Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

אני אסיר תודה למארק רידילה (תיקון ביוטכנולוגיה) ובריאן הארר (SUNY Upstate) על הערות מועילות על פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (GM133485).

אין ניגודי עניינים לחשוף.

השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית (TIRF) כדי לדמיין חלבונים מטוהרים היה גישה פורה ומשכנעת לנתח מנגנונים ייחודיים של ויסות ציטוסקטלי 5,23,24,25,26,27,35. בהשוואה למבחנים ביוכימיים מסורתיים, תגובות TIRF דורשות נפחים קטנים מאוד (50-100 μL), ומדידות כמותיות של דינמיקה ציטוסקטלית יכולות להילקח מבדיקה בודדת. רוב המחקרים על דינמיקה של שלד ציטוסקטלי מתמקדים במערכת פולימרית בודדת (כלומר, חוטי אקטין או מיקרוטובולים), ולכן מדידות מפורטות של ההצלבה או ההתנהגויות המתפתחות בין חוטי אקטין למיקרוטובולים הנראים בדרך כלל בתאים נותרו חמקמקות וקשות לשחזור במבחנה. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרוסקופיה TIRF בעלת נימה אחת המאפשרת הדמיה ישירה של אקטין דינמי ופולימרים מיקרוטובולים באותה תגובה ביוכימית. לפיכך, שיטה זו חורגת מעבר למבחנים מסורתיים המסכמים את ההתנהגות הדינמית של חוטי אקטין או מיקרוטובולים בלבד. טכניקה זו בוצעה גם עם טאו כדוגמה לאופן שבו מספר תכונות דינמיות משתנות בנוכחות גורם צימוד ציטוסקטון. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם חלבונים נוספים הידועים או החשודים כמתאמים אקטין או דינמיקה של מיקרוטובולים, כולל (אך לא רק) MACF, GAS, פורמינים ועוד. לבסוף, ניתן להשתמש בניתוחים לדוגמה כמדריך לכימות נתונים שנרכשו באמצעות פרוטוקול זה.
"לראות זה להאמין" היא סיבה משכנעת לבצע בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה. עם זאת, נדרשת זהירות בביצוע ובפענוח של ניסויי מיקרוסקופיה של TIRF. אחד האתגרים הגדולים של מבחני הרכבה משותפת של ציטוסקטליים הוא שתנאי הדמיה נפוצים רבים אינם תואמים כל פולימר. למיקרוטובולים ולאקטין יש בדרך כלל דרישות שונות של מאגר, טמפרטורה, מלח, נוקלאוטיד וריכוז לפולימריזציה. אקטין, טובולין, חלבונים רגולטוריים בעלי עניין, והמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה רגישים למחזורי הקפאה-הפשרה. לכן, טיפול זהיר בחלבונים ובמאגרים נחוץ כדי לבצע בהצלחה פרוטוקול זה. כדי להפיג רבים מהחששות הללו, מומלץ מאוד להשתמש בטובולין ממוחזר טרי (קפוא למשך <6 שבועות), ולפנות מראש אקטינים קפואים/מוחזרים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. שיקולים אלה חלים גם על שלל החלבונים הרגולטוריים שיש להעריך בהליך זה, אשר עשויים להיות רגישים למחזורי הפשרה בהקפאה או לריכוז מלחי החיץ 5,11,36.
למרבה הצער, לא קיים מאגר אחד שמתאים לכולם ללא פשרות ניסיוניות. כדי להתאים נפח גדול יותר לחלבונים בעלי ריכוז נמוך יותר, ATP ו-GTP עשויים להיכלל בתמיסת המאגר 2x TIRF (איור 1C). עם זאת, מכיוון שהנוקלאוטידים האלה רגישים מאוד למחזורי הפשרה בהקפאה, זה לא מומלץ. תרכובות טיהור החמצן המשמשות כאן (כלומר, קטלאז וגלוקוז-אוקסידאז) נחוצות כדי להמחיש חלבונים לפרקי זמן ארוכים (דקות עד שעות), אך ידוע שהן מגבילות פילמור מיקרוטובולים בריכוזים גבוהים5. בהקשר לשיקולי מאגר אלה, מגבלה של פרוטוקול זה היא שחלק מהחלבונים הרגולטוריים הקשורים למיקרוטובולים קנוניים עשויים לדרוש פחות או יותר מלח כדי לשחזר פונקציות שנמצאות בתאים או במבחנים באמצעות מיקרוטובולים בלבד (ללא אקטין). שינוי האופי או הריכוז של המלח כדי לתת מענה לחששות אלה ישפיע ככל הנראה על שיעורי פילמור נימה של אקטין ו/או פרמטרים של דינמיקה של מיקרוטובולים. מדידות של פרמטרים תיאוריים מרובים (מינימלי, נוקלאציה, קצב התארכות ויציבות) (איור 3) נדרשות כדי לאשר את הצלחת הפרוטוקול או לתעד במפורש את ההשפעות של מאגרים ספציפיים או חלבונים רגולטוריים. לדוגמה, יותר מדי פולימריזציה של חוטי אקטין יכולה לטשטש אירועי צימוד אקטין-מיקרוטובול תוך שניות. כתוצאה מכך, כוונון עדין של תנאי הניסוי על ידי הפחתת הריכוז הכולל של אקטין או הכללת חלבונים נוספים לדיכוי גרעין אקטין (כלומר, פרופילין) יאריך את התקופה הכוללת שבה ניתן לראות בבירור פעילויות אקטין-מיקרוטובול מתואמות. פקדים המתייחסים לתנאים מוקדמים אלה, ושכפולים טכניים (מעבר לשדות תצוגה מרובים), הם קריטיים עבור משתמשים כדי ליצור תוצאות מהימנות וניתנות לשחזור.
מחקרים מבוססי תאים מספקים הזדמנות מוגבלת לבחון יחסי חלבון-חלבון ישירים או את פעולתם של קומפלקסים רגולטוריים. לעומת זאת, חלק מהמנגנונים שנלקחו ממבחני מבחנה לא תמיד משקפים את ההתנהגויות המדויקות של חלבונים הנראים בתאים. ניתן לטפל בדילמה ביוכימאית קלאסית זו ביישומים עתידיים של טכניקה זו עם שינויים ספציפיים. לדוגמה, הוספת חלבוני צימוד פונקציונליים בעלי תווית פלואורסצנטית מרחיבה את השיטה הזו ממחקרים בעלי נימה בודדת למחקרים של מולקולה אחת. ניתן לשנות עוד יותר את הבדיקות כדי להשתמש בתמציות תאים שעשויות להוסיף את גורמי המפתח הלא ידועים "החסרים" הנדרשים כדי לשחזר תופעות דמויות תאים. לדוגמה, לבדיקות מבוססות TIRF המשתמשות בתמציות שמרים או קסנופוס יש טבעות אקטומיוזין מתכווצות37, צירים מיטוטיים 26,38, רכיבים של מכלול אקטין או מיקרוטובול39,40, ואפילו דינמיקה בסנטרוזום ובקינטוכורים 36,41,42,43 . יתר על כן, מערכות כאלה עשויות לסלול את הדרך למערכות תאים מלאכותיות שיש להן ליפידים או גורמי איתות המציגים 44,45,46.

מבחינה היסטורית, אקטין ומיקרוטובולים נתפסו כישויות נפרדות, שלכל אחת מהן קבוצה משלה של חלבונים רגולטוריים, התנהגויות דינמיקה ומיקומים תאיים נפרדים. ראיות רבות מראות כיום כי אקטין ופולימרים של מיקרוטובולים עוסקים במנגנוני crosstalk פונקציונליים החיוניים לביצוע תהליכים תאיים רבים, כולל נדידה, מיקום ציר מיטוטי, הובלה תוך-תאית ומורפולוגיהשל תאים 1,2,3,4. ההתנהגויות המתואמות המגוונות העומדות בבסיס דוגמאות אלה תלויות באיזון מורכב של גורמי צימוד, אותות ותכונות פיזיקליות. עם זאת, הפרטים המולקולריים העומדים בבסיס מנגנונים אלה עדיין אינם ידועים במידה רבה מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בפולימר ציטוסקטלי יחיד בכל פעם 1,2,5.
אקטין ומיקרוטובולים אינם מתקשרים ישירות 6,7,8. הדינמיקה המתואמת של אקטין ומיקרוטובולים הנראים בתאים מתווכת על ידי גורמים נוספים. חלבונים רבים שנחשבו לווסתים את ההצלבה של אקטין-מיקרוטובול זוהו ופעילותם מאופיינת היטב ביחס לפולימר ציטוסקטלי בלבד 1,2. ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שגישת פולימר יחיד זו הסתירה את הפונקציות הכפולות של חלק מהחלבונים/קומפלקסים המאפשרים אירועי צימוד אקטין-מיקרוטובול 7,8,9,10,11,12,13. ניסויים שבהם שני הפולימרים נוכחים הם נדירים ולעתים קרובות מגדירים מנגנונים עם פולימר דינמי יחיד וגרסה מיוצבת סטטית של 6,8,9,10,10,11,14,15,16,17,18 . לפיכך, יש צורך בשיטות כדי לחקור את התכונות המתפתחות של חלבונים מתאמי אקטין-מיקרוטובולים, שניתן להבין אותם במלואם רק במערכות ניסיוניות המשתמשות בשני הפולימרים הדינמיים.
השילוב של גישות לסימון חלבונים ישירים, תגי זיקה מקודדים גנטית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית (TIRF) יושם בהצלחה רבה במערכות שחזור ביומימטיות 19,20,21,22,23. תוכניות רבות מלמטה למעלה אינן מכילות את כל הגורמים המווסתים חלבונים בתאים. עם זאת, טכנולוגיית "ביוכימיה על כוסית" עידנה מנגנונים רבים של דינמיקת אקטין ומיקרוטובולים בקני מידה מרחביים וטמפורליים גבוהים, כולל הרכיבים הדרושים להרכבה או לפירוקשל פולימרים, ותנועת חלבונים מוטוריים 5,12,23,24,25,26,27 . כאן מתוארת גישה מינימלית של רכיב יחיד לחקר צימוד אקטין-מיקרוטובול במבחנה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם חלבונים מטוהרים זמינים מסחרית או טהורים מאוד, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי, תאי פרפוזיה, ומורחבים לסכימות מסובכות יותר המכילות תמציות תאים או מערכות סינתטיות. כאן, חלבון טאו הזמין באופן מסחרי משמש להדגמת האופן שבו הדינמיקה של השלד הציטו-שלדי משתנה בנוכחות חלבון צימוד אקטין-מיקרוטובול, אך ניתן להחליף אותו בגורמים מתאמים אחרים של אקטין-מיקרוטובול. היתרון העיקרי של מערכת זו על פני גישות אחרות הוא היכולת לנטר בו זמנית את הדינמיקה של פולימרים ציטוסקטליים מרובים בתגובה אחת. פרוטוקול זה גם מספק למשתמשים דוגמאות וכלים פשוטים לכימות שינויים בפולימרים של שלדיים. לפיכך, משתמשי הפרוטוקול יפיקו נתונים אמינים, כמותיים, בעלי רזולוציה של נימה אחת, כדי לתאר מנגנונים העומדים בבסיס האופן שבו חלבונים רגולטוריים מגוונים מתאמים את הדינמיקה של אקטין-מיקרוטובול.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

באופן מסורתי, שלדי האקטין והמיקרוטובול נחקרו כישויות נפרדות, מוגבלים לאזורים או תהליכים תאיים ספציפיים, ומווסתים על ידי חבילות שונות של חלבונים קושרים ייחודיים לכל פולימר. מחקרים רבים מראים כיום כי הדינמיקה של שני הפולימרים הציטוסקטליים שלובים זה בזה, וכי הצלבה זו נדרשת עבור רוב ההתנהגויות התאית. מספר חלבונים המעורבים באינטראקציות אקטין-מיקרוטובול כבר זוהו (כלומר, טאו, MACF, GAS, פורמינים ועוד) והם מאופיינים היטב ביחס לאקטין או למיקרוטובולים בלבד. עם זאת, מחקרים מעטים יחסית הראו בדיקות של תיאום אקטין-מיקרוטובול עם גרסאות דינמיות של שני הפולימרים. זה עשוי לחסום מנגנוני קישור מתפתחים בין אקטין למיקרוטובולים. כאן, טכניקת שיקום מחדש של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) המבוססת על מיקרוסקופיה במבחנה מאפשרת הדמיה של דינמיקה של אקטין ומיקרוטובולים הן מהתגובה הביוכימית האחת. טכניקה זו משמרת את דינמיקת הפילמור של חוט אקטין או מיקרוטובולים בנפרד או בנוכחות הפולימר האחר. חלבון טאו הזמין באופן מסחרי משמש להדגמת האופן שבו התנהגויות של אקטין-מיקרוטובולים משתנות בנוכחות חלבון קלאסי של קישור צולב של שלד ציטוסקטלי. שיטה זו יכולה לספק תובנות פונקציונליות ומכניסטיות מהימנות לגבי האופן שבו חלבונים רגולטוריים בודדים מתאמים דינמיקה של אקטין-מיקרוטובולים ברזולוציה של חוטים בודדים או קומפלקסים מסדר גבוה יותר.

עם התנאים שתוארו לעיל (איור 1), פולימרים של אקטין ומיקרוטובול אמורים להיות גלויים (ודינמיים) תוך 2 דקות מרכישת התמונה (איור 2). כמו בכל פרוטוקול מבוסס ביוכימיה, ייתכן שתידרש אופטימיזציה עבור חלבונים רגולטוריים שונים או קבוצות של חלבון. מסיבות אלה, זווית TIRF וחשיפות התמונה מוגדרות תחילה עם תגובות המכילות כל פולימר בנפרד. זה מאשר כי חלבונים מאוחסנים הם פונקציונליים ומספיק חלבון מסומן נמצא לזיהוי. אמנם לא תמיד הכרחי (ולא מבוצע כאן), אך ניתן להשתמש לאחר עיבוד של סרטים (כלומר, חיסור רקע, ממוצע או טרנספורמציות פורייה) כדי לשפר את ניגודיות התמונה (במיוחד של מיקרוטובולים)5,25,33. ההדמיה הישירה של חוטי אקטין יחידים ומיקרוטובולים הניתנים על ידי מבחן זה תומכת בקביעה כמותית של מספר מדדים דינמיים עבור רכיב ציטוסקלטון לבדו או יחדיו, כולל פרמטרי פילמור (כלומר, קצב נוקלאציה או התארכות), פרמטרים של פירוק (כלומר, שיעורי התכווצות או אירועי קטסטרופה), ופחם/חפיפה של פולימרים (איור 3 ). יתר על כן, אמצעים אלה יכולים לשמש כנקודת מוצא לפענוח הקשירה או ההשפעה של ליגנדות רגולטוריות כמו טאו (איור 3). מדידות רבות של חוטי אקטין בודדים או מיקרוטובולים יכולות להיעשות מסרט TIRF אחד. עם זאת, בשל וריאציות בציפוי כיסוי, צנרת וגורמים אחרים, מדידות מהימנות צריכות לכלול גם תגובות/סרטים משוכפלים טכניים מרובים.
היבטים רבים של דינמיקת המיקרוטובולים יכולים להיקבע מקיומוגרפים לדוגמה, כולל קצב התארכות המיקרוטובולים, כמו גם תדירות אירועי הקטסטרופה וההצלה (איור 3A). השימוש בקימוגרפים למדידת דינמיקת אקטין במערכת זו אינו פשוט כל כך מכיוון שחוטים של אקטין מפותלים יותר ממיקרוטובולים. כתוצאה מכך, הפרמטרים של דינמיקת חוט אקטין נמדדים ביד, וזה גוזל זמן ועבודה אינטנסיבית. ספירות נוקלאציה נמדדות כמספר חוטי האקטין הקיימים בנקודת זמן עקבית עבור כל התנאים. ספירות אלה משתנות מאוד על פני שדות הדמיה של TIRF, אך ניתן להשתמש בהן עם שכפולים רבים או כדי להשלים תצפיות ממבחני פילמור אחרים. ספירת גרעין עשויה לשמש גם למיקרו-טובולים אם תנאי הניסוי חסרים זרעי מיקרוטובולים מיוצבים. קצבי התארכות נימה של אקטין נמדדים כאורך החוט לאורך זמן מארבעה פריימים קולנועיים לפחות. ערכי קצב מועברים לכל אקטין מיקרומולרי עם מקדם תיקון של 370 תת-יחידות כדי להסביר את מספר המונומרים של אקטין במיקרון של נימה (איור 3B)32. מדידות להגדרת ההתנהגויות המתואמות בין אקטין למיקרוטובולים מוגדרות פחות טוב. עם זאת, אנליזות מתאמיות יושמו כדי למדוד את צירוף המקרים של שני הפולימרים, כולל סריקות קו (איור 3C) או תוכנת חפיפה 5,11,34.
זמינות נתונים: כל מערכי הנתונים הקשורים לעבודה זו הופקדו בזנודו והם זמינים עם בקשה סבירה בכתובת: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> איור 1. סכמות ניסיוניות: הרכבת תא זרימה לרכישת תמונה. (א) מכלול תא הדמיה. מלמעלה למטה: תאי ההדמיה של IBIDI מודבקים לאורך בארות פרפוזיה (מסומנים בחץ); השכבה השנייה (הלבנה) של גיבוי סרט הדבקה (שנשארה בתמונה המוצגת למשתמשים בעלי אוריינטציה טובה יותר) מוסרת ואפוקסי מוחל בקצה תא ההזלפה (חץ). הערה: כדי לכוון את המשתמשים ביתר קלות היכן למקם את האפוקסי, הגב הלבן הושאר בתמונה זו. הכיסוי המנוקה והמצופה מחובר לתא ההדמיה כאשר צד הציפוי פונה אל פנים באר הזלוף. (B) תרשים זרימה הממחיש את השלבים להתאמת תאי הדמיה עבור קשרים ביוטין-סטרפטווידין. (C) דוגמאות לתגובות המשמשות לרכישת סרטי TIRF של מיקרוטובולים דינמיים וחוטים אקטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> איור 2. רצפי תמונה של חוטי אקטין גדלים ומיקרוטובולים בהיעדר או נוכחות של טאו. מונטאז' תמונה בהילוך מהיר ממבחני TIRF המכיל 0.5 μM אקטין (10% Alexa-647-actin ו-0.09% ביוטין-אקטין מסומן) ו-15 μM ללא טובולין (4% HiLyte-488 מסומן) בהיעדר (A) או נוכחות (B) של 250 ננומטר טאו. הזמן שחלף מתחילת התגובה (ערבוב צינור A וצינור B) מוצג. סרגלי קנה מידה, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> איור 3. מדידות לדוגמה של מיקרוטובולים ודינמיקת חוט אקטין. (A) הקרנת זמן ממוצעת של תעלת טובולין ממחישה ביעילות את אורכי המיקרוטובולים הכוללים עבור סריקות הקו המשמשות ליצירת תרשימי קימוגרף. קווים מנוקדים שחורים מתאימים לשני הקימוגרפים לדוגמה של מיקרוטובולים דינמיים המוצגים מימין. גדילה (קווים שחורים מוצקים) ופאזות פירוק (קווים ורודים מנוקדים; שניים מסומנים בחצים ורודים) של מיקרוטובולים מוצגים על כל קיומוגרף. סרגל קנה מידה של זמן, 3 דקות. סרגל קנה מידה אורך, 10 מיקרומטר. התגובה מכילה 0.5 μM אקטין (10% 647-תווית) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte). רק ערוץ טובולין מוצג. (B) שני מונטאז'ים לדוגמה של תמונות בהילוך מהיר המתארים חוטים חד-אקטיןים המפולימרים באופן פעיל. שיעורי התארכות מחושבים כשיפוע של חלקות באורך חוטי אקטין לאורך זמן לכל אקטין מיקרומולרי אקטין. לפיכך, יש להחיל מקדם תיקון של שניים על תגובות אקטין של 0.5 μM לצורך השוואה לשיעורים הנקבעים בדרך כלל בריכוז אקטין של 1 μM. דוגמאות מחמישה חוטים מוצגות מימין. מוטות קנה מידה, 10 מיקרומטר. התגובה מכילה 0.5 μM אקטין (10% 647-תווית) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte). רק ערוץ האקטין מוצג. (C) תמונות TIRF של מיקרוטובולים דינמיים (MT) (ירוק) וחוטים אקטין (סגול) פולימריזציה בהיעדר (שמאל) או נוכחות של 250 ננומטר טאו (באמצע). קווים וחצים מנוקדים כחולים מסמנים היכן צויר קו עבור החלקות של סריקת הקו המתאימות לכל תנאי (מתחת לכל תמונה). ניתן להבקיע חפיפה בין מיקרוטובולים לאזורי אקטין (המוצגים כשחורים) בנקודת זמן מוגדרת לכל אזור (מימין). מוטות קנה מידה, 25 מיקרומטר. התגובות מכילות אקטין 0.5 μM (10% 647-label) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte) עם או בלי 250 ננומטר טאו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

למרות דוגמאות רבות של קואורדינציה, רוב המחקרים בוחנים את חלבוני האקטין או המיקרוטובול בנפרד. שיטה זו מאפשרת הדמיה של שני הפולימרים הדינמיים בתגובה אחת. טכניקה זו מאפשרת למשתמש להעריך חלבונים רגולטוריים מגוונים עבור תכונות מתפתחות שניתן לראות רק עם גרסאות דינמיות של אקטין ומיקרוטובולים.ניתן להרחיב טכניקה זו כך שתכלול שומנים או תמציות כדי להתקרב לבניית תא סינתטי. התחילו בהפשרת אליקוטים של אבקות PEG-Silane ו-Biotin-PEG-Silane, והמסת אבקות ה-PEG ב-80% אתנול כדי לייצר את תמיסות מלאי הציפויים של 10 מיליגרם למיליליטר mPEG-Silane ושניים עד ארבעה מיליגרם למיליליטר ביוטין-PEG-סילאן. הסר את החלקת הכיסוי הנקייה מאחסון האתנול באמצעות מלקחיים.מייבשים בגז חנקן ומאחסנים בצלחת פטרי נקייה. מצפים את תלושי הכיסוי ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת ציפוי ומדגרים אותם ב-70 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות לפחות או עד לשימוש. חותכים 12 רצועות של סרט דו-צדדי בעל משענת כפולה לאורך של 24 מילימטרים.הסר צד אחד של גיבוי הקלטת ותקן פיסות נייר דבק הסמוכות לששת החריצים הנמצאים בתא הדמיה נקי. הסר את פיסת הגב השנייה של הקלטת כדי לחשוף את הצד הדביק של הקלטת לאורך כל חריץ תא, והנח את סרט הטייפ על משטח נקי. מערבבים שרף אפוקסי ותמיסות הקשחה אחד על אחד בסירת שקילה קטנה, ומשתמשים בקצה P1000 כדי להניח טיפה של אפוקסי מעורב בין רצועות הקלטת בקצה כל חריץ של תא הדמיה.לאחר מכן, הניחו תא, סרט הדבקה או אפוקסי בצד למעלה, על משטח נקי. הסירו את החלקת הכיסוי המצופה מחממת 70 מעלות צלזיוס ושטפו את המשטחים המצופים והלא מצופים של מחליקי הכיסוי במים מזוקקים כפולים שש פעמים. יבש עם גז חנקן מסונן ולאחר מכן הצמד לתא ההדמיה עם ציפוי הכיסוי החלקה בצד לכיוון הסרט.השתמש בקצה פיפטה P200 או P1000 כדי להפעיל לחץ על ממשק הזכוכית המודבקת כדי להבטיח אטימה טובה בין הקלטת לתלוש הכיסוי. דגירו את התאים המורכבים בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות לפחות כדי לאפשר לאפוקסי לאטום באופן מלא את בארות התא לפני השימוש. תאי פרפוזיה פוקעים תוך 12 עד 18 שעות מרגע ההרכבה.השתמש במשאבת פרפוזיה והחלף ברצף פתרונות מיזוג בתא הזלוף על ידי זרימת 50 מיקרוליטרים של 1% BSA כדי להכין את תא ההדמיה. הסר את החיץ העודף ממאגר התאמת מנעול הפיתוי. לאחר מכן, לזרום 50 microliters של 0.005 מיליגרם לכל מיליליטר streptavidin ודגירה במשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר.הסר את המאגר העודף מהמאגר. זרימה של 50 מיקרוליטרים של 1%BSA כדי לחסום את הקשירה הלא ספציפית ולדגירה למשך 10 עד 30 שניות. הסר את המאגר העודף מהמאגר.לאחר מכן, הזרימו 50 מיקרוליטרים של חיץ TIRF חם 1x ולאחר מכן 50 מיקרוליטרים של זרעי מיקרוטובולים מיוצבים ו-50% ביוטילים מדוללים בחיץ TIRF 1x. הכינו את הבמה או את מכשיר החימום האובייקטיבי כדי לשמור על טמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני הדמיית התגובה הביוכימית הראשונה. לאחר מכן, הגדר את מרווח הרכישה לכל חמש שניות למשך 15 עד 20 דקות.לאחר מכן, הגדר 488 ו 647 חשיפות לייזר ל 50 עד 100 אלפיות השנייה ב 5% עד 10% הספק על ידי התאמת תגובת הפילמור הראשון כדי להתחיל את מכלול חוט אקטין. רכשו את התמונות ב-647 ננומטר ובצעו התאמות מתאימות. לאחר מכן, התאימו את תגובת הפילמור בחלוקה מותנית שנייה היטב כדי ליזום את מכלול המיקרוטובולים.דמיינו ב-488 ננומטרים ובצעו התאמות מתאימות. שלבו שלושה מיקרוליטרים של 10 מיקרומולאר 488 טובולין עם 7.2 מיקרוליטר אליקוט של 100 מיקרומולר עם תווית פלואורסצנטית לא יותר מ-15 דקות לפני השימוש. לאחר מכן, שלבו שלושה מיקרוליטרים של אקטין הקשור לביוטין מדולל בכמויות מתאימות של אקטין ללא תווית פלואורסצנטית ומסומן, כך שהתערובת הסופית תהיה 12.5 מיקרומולר סה"כ אקטין עם תווית של 10% עד 30% פלואורסצנטית.הכן את תערובת השלד של הציטוסקלטון על ידי שילוב שני מיקרוליטרים של תערובת אקטין מיקרומולרית של 12.5 מיקרומולר עם תערובת ציר טובולין לא יותר מ-15 דקות לפני ההדמיה. יש לאחסן על קרח עד לשימוש. הכינו את תערובת תגובת החלבון על ידי שילוב של כל המרכיבים והחלבונים הניסיוניים האחרים, כולל חיץ 2x TIRF, אנטי אקונומיקה, נוקלאוטידים, מאגרים וחלבוני עזר.דגירה של תערובת השלד של הציטוסקלטון ותערובת תגובת החלבון בנפרד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 שניות. כדי ליזום את התגובה מוסיפים את התוכן של תערובת תגובת החלבון לתערובת השלד של הציטוסקלטון ומערבבים אותה. זרימה 50 מיקרוליטרים של תערובת התגובה המכילה 1x BUFFER TIRF בתוספת 15 טובולין ללא מיקרומולר, GTP מילימולרי אחד, מונומרים של אקטין מיקרומולרי 0.5, ונפחים מתאימים של פקדי חיץ לתא הזלוף.הקלט סרט בהילוך מהיר באמצעות תוכנת מיקרוסקופ כדי לרכוש כל חמש שניות למשך 15 עד 20 דקות. התנו היטב פרפוזיה חדשה והחליפו את נפח המאגר בחלבון הרגולטורי בעל העניין ובקרות המאגר. לרכוש כדי להעריך את החלבונים הרגולטוריים עבור פונקציות מיקרוטובול אקטין מתפתחות.מדידות לדוגמה של מיקרוטובולים ודינמיקה של חוטי אקטין מוצגות בתמונות אלה. הקרנת הזמן הממוצעת של תעלת טובולין ממחישה ביעילות את אורכי המיקרוטובול הכוללים עבור סריקות הקו המשמשות ליצירת עלילות הקימוגרף. קווים מנוקדים שחורים תואמים את שני הקימוגרפים לדוגמה של המיקרוטובולים הדינמיים.שלבי הצמיחה והפירוק של המיקרוטובולים מוצגים בכל קימוגרף. שני מונטאז'ים לדוגמה של תמונות בהילוך מהיר המתארים חוטי אקטין בודדים המפולימרים באופן פעיל מוצגים כאן. שיעורי התארכות מחושבים כשיפוע החלקות של אורך חוטי אקטין לאורך זמן לכל אקטין מיקרומולרי אקטין.לפיכך, יש ליישם מקדם תיקון של שניים על תגובות אקטין של 0.5 מיקרומולר כדי להשוות את השיעורים הנקבעים בדרך כלל בריכוז אקטין מיקרומולרי אחד. דוגמאות מחמישה חוטים מוצגות כאן. פלואורסצנציה פנימית כוללת של השתקפות פנימית, או תמונות TIRF של המיקרוטובולים הדינמיים בחוטים אקטין פולימריים בהיעדר או נוכחות של 250 ננומולאר טאו מוצגים כאן.קווים מקווקווים כחולים וסימון חצים עונדים קו שורטטו עבור חלקות סריקת הקו המתאימות לכל תנאי. ניתן להבקיע חפיפה בין המיקרוטובולים באזורי האקטין בנקודת זמן מוגדרת לכל אזור. חלבוני שלד ציטוסקטליים, במיוחד אקטין, מיקרוטובולים והרגולטורים שלהם רגישים מאוד למחזורי הקפאה/הפשרה.לקבלת עקביות והצלחה, השתמש בחלבונים טהורים מאוד המאוחסנים כראוי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצ'ין עם מיקרוסקופיית הרחבה

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...