 à 50 à 100 millisecondes à 5% à 10% de puissance en ajustant d’abord la réaction de polymérisation pour initier l’assemblage du filament d’actine. Acquérir les images à 647 nanomètres et effectuer les ajustements appropriés. Ensuite, ajustez la réaction de polymérisation dans un deuxième puits de perfusion conditionné pour initier l’assemblage des microtubules.Visualisez à 488 nanomètres et effectuez les ajustements appropriés. Combiner trois microlitres de 10 micromolaires 488 tubuline avec l’aliquote de 7,2 microlitres de 100 micromolaires de tubuline micromolaire non marquée par fluorescence au plus tard 15 minutes avant utilisation. Ensuite, combinez trois microlitres d’actine diluée liée à la biotine dans des volumes appropriés d’actine fluorescente non marquée et marquée de sorte que le mélange final sera de 12,5 micromolaires d’actine totale avec une étiquette fluorescente de 10% à 30%.Préparez le mélange de cytosquelette en combinant deux microlitres du mélange d’actine de 12,5 micromolaires avec le mélange de tubuline au plus tard 15 minutes avant l’imagerie. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation. Préparez le mélange de réactions protéiques en combinant tous les autres composants expérimentaux et protéines, y compris 2x tampon TIRF, anti-eau de Javel, nucléotides, tampons et protéines accessoires.Incuber le mélange de cytosquelette et le mélange de réaction protéique séparément à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 secondes. Pour initier la réaction, ajoutez le contenu du mélange de réaction protéique au mélange de cytosquelette et mélangez-le. Débiter 50 microlitres du mélange réactionnel contenant 1x tampon TIRF complété par 15 tubulines libres micromolaires, un GTP millimolaire, 0,5 monomère d’actine micromolaire et des volumes appropriés de contrôles tampons dans la chambre de perfusion.Enregistrez un film en accéléré à l’aide d’un logiciel de microscope pour l’acquérir toutes les cinq secondes pendant 15 à 20 minutes. Conditionnez un nouveau puits de perfusion et remplacez le volume tampon par la protéine régulatrice d’intérêt et les contrôles tampons. Acquérir pour évaluer les protéines régulatrices des fonctions émergentes des microtubules d’actine.Des exemples de mesures de microtubules et de dynamique des filaments d’actine sont montrés dans ces images. La projection temporelle moyenne du canal de tubuline visualise efficacement les longueurs totales de microtubules pour les balayages linéaires utilisés pour générer les diagrammes kymographiques. Les lignes pointillées noires correspondent aux deux exemples de kymographes des microtubules dynamiques.Les phases de croissance et de démontage des microtubules sont indiquées sur chaque kymographe. Deux exemples de montages d’images en accéléré représentant des filaments d’actine simples polymérisant activement sont présentés ici. Les taux d’allongement sont calculés comme la pente des tracés de la longueur des filaments d’actine au fil du temps par actine micromolaire.Ainsi, un facteur de correction de deux doit être appliqué à 0,5 réaction d’actine micromolaire pour comparer les taux généralement déterminés à la concentration d’actine micromolaire. Des exemples de cinq filaments sont présentés ici. La fluorescence totale par réflexion interne, ou images TIRF des microtubules dynamiques dans les filaments d’actine polymérisés en l’absence ou en présence de 250 nanomolaires Tau sont montrées ici.Les lignes pointillées bleues et les flèches marquent l’usure une ligne a été tracée pour les tracés de balayage linéaire correspondant à chaque condition. Le chevauchement entre les microtubules dans les régions de l’actine peut être noté à un point de temps défini par zone. Les protéines du cytosquelette, en particulier l’actine, les microtubules et leurs régulateurs sont très sensibles aux cycles de gel / dégel.Pour la cohérence et le succès, utilisez des protéines très pures et correctement stockées.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Mesure de la liaison des protéines à la F-actine par co-sédimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Recherche

Biochimie

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagerie des tissus amyloïdes colorées avec Luminescent thiol conjugués par Hyperspectral confocale microscopie et imagerie de Fluorescence Lifetime

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Haute sensibilité mesure des affinités de liaison de l’ADN-facteur de Transcription par titrage concurrentiel à l’aide de la microscopie en Fluorescence

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisation de la dynamique diffusionnelle des nanorods d’or sur la membrane cellulaire à l’aide d’une microscopie darkfield nanoparticule unique

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Imagerie des protéines podocytiques Nephrin, Actin et Podocin avec microscopie d’expansion

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...