Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Ich danke Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) und Brian Haarer (SUNY Upstate) für hilfreiche Kommentare zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (GM133485) unterstützt.

1. Waschen der Deckgläser
HINWEIS: Wash (24 mm x 60 mm, #1.5) Deckgläser gemäß Smith et al., 201328.
<ol><li>Ordnen Sie Deckgläser in einem Kunststoff-Dia-Mailer-Behälter an.</li>
	<li>Deckgläser nacheinander in die folgenden Lösungen tauchen und 30-60 min beschallen, mit ddH 2 O 10 mal zwischen jeder Lösungspülen: ddH2O mit einem Tropfen Spülmittel; 0,1 Mio. KOH. Lagern Sie Deckgläser in 100% Ethanol für bis zu 6 Monate. HINWEIS: Berühren Sie Glasoberflächen nicht mit unbehandschuhten Fingern. Verwenden Sie stattdessen eine Pinzette.</li>
</ol>2. Beschichtung gereinigte (24 mm x 60 mm, #1,5) Deckgläser mit mPEG- und Biotin-PEG-Silan
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet speziell ein Biotin-Streptavidin-System, um Aktin und Mikrotubuli innerhalb der TIRF-Bildgebungsebene zu positionieren. Andere Beschichtungen und Systeme können verwendet werden (z. B. Antikörper, Poly-L-Lysin, NEM-Myosin usw.).
<ol><li>Auftauen von Aliquots von PEG-Silan- und Biotin-PEG-Silan-Pulvern.</li>
	<li>Lösen Sie PEG-Pulver in 80% Ethanol (pH 2,0) auf, um Beschichtungsmateriallösungen von 10 mg/ml mPEG-Silan und 2-4 mg/ml Biotin-PEG-silan kurz vor der Verwendung zu erzeugen. HINWEIS: PEG-Pulver erscheinen oft gelöst, sind aber möglicherweise nicht auf mikroskopischer Ebene. Die richtige Aufhängung dauert ~ 1-2 Minuten mit ständigem Pipettieren. Die Benutzer werden aufgefordert, nach dem Auftreten der Pulverauflösung weitere 10 Mal zu pipettieren. ACHTUNG: Tragen Sie Handschuhe, um die Haut vor konzentriertem HCl zu schützen, wenn Sie 80% Ethanol (pH 2,0) herstellen.</li>
	<li>Entfernen Sie das saubere (24 mm x 60 mm, #1.5) Deckglas mit einer Pinzette aus der Ethanollagerung. Mit Stickstoffgas trocknen und in einer sauberen Petrischale aufbewahren.</li>
	<li>Beschichten Sie Deckgläser mit 100 μL Beschichtungslösung: eine Mischung aus 2 mg/ml mPEG-Silan (MW 2.000) und 0,04 mg/ml Biotin-PEG-Silan (MW 3.400) in 80% Ethanol (pH 2,0). HINWEIS: Für die spärliche Beschichtung (empfohlen) verwenden Sie 2 mg / ml mPEG-Silan und 0,04 mg / ml Biotin-PEG-Silan. Für eine dichte Beschichtung verwenden Sie 2 mg / ml mPEG-Silan, 4 mg / ml Biotin-PEG-Silan.</li>
	<li>Deckgläser bei 70 °C mindestens 18 h oder bis zum Gebrauch inkubieren. HINWEIS: Beschichtete Deckgläser bauen sich ab, wenn sie länger als 2 Wochen bei 70 °C gelagert werden.</li>
</ol>3. Zusammenbau von bildgebenden Durchflusskammern
<ol><li>Schneiden Sie 12 Streifen doppelseitiges Klebeband auf eine Länge von 24 mm. Entfernen Sie eine Seite der Bandrückseite und befestigen Sie Bandstücke neben den sechs Rillen, die in einer sauberen Abbildungskammer vorhanden sind. HINWEIS: Das Band muss für die ordnungsgemäße Montage flach sein, da sonst die Bildgebungskammern undicht sind. Entfernen Sie vorsichtig die Bandrückseite, um Unebenheiten zu vermeiden. Es wird empfohlen, getapte Kammern auf einer sauberen Oberfläche zu gleiten, um Bandkammerkontakte zu glätten.</li>
	<li>Entfernen Sie das zweite Stück Bandrückseite, um die klebrige Seite des Bandes entlang jeder Kammernut freizulegen. Legen Sie das Kammerband mit der Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche.</li>
	<li>Mischen Sie Epoxidharz- und Härterlösungen 1:1 (oder nach Herstellerangaben) in einem kleinen Wägeboot.</li>
	<li>Verwenden Sie eine P1000-Spitze, um einen Tropfen gemischtes Epoxidharz zwischen die Bandstreifen am Ende jeder Nut der Bildgebungskammer zu legen (roter Pfeil; Abbildung 1A). Legen Sie Kammerband/Epoxidharz mit der Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche.</li>
	<li>Entfernen Sie ein beschichtetes Deckglas aus dem 70 °C Inkubator. Beschichtete und unbeschichtete Oberflächen von Deckgläsern mit ddH2O sechsmal abspülen, mit gefiltertem Stickstoffgas trocknen und dann mit der Deckglasbeschichtungsseite zum Band auf die Bildkammer aufbringen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine P200- oder P1000-Pipettenspitze, um Druck auf die Bandglasschnittstelle auszuüben, um eine gute Abdichtung zwischen dem Band und dem Deckglas zu gewährleisten. HINWEIS: Bei richtiger Abdichtung wird doppelseitiges Klebeband durchscheinend. Bildgebende Kammern ohne ausreichende Bandkammerkontakte werden undicht.</li>
	<li>Inkubieren Sie montierte Kammern bei Raumtemperatur für mindestens 5-10 Minuten, damit das Epoxidharz die Kammervertiefungen vor dem Gebrauch vollständig abdichten kann. Perfusionskammern laufen innerhalb von 12-18 Stunden nach der Montage ab. HINWEIS: Abhängig von der Platzierung des Bandes und der Dicke des verwendeten doppelseitigen Bandes hat die montierte Kammer ein Endvolumen von 20-50 μL.</li>
</ol>4. Konditionierung von Perfusionskammern
<ol><li>Verwenden Sie eine Perfusionspumpe (Rate auf 500 μL/min eingestellt), um Konditionierungslösungen in der Perfusionskammer wie folgt nacheinander auszutauschen:<ol>
<li>Fließen Sie 50 μL von 1% BSA, um die Bildgebungskammer vorzubereiten. Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Luer-Schloss-Armaturenbehälter.</li>
		<li>Durchfluss 50 μL 0,005 mg/ml Streptavidin. 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Reservoir.</li>
		<li>Flow 50 μL von 1% BSA, um unspezifische Bindung zu blockieren. 10-30 s inkubieren. Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Reservoir.</li>
		<li>Durchfluss 50 μL warmer (37 °C) 1x TIRF-Puffer (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM Glukose, 0,25% (v/v) Methylcellulose (4.000 cp)). HINWEIS: Entfernen Sie keinen überschüssigen Puffer aus dem Reservoir. Dies verhindert, dass die Kammer austrocknet, was Luftblasen in das System einbringen kann.</li>
		<li>Optional: Fließen Sie 50 μL stabilisierte29 und 50% biotinylierte Mikrotubuli-Samen, verdünnt in 1x TIRF-Puffer. HINWEIS: Die richtige Verdünnung muss empirisch ermittelt werden und die Variabilität von Charge zu Charge enthalten. Als Ausgangspunkt werden Protokolle ab27,29 empfohlen. Eine Verdünnung von 10-30 Samen pro Sichtfeld funktioniert gut mit diesem Setup.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vorbereitung des Mikroskops
HINWEIS: Biochemische Reaktionen, die dynamische Aktinfilamente und Mikrotubuli enthalten, werden mit einem invertierten TIRF-Mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence) visualisiert/durchgeführt, das mit 120-150 mW Festkörperlasern, einem temperaturkorrigierten 63-fachen Ölimmersions-TIRF-Objektiv und einer EMCCD-Kamera ausgestattet ist. Proteine in diesem Beispiel werden bei den folgenden Wellenlängen visualisiert: 488 nm (Mikrotubuli) und 647 nm (Aktin).
<ol><li>Stellen Sie das Gerät für die Bühnen-/Objektivheizung so ein, dass es mindestens 30 Minuten vor der Abbildung der ersten biochemischen Reaktion 35-37 °C aufrechterhält.</li>
	<li>Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter wie folgt ein:<ol>
<li>Stellen Sie das Erfassungsintervall für 15-20 Minuten auf alle 5 s ein.</li>
		<li>Stellen Sie 488 und 647 Laserbelichtungen auf 50-100 ms bei 5%-10% Leistung ein. Stellen Sie den geeigneten TIRF-Winkel für das Mikroskop ein. HINWEIS: Unabhängig von der Einrichtung des Mikroskops besteht die einfachste Möglichkeit, die Laserleistung, die Belichtung und den TIRF-Winkel einzustellen, darin, Anpassungen an Bildern beider Polymere allein vorzunehmen (siehe 5.2.2.1 und 5.2.2.2 unten). Benutzern wird dringend empfohlen, die niedrigsten Laserleistungs- und Belichtungseinstellungen zu verwenden, die noch eine Erkennung ermöglichen.<ol>
<li>Passen Sie die Polymerisationsreaktion (Abbildung 1C) an, um die Aktinfilamentanordnung zu initiieren, und erfassen Sie Bilder bei 647 nm. Nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor.</li>
			<li>Stellen Sie die Polymerisationsreaktion in einer zweiten konditionierten Perfusionsvertiefung ein, um die Mikrotubuli-Montage (Abbildung 1C) zu initiieren und bei 488 nm zu visualisieren. Nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Herstellung von Proteinreaktionsmischungen
<ol><li>Bereiten Sie die Stammlösung von fluoreszierend markiertem Tubulin vor.<ol>
<li>Bestimmen Sie die Konzentration von hausgemachtem, nicht markiertem Tubulin mittels Spektrophotometrie bei Abs280 wie folgt:<ol>
<li>Leeres Spektralphotometer mit 1xBRB80 ohne GTP.</li>
			<li>Berechnen Sie die Tubulinkonzentration unter Verwendung des ermittelten Extinktionskoeffizienten von 115.000 M-1 cm-1 und der folgenden Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq01.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Resuspendieren Sie kommerziell hergestelltes lyophilisiertes Lysin-markiertes 488-Tubulin auf 10 μM (1 mg / ml; 100% -Markierung) mit 20 μL von 1x BRB80 ohne GTP.</li>
		<li>Tauen Sie ein 7,2 μL Aliquot von 100 μM unmarkiertes recyceltes Tubulin29 auf Eis auf. HINWEIS: Recyceltes Tubulin ist entscheidend für eine erfolgreiche Mikrotubuli-Montage in vitro, da es polymerisationsinkompetente Dimere entfernt, die in gefrorenen Proteinbeständen gebildet wurden29,30.</li>
		<li>Kombinieren Sie 3 μL 10 μM 488-Tubulin mit dem 7,2 μL Aliquot von 100 μM unmarkiertem Tubulin, nicht mehr als 15 min vor der Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Stammlösung von fluoreszierend markiertem Aktin vor.<ol>
<li>Für hausgemachte Proteine bestimmen Sie die Konzentration und prozentuale Markierung von Aktin mittels Spektrophotometrie Abs290 und Abs650 wie folgt:<ol>
<li>Leeres Spektralphotometer mit G-Puffer.</li>
			<li>Berechnen Sie die Konzentration von unmarkiertem Aktin unter Verwendung des ermittelten Extinktionskoeffizienten von 25.974 M-1 cm-1 und der folgenden Formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
			<li>Berechnen Sie die Konzentration von Lysin-markiertem Alexa-647-Aktin unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von unmarkiertem Aktin, des Fluorkorrekturfaktors von 0,03 und der folgenden Formel: [Alexa-647 Aktin], μM = (Abs290 - <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq03.jpg" style="opacity: 0.9; margin: auto;">
</li>
			<li>Berechnen Sie das Prozentzeichen von Alexa-647-Actin unter Verwendung der ermittelten ε für Alexa-647 von 239.000 M-1 cm-1 wie folgt: %-Etikett von Alexa-647-Aktin = (Abs290 - (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq04.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tauen Sie ein 2 μL Aliquot von 3 μM 100% markiertes Biotin-Aktin (markiert auf Lysinresten) auf. 10-fach verdünnen, indem man 18 μL G-Puffer hinzufügt.</li>
		<li>Kombinieren Sie 3 μL verdünntes biotinyliertes Aktin, geeignete Volumina an unmarkiertem und markiertem Aktin (oben), so dass die endgültige Mischung 12,5 μM Gesamtaktin mit 10% -30% fluoreszierender Markierung ist. HINWEIS: Mehr als 30% Prozent fluoreszierende Aktinmonomere (endgültig) können die Bildauflösung beeinträchtigen, da Filamente aus dem Hintergrund schwer zu erkennen sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reaktionsmischungen vorbereiten (Abbildung 1C).<ol>
<li>Es wird eine Zytoskelettmischung (Tube A) hergestellt, indem 2 μL der 12,5 μM Aktinmischung (6.2.3) mit der Tubulin-Stammmischung (6.1.4) höchstens 15 Minuten vor der Bildgebung kombiniert werden. Bis zum Gebrauch auf Eis lagern.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Proteinreaktionsmischung (Tube B) vor, indem Sie alle anderen experimentellen Komponenten und Proteine kombinieren, einschließlich: 2x TIRF-Puffer, Anti-Bleichmittel, Nukleotide, Puffer und akzessorische Proteine. Ein Beispiel ist in Abbildung 1C dargestellt. HINWEIS: Die endgültige Verdünnung führt zu einem 1-fachen TIRF-Puffer, der ATP, GTP und Ionenstärke innerhalb des geschätzten physiologischen Bereichs enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie Rohr A und Rohr B separat bei 37 °C für 30-60 s. Um eine Reaktion einzuleiten, mischen und fügen Sie den Inhalt von Röhrchen B zu Röhre A (unten) hinzu.</li>
</ol>7. Bildaktin- und Mikrotubulidynamik
<ol><li>Konditionieren Sie die Perfusion gut (Abbildung 1B; Schritt 4 oben).</li>
	<li>Gleichzeitige Aktivin- und Mikrotubuli-Montage durch Zugabe des Inhalts von Röhrchen B (Reaktionsmischung) zu Tube A (Zytoskelettmischung) (Abbildung 1C).</li>
	<li>Durchfluss 50 μL Reaktion mit 1x TIRF-Puffer, ergänzt mit 15 μM freiem Tubulin, 1 mM GTP und 0,5 μM Aktinmonomeren und geeigneten Volumen von Pufferkontrollen.</li>
	<li>Nehmen Sie Zeitrafferfilme mit Mikroskopsoftware auf, um alle 5 s für 15-20 Minuten aufzunehmen. HINWEIS: Die Initiierung der Aktin- und Mikrotubulidynamik erfolgt innerhalb von 2-5 Minuten (Abbildung 2). Längere Verzögerungen weisen auf Probleme mit der Temperaturregelung oder konzentrationsbedingte Probleme von Proteinen im Reaktionsmix hin.</li>
	<li>Konditionieren Sie eine neue Perfusionsbohrung (Schritt 4) und ersetzen Sie das Puffervolumen durch regulatorische Proteine von Interesse (d. h. Tau) und Pufferkontrollen (Abbildung 1C). Erwerben Sie wie in Schritt 7 (oben) beschrieben, um regulatorische Proteine für emergente Aktin-Mikrotubuli-Funktionen zu bewerten.</li>
</ol>8. Verarbeiten und analysieren Sie Bilder mit der FIJI-Software31
<ol><li>Öffnen Sie gespeicherte TIRF-Filme und zeigen Sie sie als Composite an.</li>
	<li>Analysieren Sie die Dynamik von Mikrotubuli (Abbildung 3A) wie folgt:<ol>
<li>Generieren Sie eine zeitbasierte maximale Z-Projektion aus dem Menü "Bildstapel".</li>
		<li>Synchronisieren Sie das Z-Projektionsfenster mit dem ursprünglichen TIRF-Film über das Menü Analyse> Extras> Fenster synchronisieren .</li>
		<li>Zeichnen Sie eine Linie mit dem geraden Werkzeug entlang eines Mikrotubuli, das auf dem projizierten Bild von Interesse ist.<ol>
<li>Öffnen Sie den ROI-Manager (Region of Interest) über das Analysemenü (Analyse> Extras> ROI-Manager).</li>
			<li>Speichern Sie einzelne Mikrotubuli-Stellen, indem Sie "t" drücken. Wiederholen Sie dies für alle Mikrotubuli von Interesse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zeichnen Sie Kymographen ausgewählter Linien mit "/" oder führen Sie das Multi-Kymo-Makro aus, das ein Video und einen Kymographen für jede Mikrotubulie im ROI-Manager31 generiert.<ol>
<li>Fügen Sie den Kymographen über das Menü Analyse > Werkzeuge> Maßstabsleisten sowohl Längen- (μm) als auch Zeitbalken (min) hinzu.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Messen Sie die Wachstumsgeschwindigkeiten von Mikrotubuli aus Kymographensteigungen (Abbildung 3A, 1-2; Steigung der schwarzen Linien).</li>
		<li>Zählen Sie dynamische Mikrotubuliereignisse (Katastrophe oder Nachwachsen) aus dem generierten Kymographen oder mit den verfügbaren Analysemakros 5,8,18,25. Rote gepunktete Linien in Abbildung 3A, 1-2 stellen Katastrophen-/Schnelldemontageereignisse dar.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie Actin-Dynamics (Abbildung 3B) wie folgt:<ol>
<li>Messen Sie die Aktinkeimbildung wie folgt:<ol>
<li>Zählen Sie die Anzahl der im Sichtfeld vorhandenen Aktinfilamente 100 s nach der Einleitung der Reaktion und drücken Sie sie durch die Fläche aus (Filamente pro μm2).</li>
			<li>Zeichnen Sie Daten im ROI-Manager auf und speichern Sie sie, wie in Schritt 8.2.3.1 oben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Messen Sie die Dehnungsraten der Aktinfilamente (Abbildung 3B) wie folgt:<ol>
<li>Zeichnen Sie mit dem Werkzeug für segmentierte Linien eine Linie entlang eines relevanten Aktinfilaments.</li>
			<li>Fügen Sie wie in Schritt 8.2.3.1 oben eine Zeile zum ROI-Manager hinzu.</li>
			<li>Wiederholen Sie das Folgen der Zeile (Hinzufügen jeder Messung zum ROI-Manager) für mindestens vier Filmframes. HINWEIS: Es wird empfohlen, sieben bis acht aufeinanderfolgende Rahmen zu messen, jedoch verlangsamen einige Bedingungen die Aktinpolymerisation unter die nachweisbare Grenze, die durch objektive / mikroskopische Setups aufgelöst werden kann. In einem solchen Fall können Messungen in regelmäßigen Abständen über nicht aufeinanderfolgende Frames (z. B. alle fünf Frames) durchgeführt werden.</li>
			<li>Zeichnen Sie gemessene Längenwerte über die verstrichene Zeit auf. Die Steigung der erzeugten Linie ist die Aktindehnungsrate in μm/s.</li>
			<li>Übermitteln Sie die endgültigen berechneten Raten als Untereinheiten s-1 μM-1 unter Verwendung eines Korrekturfaktors von 370 Untereinheiten, um die Anzahl der Aktinmonomere in einem Mikron Filament32 zu berücksichtigen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Korrelative Analyse für Regionen mit paralleler Aktin-Mikrotubuli-Assoziation (Abbildung 3C) wie folgt durchführen:<ol>
<li>Zeichnen Sie eine Linie entlang eines Mikrotubuli von Interesse zu einem bestimmten Zeitpunkt (d. h. 300 s nach Beginn der Reaktion) mit dem Straight-Line-Tool.<ol>
<li>Fügen Sie wie in Schritt 8.2.3.1 oben eine Zeile zum ROI-Manager hinzu.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität entlang der Linie in jedem Kanal auf.<ol>
<li>Wählen Sie jeden Kanal mit dem Bildschieberegler aus und zeichnen Sie die Intensitäten entlang der Linie mit "Befehl k".</li>
			<li>Speichern oder exportieren Sie Werte, indem Sie im Ausgabefenster auf die Schaltfläche "Liste" klicken.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Drücken Sie Aktin-Mikrotubuli-Kopplungsereignisse als Verhältnis (Aktinüberlappung mit Mikrotubuli) aus einzelnen Ereignissen oder als Anzahl von Ereignissen in einem bestimmten Sichtfeld zu einem konsistenten Zeitpunkt aus (Abbildung 3C).</li>
		<li>Alternative: Verwenden Sie eine Software, um die prozentuale Überlappung beider Kanälezu bestimmen 5,12.</li>
	</ol></li>
</ol>

Es gibt keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Die Verwendung der Total-Interreflexionsfluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) zur Visualisierung gereinigter Proteine war ein fruchtbarer und überzeugender Ansatz, um einzigartige Mechanismen der Zytoskelettregulation 5,23,24,25,26,27,35 zu sezieren. Im Vergleich zu herkömmlichen biochemischen Assays erfordern TIRF-Reaktionen sehr kleine Volumina (50-100 μL), und quantitative Messungen der Zytoskelettdynamik können aus einem individuellen Assay gewonnen werden. Die meisten Studien zur Zytoskelettdynamik konzentrieren sich auf ein einzelnes Polymersystem (d. H. Aktinfilamente oder Mikrotubuli), so dass detaillierte Messungen des Übersprechens oder des emergenten Verhaltens zwischen Aktinfilamenten und Mikrotubuli, die typischerweise in Zellen beobachtet werden, im Reagenzglas schwer fassbar und schwer zu rekapitulieren sind. Um dieses Problem zu lösen, beschreibt dieses Protokoll ein Single-Filament-TIRF-Mikroskopiesystem, das die direkte Visualisierung von dynamischen Aktin- und Mikrotubulipolymeren in derselben biochemischen Reaktion ermöglicht. Somit geht diese Methode über traditionelle Assays hinaus, die das dynamische Verhalten von Aktinfilamenten oder Mikrotubuli allein rekapitulieren. Diese Technik wurde auch mit Tau als Beispiel dafür durchgeführt, wie sich mehrere dynamische Eigenschaften in Gegenwart eines Zytoskelett-Kopplungsfaktors ändern. Dieses Protokoll kann mit zusätzlichen Proteinen verwendet werden, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie die Aktin- oder Mikrotubulidynamik koordinieren, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) MACF, GAS, Formine und mehr. Schließlich können bereitgestellte Beispielanalysen als Leitfaden verwendet werden, um die mit diesem Protokoll erfassten Daten zu quantifizieren.
"Sehen heißt glauben" ist ein überzeugender Grund, mikroskopiebasierte Assays durchzuführen. Bei der Durchführung und Interpretation von TIRF-Mikroskopie-Experimenten ist jedoch Vorsicht geboten. Eine große Herausforderung bei zytoskelettalen Co-Assembly-Assays besteht darin, dass viele häufig verwendete Bildgebungsbedingungen nicht mit jedem Polymer kompatibel sind. Mikrotubuli und Aktin haben typischerweise unterschiedliche Puffer-, Temperatur-, Salz-, Nukleotid- und Konzentrationsanforderungen für die Polymerisation. Aktin, Tubulin, regulatorische Proteine von Interesse und die in diesem Protokoll verwendeten Puffer reagieren empfindlich auf Frost-Tau-Zyklen. Daher ist ein sorgfältiger Umgang mit Proteinen und Puffern notwendig, um dieses Protokoll erfolgreich auszuführen. Um viele dieser Bedenken zu zerstreuen, wird dringend empfohlen, frisch recyceltes Tubulin (<6 Wochen gefroren) zu verwenden und gefrorene / suspendierte Aktine über Ultrazentrifugation vorzuklären. Diese Überlegungen gelten auch für die unzähligen regulatorischen Proteine, die mit diesem Verfahren bewertet werden sollen, die empfindlich auf Gefrier-Tau-Zyklen oder die Konzentration von Puffersalzen 5,11,36 reagieren können.
Leider gibt es keinen einheitlichen Puffer ohne experimentelle Kompromisse. Um mehr Volumen für Proteine niedrigerer Konzentration zu erhalten, können ATP und GTP in die 2x-TIRF-Pufferlösung eingeschlossen werden (Abbildung 1C). Da diese Nukleotide jedoch extrem empfindlich auf Frost-Tau-Zyklen reagieren, wird dies nicht empfohlen. Die hier verwendeten Sauerstofffängerverbindungen (d. H. Katalase und Glucoseoxidase) sind notwendig, um Proteine über lange Zeiträume (Minuten bis Stunden) sichtbar zu machen, aber es ist bekannt, dass sie die Mikrotubulipolymerisation bei hohen Konzentrationen einschränken5. Im Zusammenhang mit diesen Pufferüberlegungen besteht eine Einschränkung dieses Protokolls darin, dass einige kanonische Mikrotubuli-assoziierte regulatorische Proteine mehr oder weniger Salz benötigen, um Funktionen in Zellen oder Assays mit Mikrotubuli allein (ohne Aktin) zu rekapitulieren. Eine Änderung der Art oder Konzentration von Salz, um diese Bedenken auszuräumen, wird wahrscheinlich die Raten der Aktinfilamentpolymerisation und / oder die Parameter der Mikrotubulidynamik beeinflussen. Messungen mehrerer deskriptiver Parameter (minimal, Keimbildung, Dehnungsraten und Stabilität) (Abbildung 3) sind erforderlich, um den Protokollerfolg zu bestätigen oder die Auswirkungen spezifischer Puffer oder regulatorischer Proteine explizit zu dokumentieren. Zum Beispiel kann eine zu starke Polymerisation von Aktinfilamenten Aktin-Mikrotubuli-Kopplungsereignisse innerhalb von Sekunden verschleiern. Folglich wird die Feinabstimmung der experimentellen Bedingungen durch Senkung der Gesamtkonzentration von Aktin oder Einbeziehung zusätzlicher Proteine zur Unterdrückung der Aktinkeimbildung (d. H. Profilin) den Gesamtzeitraum verlängern, in dem koordinierte Aktin-Mikrotubuli-Aktivitäten deutlich sichtbar gemacht werden können. Kontrollen, die diese Voraussetzungen erfüllen, und technische Replikate (über mehrere Sichtfelder hinaus) sind für Benutzer von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Zellbasierte Studien bieten nur begrenzte Möglichkeiten, direkte Protein-Protein-Beziehungen oder die Wirkung von regulatorischen Komplexen zu beobachten. Im Gegensatz dazu spiegeln einige der aus In-vitro-Assays gewonnenen Mechanismen nicht immer das genaue Verhalten von Proteinen wider, die in Zellen beobachtet werden. Dieses klassische biochemistische Dilemma kann in zukünftigen Anwendungen dieser Technik mit spezifischen Modifikationen angegangen werden. Zum Beispiel erweitert die Zugabe von funktionellen fluoreszenzmarkierten Kopplungsproteinen diese Methode von Einzelfilamentstudien zu Einzelmolekülstudien. Assays können weiter modifiziert werden, um Zellextrakte zu verwenden, die die "fehlenden" unbekannten Schlüsselfaktoren hinzufügen können, die erforderlich sind, um zellähnliche Phänomene zu rekapitulieren. Zum Beispiel haben TIRF-basierte Assays, die Hefe- oder Xenopus-Extrakte verwenden, kontraktile Actomyosin-Ringe37, mitotische Spindeln 26,38, Komponenten der Aktin- oder Mikrotubuli-Assemblierung 39,40 und sogar Dynamik am Zentrosom und Kinetochore 36,41,42,43 rekonstituiert. . Darüber hinaus können solche Systeme den Weg zu künstlichen Zellsystemen ebnen, deren Lipide oder Signalfaktoren 44,45,46 vorhanden sind.

In der Vergangenheit wurden Aktin und Mikrotubuli als getrennte Einheiten betrachtet, jede mit ihren eigenen regulatorischen Proteinen, dynamischem Verhalten und unterschiedlichen zellulären Standorten. Zahlreiche Beweise zeigen nun, dass Aktin- und Mikrotubulipolymere funktionelle Übersprechmechanismen anwenden, die für die Ausführung zahlreicher Zellprozesse unerlässlich sind, einschließlich Migration, mitotische Spindelpositionierung, intrazellulärer Transport und Zellmorphologie 1,2,3,4. Die verschiedenen koordinierten Verhaltensweisen, die diesen Beispielen zugrunde liegen, hängen von einem komplizierten Gleichgewicht von Kopplungsfaktoren, Signalen und physikalischen Eigenschaften ab. Die molekularen Details, die diesen Mechanismen zugrunde liegen, sind jedoch noch weitgehend unbekannt, da sich die meisten Studien auf ein einzelnes zytoskelettales Polymer zu einem Zeitpunktkonzentrieren 1,2,5.
Aktin und Mikrotubuli interagieren nicht direkt 6,7,8. Die koordinierte Dynamik von Aktin und Mikrotubuli, die in Zellen beobachtet werden, wird durch zusätzliche Faktoren vermittelt. Viele Proteine, von denen angenommen wird, dass sie das Aktin-Mikrotubuli-Übersprechen regulieren, wurden identifiziert und ihre Aktivitäten sind in Bezug auf beide zytoskelettalen Polymere alleingut charakterisiert 1,2. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass dieser Einzelpolymeransatz die Doppelfunktionen einiger der Proteine / Komplexe verdeckt hat, die Aktin-Mikrotubuli-Kopplungsereignisse ermöglichen 7,8,9,10,11,12,13. Experimente, bei denen beide Polymere vorhanden sind, sind selten und definieren oft Mechanismen mit einem einzigen dynamischen Polymer und einer statisch stabilisierten Version der anderen 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Daher werden Methoden benötigt, um die emergenten Eigenschaften von Aktin-Mikrotubuli-koordinierenden Proteinen zu untersuchen, die nur in experimentellen Systemen, die beide dynamischen Polymere verwenden, vollständig verstanden werden können.
Die Kombination von direkten Proteinmarkierungsansätzen, genetisch kodierten Affinitätsmarkierungen und TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) wurde mit großem Erfolg in biomimetischen Rekonstitutionssystemen 19,20,21,22,23 angewendet. Viele Bottom-up-Schemata enthalten nicht alle Faktoren, die Proteine in Zellen regulieren. Die "Biochemie auf einem Deckglas" -Technologie hat jedoch viele Mechanismen der Aktin- und Mikrotubulidynamik auf hohen räumlichen und zeitlichen Skalen verfeinert, einschließlich der Komponenten, die für den Polymerauf- oder -abbau und die motorische Proteinbewegung erforderlich sind 5,12,23,24,25,26,27 . Hier wird ein Minimalkomponenten-Single-Filament-Ansatz zur Untersuchung der Aktin-Mikrotubuli-Kopplung in vitro beschrieben. Dieses Protokoll kann mit kommerziell erhältlichen oder hochreinen gereinigten Proteinen, fluoreszierend markierten Proteinen, Perfusionskammern verwendet und auf kompliziertere Schemata mit Zellextrakten oder synthetischen Systemen erweitert werden. Hier wird das kommerziell erhältliche Tau-Protein verwendet, um zu demonstrieren, wie sich die Zytoskelettdynamik in Gegenwart eines Aktin-Mikrotubuli-Kopplungsproteins ändert, aber durch andere mutmaßliche Aktin-Mikrotubuli-Koordinationsfaktoren ersetzt werden kann. Der Hauptvorteil dieses Systems gegenüber anderen Ansätzen ist die Möglichkeit, die Dynamik mehrerer zytoskelettaler Polymere in einer Reaktion gleichzeitig zu überwachen. Dieses Protokoll bietet Benutzern auch Beispiele und einfache Werkzeuge zur Quantifizierung von Änderungen an zytoskelettalen Polymeren. Auf diese Weise werden Protokollbenutzer zuverlässige, quantitative Einzelfilament-Auflösungsdaten erstellen, um Mechanismen zu beschreiben, die der Art und Weise zugrunde liegen, wie verschiedene regulatorische Proteine die Aktin-Mikrotubuli-Dynamik koordinieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Traditionell wurden die Aktin- und Mikrotubuli-Zytoskelette als separate Einheiten untersucht, die auf bestimmte zelluläre Regionen oder Prozesse beschränkt sind und durch verschiedene Suiten von Bindungsproteinen reguliert werden, die für jedes Polymer einzigartig sind. Viele Studien zeigen nun, dass die Dynamik beider zytoskelettaler Polymere miteinander verflochten ist und dass dieses Übersprechen für die meisten zellulären Verhaltensweisen erforderlich ist. Eine Reihe von Proteinen, die an Aktin-Mikrotubuli-Interaktionen beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (z. B. Tau, MACF, GAS, Formine und mehr) und sind entweder in Bezug auf Aktin oder Mikrotubuli allein gut charakterisiert. Relativ wenige Studien zeigten jedoch Assays der Aktin-Mikrotubuli-Koordination mit dynamischen Versionen beider Polymere. Dies kann emergente Verbindungsmechanismen zwischen Aktin und Mikrotubuli ausschließen. Dabei ermöglicht eine auf der Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) basierende In-vitro-Rekonstitutionstechnik die Visualisierung sowohl der Aktin- als auch der Mikrotubuli-Dynamik aus der einen biochemischen Reaktion. Diese Technik bewahrt die Polymerisationsdynamik von Aktinfilament oder Mikrotubuli einzeln oder in Gegenwart des anderen Polymers. Das kommerziell erhältliche Tau-Protein wird verwendet, um zu demonstrieren, wie sich das Verhalten von Aktin-Mikrotubuli in Gegenwart eines klassischen zytoskelettalen Vernetzungsproteins ändert. Diese Methode kann zuverlässige funktionelle und mechanistische Einblicke liefern, wie einzelne regulatorische Proteine die Aktin-Mikrotubuli-Dynamik bei einer Auflösung einzelner Filamente oder Komplexe höherer Ordnung koordinieren.

Unter den oben beschriebenen Bedingungen (Abbildung 1) sollten Aktin- und Mikrotubulipolymere innerhalb von 2 Minuten nach der Bildaufnahme sichtbar (und dynamisch) sein (Abbildung 2). Wie bei jedem auf Biochemie basierenden Protokoll kann eine Optimierung für verschiedene regulatorische Proteine oder Proteinchargen erforderlich sein. Aus diesen Gründen werden der TIRF-Winkel und die Bildbelichtungen zuerst mit Reaktionen eingestellt, die jedes einzelne Polymer enthalten. Dies bestätigt, dass gespeicherte Proteine funktionsfähig sind und genügend markiertes Protein für den Nachweis vorhanden ist. Obwohl dies nicht immer notwendig ist (und hier nicht durchgeführt wird), kann die Nachbearbeitung von Filmen (d. H. Hintergrundsubtraktion, Mittelwertbildung oder Fourier-Transformationen) verwendet werden, um den Bildkontrast (insbesondere von Mikrotubuli) zu verbessern) 5,25,33. Die direkte Visualisierung einzelner Aktinfilamente und Mikrotubuli, die dieser Assay bietet, unterstützt die quantitative Bestimmung mehrerer dynamischer Messungen für entweder Zytoskelettkomponenten allein oder zusammen, einschließlich Polymerisationsparametern (d. h. Keimbildungs- oder Dehnungsrate), Demontageparametern (d. h. Schrumpfraten oder Katastrophenereignissen) und Polymerkoalignation/-überlappung (Abbildung 3 ). Darüber hinaus können diese Maßnahmen als Ausgangspunkt verwendet werden, um die Bindung oder den Einfluss von regulatorischen Liganden wie Tau zu entschlüsseln (Abbildung 3). Viele Messungen von einzelnen Actin-Filamenten oder Mikrotubuli können aus einem TIRF-Film durchgeführt werden. Aufgrund von Unterschieden in der Deckglasbeschichtung, beim Pipettieren und anderen Faktoren sollten zuverlässige Messungen jedoch auch mehrere technische Replikatreaktionen / -filme umfassen.
Viele Facetten der Mikrotubulidynamik können anhand von Beispielkymographen bestimmt werden, einschließlich der Rate der Mikrotubuli-Dehnung sowie der Häufigkeit von Katastrophen- und Rettungsereignissen (Abbildung 3A). Die Verwendung von Kymographen zur Messung der Aktindynamik in diesem System ist nicht so einfach, da Aktinfilamente komplizierter sind als Mikrotubuli. Infolgedessen werden Parameter der Aktinfilamentdynamik von Hand gemessen, was zeit- und arbeitsintensiv ist. Die Keimbildungszahl wird als die Anzahl der Aktinfilamente gemessen, die zu einem konsistenten Zeitpunkt für alle Bedingungen vorhanden sind. Diese Zählungen variieren stark zwischen den TIRF-Bildgebungsfeldern, können aber mit vielen Replikaten oder zur Ergänzung von Beobachtungen aus anderen Polymerisationsassays verwendet werden. Keimbildungszählungen können auch für Mikrotubuli verwendet werden, wenn den Versuchsbedingungen stabilisierte Mikrotubuli-Samen fehlen. Die Dehnungsraten von Aktinfilamenten werden als Länge des Filaments im Laufe der Zeit von mindestens vier Filmbildern gemessen. Die Geschwindigkeitswerte werden pro mikromolarem Aktin mit einem Korrekturfaktor von 370 Untereinheiten übertragen, um die Anzahl der Aktinmonomere in einem Mikron Filament zu berücksichtigen (Abbildung 3B)32. Messungen zur Definition des koordinierten Verhaltens zwischen Aktin und Mikrotubuli sind weniger gut definiert. Korrelative Analysen wurden jedoch angewendet, um die Koinzidenz beider Polymere zu messen, einschließlich Linienscans (Abbildung 3C) oder Überlappungssoftware 5,11,34.
Datenverfügbarkeit: Alle mit dieser Arbeit verbundenen Datensätze wurden in Zenodo hinterlegt und sind auf Anfrage erhältlich unter: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> Abbildung 1. Experimentelle Schaltpläne: Durchflusskammermontage zur Bildaufnahme. (A) Montage der Bildgebenden Kammer. Von oben nach unten: IBIDI-Bildgebungskammern werden entlang von Perfusionsbohrungen (gekennzeichnet durch Pfeil) geklebt; Die zweite (weiße) Schicht des Bandrückens (auf dem Bild belassen, um die Benutzer besser zu orientieren) wird entfernt und Epoxidharz wird am Rand der Perfusionskammer aufgetragen (Pfeil). Hinweis: Um den Benutzern leichter zu zeigen, wo das Epoxidharz platziert werden soll, wurde die weiße Rückseite in diesem Bild beibehalten. Das gereinigte und beschichtete Deckglas wird an der Bildgebungskammer befestigt, wobei die Beschichtungsseite der Innenseite des Perfusionsschachts zugewandt ist. (B) Flussdiagramm zur Veranschaulichung der Schritte zur Konditionierung von Bildgebungskammern für Biotin-Streptavidin-Verbindungen. (C) Beispiele für Reaktionen, die zur Aufnahme von TIRF-Filmen dynamischer Mikrotubuli und Aktinfilamente verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> Abbildung 2. Bildsequenzen von wachsenden Aktinfilamenten und Mikrotubuli in Abwesenheit oder Anwesenheit von Tau. Zeitraffer-Bildmontage aus TIRF-Assays, die 0,5 μM Aktin (10% Alexa-647-Aktin und 0,09% Biotin-Actin markiert) und 15 μM freies Tubulin (4% HiLyte-488 markiert) in Abwesenheit (A) oder Anwesenheit (B) von 250 nM Tau enthalten. Die Zeit bis zur Reaktionsauslösung (Mischen von Rohr A und Röhre B) wird dargestellt. Maßstabsstäbe, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> Abbildung 3. Beispielmessungen von Mikrotubuli und Aktinfilamentdynamik. (A) Die durchschnittliche Zeitprojektion des Tubulinkanals visualisiert effizient die Gesamtmikrotubuli-Längen für die Linienscans, die zur Erstellung von Kymographendiagrammen verwendet werden. Schwarze gepunktete Linien entsprechen den beiden rechts gezeigten Beispielkymographen dynamischer Mikrotubuli. Die Wachstums- (durchgehend schwarze Linien) und Demontagephasen (gepunktete rosa Linien; zwei mit rosa Pfeilen gekennzeichnete) von Mikrotubuli sind auf jedem Kymographen dargestellt. Zeitskalenbalken, 3 Min. Länge Mensur, 10 μm. Die Reaktion enthält 0,5 μM Aktin (10% 647-Markierung) und 15 μM freies Tubulin (4% 488-HiLyte-Markierung). Es wird nur der Tubulinkanal angezeigt. (B) Zwei Beispiel-Zeitraffer-Bildmontagen, die einaktige Filamente zeigen, die aktiv polymerisieren. Die Dehnungsraten werden als Steigung der Parzellen der Länge der Aktinfilamente im Laufe der Zeit pro mikromolarem Aktin berechnet. Daher muss ein Korrekturfaktor von zwei auf 0,5 μM-Aktinreaktionen angewendet werden, um Raten zu vergleichen, die typischerweise bei der 1 μM-Aktinkonzentration bestimmt werden. Beispiele aus fünf Filamenten sind rechts dargestellt. Maßstabsstäbe, 10 μm. Die Reaktion enthält 0,5 μM Aktin (10% 647-Markierung) und 15 μM freies Tubulin (4% 488-HiLyte-Markierung). Es wird nur der Actinkanal angezeigt. (C) TIRF-Bilder von dynamischen Mikrotubuli (MT) (grün) und Aktinfilamenten (violett), die in Abwesenheit (links) oder Anwesenheit von 250 nM Tau (Mitte) polymerisieren. Blau gepunktete Linien und Pfeile markieren, wo eine Linie für die Linienscan-Plots gezeichnet wurde, die jeder Bedingung entsprechen (unter jedem Bild). Überlappungen zwischen Mikrotubuli und Aktinregionen (schwarz dargestellt) können zu einem festgelegten Zeitpunkt pro Bereich (rechts) bewertet werden. Maßstabsstäbe, 25 μm. Die Reaktionen enthalten 0,5 μM Aktin (10% 647-Markierung) und 15 μM freies Tubulin (4% 488-HiLyte Markierung) mit oder ohne 250 nM Tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Trotz vieler Koordinationsbeispiele untersuchen die meisten Studien die Aktin- oder Mikrotubuliproteine einzeln. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung beider dynamischer Polymere in einer einzigen Reaktion. Diese Technik ermöglicht es dem Benutzer, verschiedene regulatorische Proteine auf emergente Eigenschaften zu untersuchen, die nur mit dynamischen Versionen von Aktin und Mikrotubuli beobachtet werden können.Diese Technik kann um Lipide oder Extrakte erweitert werden, um dem Aufbau einer synthetischen Zelle näher zu kommen. Beginnen Sie mit dem Auftauen von Aliquoten von PEG-Silan- und Biotin-PEG-Silanpulvern und dem Auflösen der PEG-Pulver in 80% Ethanol, um die Beschichtungsmateriallösungen von 10 Milligramm pro Milliliter mPEG-Silan und zwei bis vier Milligramm pro Milliliter Biotin-PEG-Silan zu erzeugen. Entfernen Sie den sauberen Deckbeleg mit einer Pinzette aus der Ethanollagerung.Mit Stickstoffgas trocknen und in einer sauberen Petrischale aufbewahren. Beschichten Sie die Deckgläser mit 100 Mikrolitern Beschichtungslösung und inkubieren Sie sie bei 70 Grad Celsius für mindestens 18 Stunden oder bis zum Gebrauch. Schneiden Sie 12 Streifen doppelseitiges Klebeband auf eine Länge von 24 Millimetern.Entfernen Sie eine Seite der Bandrückseite und befestigen Sie Bandstücke neben den sechs Rillen, die in einer sauberen Abbildungskammer vorhanden sind. Entfernen Sie das zweite Stück Bandrückseite, um die klebrige Seite des Bandes entlang jeder Kammernut freizulegen, und legen Sie das Kammerband mit der Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche. Mischen Sie Epoxidharz- und Härterlösungen eins zu eins in einem kleinen Wägeboot und verwenden Sie eine P1000-Spitze, um einen Tropfen gemischtes Epoxidharz zwischen die Bandstreifen am Ende jeder Bildgebungskammerrille zu legen.Legen Sie dann die Kammer, das Klebeband oder das Epoxid mit der Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche. Entfernen Sie einen beschichteten Deckschlitten aus dem 70 Grad Celsius Inkubator und spülen Sie die beschichteten und unbeschichteten Oberflächen der Deckgläser sechsmal mit doppelt destilliertem Wasser ab. Mit gefiltertem Stickstoffgas trocknen und dann mit der Deckglasbeschichtung seitlich zum Band hin an der Bildkammer befestigen.Verwenden Sie eine P200- oder P1000-Pipettenspitze, um Druck auf die verklebte Glasschnittstelle auszuüben, um eine gute Abdichtung zwischen dem Klebeband und dem Deckglas zu gewährleisten. Bebrüten Sie die montierten Kammern bei Raumtemperatur für mindestens fünf bis 10 Minuten, damit das Epoxidharz die Kammerschächte vor dem Gebrauch vollständig abdichten kann. Perfusionskammern verfallen innerhalb von 12 bis 18 Stunden nach der Montage.Verwenden Sie eine Perfusionspumpe und tauschen Sie nacheinander Konditionierungslösungen in der Perfusionskammer aus, indem Sie 50 Mikroliter 1% BSA fließen lassen, um die Bildgebungskammer zu primieren. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Reservoir für die Köderverriegelung. Dann fließen 50 Mikroliter 0,005 Milligramm pro Milliliter Streptavidin und inkubieren für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Reservoir. Fließen Sie 50 Mikroliter 1% BSA, um die unspezifische Bindung zu blockieren und 10 bis 30 Sekunden lang zu inkubieren. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Reservoir.Als nächstes fließen 50 Mikroliter warmer 1x TIRF-Puffer und dann 50 Mikroliter stabilisierte und 50% biotinylierte Mikrotubuli-Samen, die in 1x TIRF-Puffer verdünnt sind. Stellen Sie die Bühne oder das objektive Heizgerät so ein, dass 35 bis 37 Grad Celsius Temperatur für 30 Minuten aufrechterhalten werden, bevor die erste biochemische Reaktion abgebildet wird. Stellen Sie dann das Erfassungsintervall für 15 bis 20 Minuten auf alle fünf Sekunden ein.Als nächstes setzen Sie 488 und 647 Laserbelichtungen auf 50 bis 100 Millisekunden bei 5% bis 10% Leistung, indem Sie zuerst die Polymerisationsreaktion anpassen, um die Aktinfilamentanordnung zu initiieren. Erfassen Sie die Bilder auf 647 Nanometern und nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor. Stellen Sie dann die Polymerisationsreaktion in einer zweiten konditionierten Perfusionsmulation ein, um die Mikrotubuli-Anordnung zu initiieren.Visualisieren Sie bei 488 Nanometern und nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor. Kombinieren Sie drei Mikroliter 10 Mikromolar 488 Tubulin mit dem 7,2 Mikroliter Aliquot von 100 Mikromolar fluoreszierend unmarkiertem Tubulin nicht mehr als 15 Minuten vor der Verwendung. Kombinieren Sie dann drei Mikroliter verdünntes Biotin-bezogenes Aktin in geeigneten Volumina von fluoreszierend unmarkiertem und markiertem Aktin, so dass die endgültige Mischung 12,5 Mikromolar Gesamtaktin mit 10% bis 30% fluoreszierender Markierung ist.Bereiten Sie die Zytoskelettmischung vor, indem Sie zwei Mikroliter der 12,5-Mikromolaren Aktinmischung mit der Tubulin-Stammmischung nicht mehr als 15 Minuten vor der Bildgebung kombinieren. Bis zum Gebrauch auf Eis lagern. Bereiten Sie die Proteinreaktionsmischung vor, indem Sie alle anderen experimentellen Komponenten und Proteine kombinieren, einschließlich 2x TIRF-Puffer, Anti-Bleichmittel, Nukleotide, Puffer und akzessorische Proteine.Inkubieren Sie die Zytoskelettmischung und die Proteinreaktionsmischung separat bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Sekunden. Um die Reaktion einzuleiten, fügen Sie den Inhalt der Proteinreaktionsmischung in die Zytoskelettmischung ein und mischen Sie sie. Fließen Sie 50 Mikroliter der Reaktionsmischung mit 1x TIRF-Puffer ergänzt mit 15 mikromolaren freien Tubulin, einem millimolaren GTP, 0,5 mikromolaren Aktinmonomeren und entsprechenden Mengen an Pufferkontrollen in die Perfusionskammer.Nehmen Sie einen Zeitrafferfilm mit einer Mikroskopsoftware auf, um alle fünf Sekunden für 15 bis 20 Minuten zu erfassen. Konditionieren Sie eine neue Perfusionsbohrung und ersetzen Sie das Puffervolumen durch das regulatorische Protein von Interesse und Pufferkontrollen. Erwerben Sie, um die regulatorischen Proteine für emergente Actin-Mikrotubuli-Funktionen zu bewerten.Beispielmessungen von Mikrotubuli und Aktinfilamentdynamik sind in diesen Bildern gezeigt. Die durchschnittliche Zeitprojektion des Tubulinkanals visualisiert effizient die Gesamtlängen der Mikrotubuli für die Linienscans, die zur Generierung der Kymograph-Diagramme verwendet werden. Schwarze gepunktete Linien entsprechen den beiden Beispielkymographen der dynamischen Mikrotubuli.Die Wachstums- und Demontagephasen von Mikrotubuli sind auf jedem Kymographen dargestellt. Zwei Beispiele für Zeitraffer-Bildmontagen, die einzelne Aktinfilamente zeigen, die aktiv polymerisieren, werden hier gezeigt. Die Dehnungsraten werden als die Steigung der Plots der Länge der Aktinfilamente im Laufe der Zeit pro mikromolarem Aktin berechnet.Daher muss ein Korrekturfaktor von zwei auf 0,5 mikromolare Aktinreaktionen angewendet werden, um die Raten zu vergleichen, die typischerweise bei der einen mikromolaren Aktinkonzentration bestimmt werden. Beispiele aus fünf Filamenten werden hier gezeigt. Totale interne Reflexionsfluoreszenz oder TIRF-Bilder der dynamischen Mikrotubuli in Aktinfilamenten, die in Abwesenheit oder Anwesenheit von 250 nanomolaren Tau polymerisieren, sind hier gezeigt.Blau gepunktete Linien und Pfeile markieren Verschleiß Eine Linie wurde für die Linienscan-Diagramme entsprechend jeder Bedingung gezeichnet. Überlappungen zwischen den Mikrotubuli in den Aktinregionen können zu einem festgelegten Zeitpunkt pro Gebiet bewertet werden. Zytoskelettproteine, insbesondere Aktin, Mikrotubuli und ihre Regulatoren reagieren sehr empfindlich auf Gefrier- / Tauzyklen.Für Konsistenz und Erfolg verwenden Sie hochreine und richtig gelagerte Proteine.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Forschung

Biochemie

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In-vitro- Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomen

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Bildgebung der podozytischen Proteine Nephrin, Actin und Podocin mit Erweiterungsmikroskopie

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...