Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

मैं इस प्रोटोकॉल पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए मार्क रिडिला (मरम्मत बायोटेक्नोलॉजीज) और ब्रायन हारर (सनी अपस्टेट) का आभारी हूं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (जीएम 133485) द्वारा समर्थित किया गया था।

खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग शुद्ध प्रोटीन के लिए साइटोस्केलेटल विनियमन 5,23,24,25,26,27,35 के अद्वितीय तंत्र को विच्छेदित करने के लिए एक उपयोगी और सम्मोहक दृष्टिकोण रहा है। पारंपरिक जैव रासायनिक परखों की तुलना में, टीआईआरएफ प्रतिक्रियाओं को बहुत कम मात्रा (50-100 μL) की आवश्यकता होती है, और साइटोस्केलेटल गतिशीलता के मात्रात्मक माप को एक व्यक्तिगत परख से प्राप्त किया जा सकता है। साइटोस्केलेटल गतिशीलता के अधिकांश अध्ययन एक एकल बहुलक प्रणाली (यानी, एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं) पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इस प्रकार आमतौर पर कोशिकाओं में देखे जाने वाले एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच क्रॉसस्टॉक या आकस्मिक व्यवहार के विस्तृत माप मायावी और टेस्ट ट्यूब में पुनरावृत्ति करना मुश्किल रहा है। इस समस्या को हल करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक एकल-फिलामेंट टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्रणाली का वर्णन करता है जो एक ही जैव रासायनिक प्रतिक्रिया में गतिशील एक्टिन और सूक्ष्मनलिका पॉलिमर के प्रत्यक्ष दृश्य को सक्षम बनाता है। इस प्रकार, यह विधि पारंपरिक परखों से परे है जो अकेले एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं के गतिशील व्यवहार को दोहराती है। इस तकनीक को ताऊ के साथ एक उदाहरण के रूप में भी किया गया था कि साइटोस्केलेटन युग्मन कारक की उपस्थिति में कितने गतिशील गुण बदलते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अतिरिक्त प्रोटीन के साथ किया जा सकता है जिसे एक्टिन या सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय करने के लिए जाना जाता है या संदिग्ध किया जा सकता है, जिसमें एमएसीएफ, जीएएस, फॉर्मिन और बहुत कुछ शामिल है (लेकिन सीमित नहीं है)। अंत में, प्रदान किए गए उदाहरण विश्लेषण इस प्रोटोकॉल के साथ अधिग्रहित डेटा को मापने के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
"देखना विश्वास है" माइक्रोस्कोपी-आधारित परख करने का एक सम्मोहक कारण है। हालांकि, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के निष्पादन और व्याख्या में सावधानी की आवश्यकता है। साइटोस्केलेटल सह-असेंबली परख की एक बड़ी चुनौती यह है कि कई आमतौर पर उपयोग की जाने वाली इमेजिंग स्थितियां प्रत्येक बहुलक के अनुरूप नहीं हैं। सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन में आमतौर पर पोलीमराइजेशन के लिए अलग-अलग बफर, तापमान, नमक, न्यूक्लियोटाइड और एकाग्रता आवश्यकताएं होती हैं। एक्टिन, ट्यूबुलिन, ब्याज के नियामक प्रोटीन, और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर फ्रीज-पिघलना चक्रों के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए प्रोटीन और बफर की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग आवश्यक है। इनमें से कई चिंताओं को कम करने के लिए, ताजा पुनर्नवीनीकरण ट्यूबुलिन (<6 सप्ताह के लिए जमे हुए) का उपयोग करना, और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से पूर्व-समाशोधन जमे हुए / ये विचार इस प्रक्रिया के साथ मूल्यांकन किए जाने वाले नियामक प्रोटीन के असंख्य पर भी लागू होते हैं, जो फ्रीज-पिघलना चक्र या बफर लवण 5,11,36 की एकाग्रता के प्रति संवेदनशील हो सकते हैं।
दुर्भाग्य से, प्रयोगात्मक ट्रेडऑफ के बिना कोई भी आकार-फिट-सभी बफर मौजूद नहीं है। कम एकाग्रता के प्रोटीन के लिए अधिक मात्रा उपयुक्त करने के लिए, एटीपी और जीटीपी को 2x टीआईआरएफ बफर समाधान (चित्रा 1 सी) में शामिल किया जा सकता है। हालांकि, क्योंकि ये न्यूक्लियोटाइड फ्रीज-पिघलना चक्रों के प्रति बेहद संवेदनशील हैं, इसलिए इसकी सिफारिश नहीं की जाती है। यहां उपयोग किए जाने वाले ऑक्सीजन मैला ढोने वाले यौगिक (यानी, कैटालेज़ और ग्लूकोज-ऑक्सीडेज) लंबे समय तक प्रोटीन की कल्पना करने के लिए आवश्यक हैं (मिनट से घंटों तक), लेकिन उच्च सांद्रता पर सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन को प्रतिबंधित करने के लिए जाने जाते हैं5. इन बफर विचारों से संबंधित, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि कुछ विहित सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़े नियामक प्रोटीन को अकेले सूक्ष्मनलिकाएं (एक्टिन के बिना) का उपयोग करके कोशिकाओं या परखों में पाए जाने वाले कार्यों को दोहराने के लिए कम या ज्यादा नमक की आवश्यकता हो सकती है। इन चिंताओं को दूर करने के लिए नमक की प्रकृति या एकाग्रता को बदलने से एक्टिन फिलामेंट पोलीमराइजेशन और / या सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के मापदंडों की दर प्रभावित होगी। प्रोटोकॉल की सफलता की पुष्टि करने या विशिष्ट बफर या नियामक प्रोटीन के प्रभावों को स्पष्ट रूप से दस्तावेज करने के लिए कई वर्णनात्मक मापदंडों (न्यूनतम, न्यूक्लिएशन, बढ़ाव दर, और स्थिरता) (चित्रा 3) के माप की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, बहुत अधिक एक्टिन फिलामेंट पोलीमराइजेशन सेकंड के भीतर एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन घटनाओं को अस्पष्ट कर सकता है। नतीजतन, एक्टिन की समग्र एकाग्रता को कम करके या एक्टिन न्यूक्लिएशन (यानी, प्रोफिलिन) को दबाने के लिए अतिरिक्त प्रोटीन सहित ठीक-ट्यूनिंग प्रयोगात्मक स्थितियां समग्र अवधि का विस्तार करेंगी जो समन्वित एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिविधियों को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। इन पूर्वापेक्षाओं को संबोधित करने वाले नियंत्रण, और तकनीकी प्रतिकृतियां (देखने के कई क्षेत्रों से परे), उपयोगकर्ताओं के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
सेल-आधारित अध्ययन प्रत्यक्ष प्रोटीन-प्रोटीन संबंधों या नियामक परिसरों की कार्रवाई का निरीक्षण करने के लिए सीमित अवसर प्रदान करते हैं। इसके विपरीत, इन विट्रो परखों से प्राप्त कुछ तंत्र हमेशा कोशिकाओं में देखे गए प्रोटीन के सटीक व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इस क्लासिक बायोकेमिस्ट दुविधा को विशिष्ट संशोधनों के साथ इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में संबोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक फ्लोरोसेंटली लेबल युग्मन प्रोटीन जोड़ना इस विधि को एकल-फिलामेंट अध्ययन से एकल-अणु अध्ययन तक फैलाता है। परख को सेल अर्क का उपयोग करने के लिए और संशोधित किया जा सकता है जो सेल जैसी घटनाओं को दोहराने के लिए आवश्यक "लापता" अज्ञात कुंजी कारकों को जोड़ सकता है। उदाहरण के लिए, खमीर या ज़ेनोपस अर्क को नियोजित करने वाले टीआईआरएफ-आधारित परखों ने सिकुड़ा हुआ एक्टोमायोसिन के छल्ले37, माइटोटिक स्पिंडल 26,38, एक्टिन या सूक्ष्मनलिका असेंबलीके घटकों 39,40, और यहां तक कि सेंट्रोसोम और कीनेटोकोर्स 36,41,42,43 पर गतिशीलता का पुनर्गठन किया है . इसके अलावा, ऐसी प्रणालियां कृत्रिम सेल प्रणालियों की ओर मार्ग प्रशस्त कर सकती हैं जिनमें लिपिड या सिग्नलिंग कारक44,45,46 मौजूद हैं।

ऐतिहासिक रूप से, एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं अलग-अलग संस्थाओं के रूप में देखी गई हैं, जिनमें से प्रत्येक नियामक प्रोटीन, गतिशीलता व्यवहार और अलग-अलग सेलुलर स्थानों के अपने सेट के साथ है। प्रचुर मात्रा में सबूत अब दर्शाते हैं कि एक्टिन और सूक्ष्मनलिका पॉलिमर कार्यात्मक क्रॉसस्टॉक तंत्र में संलग्न हैं जो माइग्रेशन, माइटोटिक स्पिंडल पोजिशनिंग, इंट्रासेल्युलर ट्रांसपोर्ट और सेल आकृति विज्ञान 1,2,3,4 सहित कई सेल प्रक्रियाओं को निष्पादित करने के लिए आवश्यक हैं। इन उदाहरणों को रेखांकित करने वाले विविध समन्वित व्यवहार युग्मन कारकों, संकेतों और भौतिक गुणों के जटिल संतुलन पर निर्भर हैं। हालांकि, इन तंत्रों को रेखांकित करने वाले आणविक विवरण अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं क्योंकि अधिकांश अध्ययन एक समय 1,2,5 पर एक एकल साइटोस्केलेटल बहुलक पर ध्यान केंद्रित करते हैं।
एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं सीधे 6,7,8 से बातचीत नहीं करती हैं। कोशिकाओं में देखी गई एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं की समन्वित गतिशीलता अतिरिक्त कारकों द्वारा मध्यस्थता की जाती है। एक्टिन-माइक्रोट्यूब्यूल क्रॉसस्टॉक को विनियमित करने के लिए सोचे गए कई प्रोटीनों की पहचान की गई है और उनकी गतिविधियों को अकेले साइटोस्केलेटल बहुलक 1,2 के संबंध में अच्छी तरह से विशेषता है। बढ़ते सबूत बताते हैं कि इस एकल बहुलक दृष्टिकोण ने कुछ प्रोटीन / परिसरों के दोहरे कार्यों को छुपाया है जो एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन घटनाओं को सक्षम करते हैं 7,8,9,10,11,12,13। प्रयोग जहां दोनों पॉलिमर मौजूद हैं दुर्लभ हैं और अक्सर अन्य 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 के एकल गतिशील बहुलक और स्थैतिक स्थिर संस्करण के साथ तंत्र को परिभाषित करते हैं . इस प्रकार, एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय प्रोटीन के आकस्मिक गुणों की जांच करने के लिए तरीकों की आवश्यकता होती है जो केवल प्रयोगात्मक प्रणालियों में पूरी तरह से समझा जा सकता है जो दोनों गतिशील पॉलिमर को नियोजित करते हैं।
प्रत्यक्ष प्रोटीन लेबलिंग दृष्टिकोण, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड आत्मीयता टैग, और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का संयोजन बायोमिमेटिक पुनर्गठन प्रणालियों 19,20,21,22,23 में बड़ी सफलता के साथ लागू किया गया है। कई बॉटम-अप योजनाओं में वे सभी कारक नहीं होते हैं जो कोशिकाओं में प्रोटीन को विनियमित करते हैं। हालांकि, "कवरग्लास पर जैव रसायन" तकनीक ने उच्च स्थानिक और लौकिक तराजू पर एक्टिन और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के कई तंत्रों को परिष्कृत किया है, जिसमें बहुलक असेंबली या विघटन के लिए आवश्यक घटक और मोटर प्रोटीन आंदोलन 5,12,23,24,25,26,27 शामिल हैं . यहां इन विट्रो में एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन की जांच के लिए एक न्यूनतम घटक एकल-फिलामेंट दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या अत्यधिक शुद्ध शुद्ध प्रोटीन, फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन, छिड़काव कक्षों के साथ किया जा सकता है, और सेल अर्क या सिंथेटिक सिस्टम युक्त अधिक जटिल योजनाओं तक बढ़ाया जा सकता है। यहां, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ताऊ प्रोटीन का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है कि एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन प्रोटीन की उपस्थिति में साइटोस्केलेटल गतिशीलता कैसे बदलती है, लेकिन इसे अन्य पुटेटिव एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय कारकों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। अन्य दृष्टिकोणों पर इस प्रणाली का प्रमुख लाभ एक प्रतिक्रिया में कई साइटोस्केलेटल पॉलिमर की गतिशीलता की एक साथ निगरानी करने की क्षमता है। यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को साइटोस्केलेटल पॉलिमर में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उदाहरण और सरल उपकरण भी प्रदान करता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता तंत्र का वर्णन करने के लिए विश्वसनीय, मात्रात्मक, एकल-फिलामेंट रिज़ॉल्यूशन डेटा का उत्पादन करेंगे जो इस बात को रेखांकित करते हैं कि विविध नियामक प्रोटीन एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय कैसे करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

परंपरागत रूप से, एक्टिन और सूक्ष्मनलिका साइटोस्केलेटन का अध्ययन अलग-अलग संस्थाओं के रूप में किया गया है, जो विशिष्ट सेलुलर क्षेत्रों या प्रक्रियाओं तक सीमित है, और प्रत्येक बहुलक के लिए अद्वितीय बाध्यकारी प्रोटीन के विभिन्न सूट द्वारा विनियमित किया गया है। कई अध्ययनों से अब पता चलता है कि दोनों साइटोस्केलेटल पॉलिमर की गतिशीलता आपस में जुड़ी हुई है और अधिकांश सेलुलर व्यवहारों के लिए इस क्रॉसस्टॉक की आवश्यकता होती है। एक्टिन-सूक्ष्मनलिकाएं इंटरैक्शन में शामिल कई प्रोटीन पहले से ही पहचाने जा चुके हैं (यानी, ताऊ, एमएसीएफ, जीएएस, फॉर्मिन, और अधिक) और अकेले एक्टिन या सूक्ष्मनलिकाएं के संबंध में अच्छी तरह से विशेषता है। हालांकि, अपेक्षाकृत कम अध्ययनों ने दोनों पॉलिमर के गतिशील संस्करणों के साथ एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय के परख दिखाए। यह एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच आकस्मिक लिंकिंग तंत्र को रोक सकता है। यहां, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी-आधारित इन विट्रो पुनर्गठन तकनीक एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया से एक्टिन और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता दोनों के दृश्य की अनुमति देती है। यह तकनीक व्यक्तिगत रूप से या अन्य बहुलक की उपस्थिति में एक्टिन फिलामेंट या सूक्ष्मनलिकाएं की पोलीमराइजेशन गतिशीलता को संरक्षित करती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ताऊ प्रोटीन का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है कि क्लासिक साइटोस्केलेटल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन की उपस्थिति में एक्टिन-सूक्ष्मनलिका व्यवहार कैसे बदलते हैं। यह विधि विश्वसनीय कार्यात्मक और यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है कि व्यक्तिगत नियामक प्रोटीन एकल फिलामेंट्स या उच्च-क्रम परिसरों के संकल्प पर एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय कैसे करते हैं।

ऊपर वर्णित शर्तों (चित्रा 1) के साथ, एक्टिन और सूक्ष्मनलिका पॉलिमर छवि अधिग्रहण (चित्रा 2) के 2 मिनट के भीतर दृश्यमान (और गतिशील) होना चाहिए। किसी भी जैव रसायन-आधारित प्रोटोकॉल के साथ, विभिन्न नियामक प्रोटीन या प्रोटीन के बैचों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इन कारणों से, टीआईआरएफ कोण और छवि एक्सपोजर प्रत्येक व्यक्तिगत बहुलक युक्त प्रतिक्रियाओं के साथ पहले सेट किए जाते हैं। यह पुष्टि करता है कि संग्रहीत प्रोटीन कार्यात्मक हैं और पता लगाने के लिए पर्याप्त लेबल प्रोटीन मौजूद है। जबकि हमेशा आवश्यक नहीं है (और यहां प्रदर्शन नहीं किया गया है), फिल्मों के पोस्ट-प्रोसेसिंग (यानी, पृष्ठभूमि घटाव, औसत, या फूरियर परिवर्तन) का उपयोग छवि विपरीत (विशेष रूप से सूक्ष्मनलिकाएं) 5,25,33 को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। इस परख द्वारा प्रदान किए गए एकल एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं का प्रत्यक्ष दृश्य या तो साइटोस्केलेटन घटक के लिए कई गतिशील उपायों के मात्रात्मक निर्धारण का समर्थन करता है, जिसमें पोलीमराइजेशन पैरामीटर (यानी, न्यूक्लिएशन या बढ़ाव दर), विघटन पैरामीटर (यानी, संकोचन दर या तबाही की घटनाएं), और बहुलक कोलिग्नमेंट / ). इसके अलावा, इन उपायों का उपयोग ताऊ (चित्रा 3) जैसे नियामक लिगेंड के बंधन या प्रभाव को समझने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जा सकता है। एकल एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं के कई माप एक टीआईआरएफ फिल्म से किए जा सकते हैं। हालांकि, कवरस्लिप कोटिंग, पाइपिंग और अन्य कारकों में भिन्नता के कारण, विश्वसनीय माप में कई तकनीकी प्रतिकृति प्रतिक्रियाएं /
सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के कई पहलुओं को उदाहरण केमोग्राफ से निर्धारित किया जा सकता है जिसमें सूक्ष्मनलिकाएं बढ़ाव की दर, साथ ही तबाही और बचाव की घटनाओं (चित्रा 3 ए) की आवृत्ति शामिल है। इस प्रणाली में एक्टिन गतिशीलता को मापने के लिए काइमोग्राफ का उपयोग करना उतना सीधा नहीं है क्योंकि एक्टिन फिलामेंट्स सूक्ष्मनलिकाएं की तुलना में अधिक जटिल हैं। नतीजतन, एक्टिन फिलामेंट गतिशीलता के मापदंडों को हाथ से मापा जाता है, जो समय लेने वाली और श्रम गहन है। न्यूक्लिएशन काउंट को सभी स्थितियों के लिए एक सुसंगत समय बिंदु पर मौजूद एक्टिन फिलामेंट्स की संख्या के रूप में मापा जाता है। ये गिनती टीआईआरएफ इमेजिंग क्षेत्रों में व्यापक रूप से भिन्न होती है, लेकिन इसका उपयोग कई प्रतिकृतियों के साथ या अन्य पोलीमराइजेशन परखों से टिप्पणियों के पूरक के लिए किया जा सकता है। न्यूक्लिएशन काउंट का उपयोग सूक्ष्मनलिकाएं के लिए भी किया जा सकता है यदि परीक्षण की स्थिति में स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं बीज की कमी होती है। एक्टिन फिलामेंट बढ़ाव दरों को कम से कम चार फिल्म फ्रेम से समय के साथ फिलामेंट की लंबाई के रूप में मापा जाता है। फिलामेंट (चित्रा 3 बी) 32 के माइक्रोन में एक्टिन मोनोमर्स की संख्या के लिए खाते में 370 सबयूनिट्स के सुधार कारक के साथ दर मूल्यों को प्रति माइक्रोमोलर एक्टिन व्यक्त किया जाता है। एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच समन्वित व्यवहार को परिभाषित करने के लिए माप कम अच्छी तरह से परिभाषित हैं। हालांकि, लाइन स्कैन (चित्रा 3 सी) या ओवरलैप सॉफ्टवेयर 5,11,34 सहित दोनों पॉलिमरके संयोग को मापने के लिए सहसंबंधी विश्लेषण लागू किए गए हैं।
डेटा उपलब्धता: इस काम से जुड़े सभी डेटासेट ज़ेनोडो में जमा किए गए हैं और उचित अनुरोध के साथ उपलब्ध हैं: 10.5281 /
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> चित्र 1. प्रायोगिक योजनाबद्धता: छवि अधिग्रहण के लिए प्रवाह कक्ष विधानसभा। (ए) इमेजिंग चैंबर असेंबली। ऊपर से नीचे: आईबीआईडीआई इमेजिंग कक्षों को छिड़काव कुओं (तीर द्वारा निरूपित) के साथ टेप किया जाता है; टेप बैकिंग की दूसरी (सफेद) परत (बेहतर उन्मुख उपयोगकर्ताओं को दिखाई गई छवि में छोड़ दिया गया है) को हटा दिया जाता है और एपॉक्सी को छिड़काव कक्ष (तीर) के किनारे पर लागू किया जाता है। नोट: उपयोगकर्ताओं को अधिक आसानी से उन्मुख करने के लिए जहां एपॉक्सी रखना है, इस छवि में सफेद बैकिंग छोड़ दी गई थी। साफ और लेपित कवरस्लिप कोटिंग पक्ष के साथ इमेजिंग कक्ष से जुड़ा हुआ है जो छिड़काव के अंदर अच्छी तरह से सामना कर रहा है। (बी) बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन लिंकेज के लिए कंडीशनिंग इमेजिंग कक्षों के लिए चरणों को दर्शाते हुए फ्लो-चार्ट। (सी) गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट्स की टीआईआरएफ फिल्मों को प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिक्रियाओं के उदाहरण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> चित्र 2. ताऊ की अनुपस्थिति या उपस्थिति में बढ़ते एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के छवि अनुक्रम। 250 एनएम ताऊ की अनुपस्थिति (ए) या उपस्थिति (बी) में 0.5 μM एक्टिन (10% एलेक्सा-647-एक्टिन और 0.09% बायोटिन-एक्टिन लेबल) और 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन (4% HiLyte-488 लेबल) युक्त TIRF परख से समय चूक छवि असेंबल। प्रतिक्रिया दीक्षा (ट्यूब ए और ट्यूब बी मिश्रण) से बीता हुआ समय दिखाया गया है। स्केल सलाखों, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> चित्रा 3. सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट गतिशीलता के उदाहरण माप। (ए) ट्यूबुलिन चैनल का औसत समय प्रक्षेपण कुशलतापूर्वक काइमोग्राफ भूखंडों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली लाइन स्कैन के लिए कुल सूक्ष्मनलिकाएं लंबाई की कल्पना करता है। काली बिंदीदार रेखाएं दाईं ओर दिखाए गए गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं के दो उदाहरण के अनुरूप हैं। सूक्ष्मनलिकाएं की वृद्धि (ठोस काली रेखाएं) और विघटन चरण (डॉटेड गुलाबी रेखाएं; गुलाबी तीर के साथ दो निरूपित) प्रत्येक काइमोग्राफ पर दिखाए जाते हैं। समय स्केल बार, 3 मिनट। लंबाई स्केल बार, 10 μm. प्रतिक्रिया में 0.5 μM एक्टिन (10% 647-लेबल) और 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन (4% 488-हाइलाइट लेबल) शामिल हैं। केवल ट्यूबुलिन चैनल दिखाया गया है। (बी) दो उदाहरण समय चूक छवि असेंबल एकल-एक्टिन फिलामेंट्स को सक्रिय रूप से पोलीमराइज़िंग का चित्रण करते हैं। बढ़ाव दरों की गणना प्रति माइक्रोमोलर एक्टिन समय के साथ एक्टिन फिलामेंट्स की लंबाई के भूखंडों की ढलान के रूप में की जाती है। इस प्रकार, आमतौर पर 1 μM एक्टिन एकाग्रता पर निर्धारित दरों की तुलना के लिए दो का एक सुधार कारक 0.5 μM एक्टिन प्रतिक्रियाओं पर लागू किया जाना चाहिए। पांच फिलामेंट्स के उदाहरण दाईं ओर दिखाए गए हैं। स्केल सलाखों, 10 μm. प्रतिक्रिया में 0.5 μM एक्टिन (10% 647-लेबल) और 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन (4% 488-हाइलाइट लेबल) शामिल हैं। केवल एक्टिन चैनल दिखाया गया है। (सी) गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं (एमटी) (हरा) और एक्टिन फिलामेंट्स (बैंगनी) की टीआईआरएफ छवियां अनुपस्थिति (बाएं) या 250 एनएम ताऊ (मध्य) की उपस्थिति में पोलीमराइजिंग। नीली बिंदीदार रेखाएं और तीर चिह्नित करते हैं जहां प्रत्येक स्थिति (प्रत्येक छवि के नीचे) के अनुरूप लाइन स्कैन भूखंडों के लिए एक रेखा खींची गई थी। सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन क्षेत्रों (काले रंग के रूप में दिखाया गया है) के बीच ओवरलैप को प्रति क्षेत्र (दाएं) एक निर्धारित समय बिंदु पर स्कोर किया जा सकता है। स्केल सलाखों, 25 μm. प्रतिक्रियाओं में 0.5 μM एक्टिन (10% 647-लेबल) और 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन (4% 488-HiLyite लेबल) 250 एनएम ताऊ के साथ या बिना होते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

यह प्रोटोकॉल इन विट्रो कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग करके गतिशील एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करने के लिए एक गाइड है।

कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी द्वारा इन विट्रो में एक्टिन और सूक्ष्मनलिका युग्मन गतिशीलता की कल्पना करना

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

समन्वय के कई उदाहरणों के बावजूद, अधिकांश अध्ययन व्यक्तिगत रूप से एक्टिन या सूक्ष्मनलिका प्रोटीन की जांच करते हैं। यह विधि एक ही प्रतिक्रिया में दोनों गतिशील पॉलिमर के दृश्य की अनुमति देती है। यह तकनीक उपयोगकर्ता को आकस्मिक गुणों के लिए विविध नियामक प्रोटीन का आकलन करने की अनुमति देती है जिन्हें केवल एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के गतिशील संस्करणों के साथ देखा जा सकता है।सिंथेटिक सेल के निर्माण के करीब पहुंचने के लिए लिपिड या अर्क को शामिल करने के लिए इस तकनीक का विस्तार किया जा सकता है। पीईजी-सिलेन और बायोटिन-पीईजी-सिलेन पाउडर के विभाज्य को पिघलाकर शुरू करें, और 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर एमपीईजी-सिलेन और दो से चार मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर बायोटिन-पीईजी-सिलेन के कोटिंग स्टॉक समाधान उत्पन्न करने के लिए 80% इथेनॉल में पीईजी पाउडर को भंग करें। संदंश का उपयोग इथेनॉल भंडारण से साफ कवर पर्ची निकालें।नाइट्रोजन गैस के साथ सूखें और एक साफ पेट्री डिश में स्टोर करें। कोटिंग समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ कवर स्लिप्स को कोट करें और उन्हें कम से कम 18 घंटे के लिए या उपयोग करने तक 70 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। डबल-समर्थित डबल-पक्षीय टेप के 12 स्ट्रिप्स को 24 मिलीमीटर की लंबाई तक काटें।टेप बैकिंग के एक तरफ निकालें और एक साफ इमेजिंग चैंबर पर मौजूद छह खांचे से सटे टेप के टुकड़ों को ठीक करें। प्रत्येक कक्ष नाली के साथ टेप के चिपचिपा पक्ष को उजागर करने के लिए टेप बैकिंग के दूसरे टुकड़े को हटा दें, और चैंबर टेप पक्ष को एक साफ सतह पर रखें। एक छोटी वजन नाव में एपॉक्सी राल और हार्डनर समाधान एक-से-एक मिलाएं, और प्रत्येक इमेजिंग चैंबर नाली के अंत में टेप स्ट्रिप्स के बीच मिश्रित एपॉक्सी की एक बूंद रखने के लिए पी 1000 टिप का उपयोग करें।फिर, एक साफ सतह पर कक्ष, टेप या एपॉक्सी पक्ष रखें। 70 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से एक लेपित कवर पर्ची निकालें और छह बार डबल आसुत पानी के साथ कवर पर्ची की लेपित और बिना लेपित सतहों कुल्ला। फ़िल्टर्ड नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी और फिर टेप की ओर कवर स्लिप कोटिंग पक्ष के साथ इमेजिंग कक्ष में चिपकाएं।टेप और कवर पर्ची के बीच एक अच्छी मुहर सुनिश्चित करने के लिए टेप ग्लास इंटरफ़ेस पर दबाव लागू करने के लिए एक पी 200 या पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करें। एपॉक्सी को उपयोग से पहले कक्ष कुओं को पूरी तरह से सील करने की अनुमति देने के लिए कम से कम पांच से 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इकट्ठे कक्षों सेते हैं। छिड़काव कक्ष विधानसभा के 12 से 18 घंटों के भीतर समाप्त हो जाते हैं।एक छिड़काव पंप का प्रयोग करें और क्रमिक रूप से इमेजिंग चैंबर को प्राइम करने के लिए 1% बीएसए के 50 माइक्रोलीटर बहकर छिड़काव कक्ष में कंडीशनिंग समाधान का आदान-प्रदान करें। लालच लॉक फिटिंग जलाशय से अतिरिक्त बफर निकालें। फिर, 0.005 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर स्ट्रेप्टाविडिन के 50 माइक्रोलीटर प्रवाहित करें और कमरे के तापमान पर एक से दो मिनट के लिए सेते हैं।जलाशय से अतिरिक्त बफर निकालें। निरर्थक बाध्यकारी को अवरुद्ध करने और 10 से 30 सेकंड के लिए सेते हैं, 1% बीएसए के 50 माइक्रोलीटर प्रवाह। जलाशय से अतिरिक्त बफर निकालें।अगला, गर्म 1x TIRF बफर के 50 माइक्रोलीटर प्रवाह और फिर 1x TIRF बफर में पतला स्थिर और 50% बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिका बीज के 50 माइक्रोलीटर। पहली जैव रासायनिक प्रतिक्रिया इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए 35 से 37 डिग्री सेल्सियस तापमान बनाए रखने के लिए चरण या उद्देश्य हीटर डिवाइस सेट करें। फिर, अधिग्रहण अंतराल को 15 से 20 मिनट के लिए हर पांच सेकंड में सेट करें।इसके बाद, एक्टिन फिलामेंट असेंबली शुरू करने के लिए पोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया को पहले समायोजित करके 5% से 10% पावर पर 50 से 100 मिलीसेकंड के लिए 488 और 647 लेजर एक्सपोजर सेट करें। 647 नैनोमीटर पर छवियों को प्राप्त करें और उचित समायोजन करें। फिर, सूक्ष्मनलिकाएं असेंबली शुरू करने के लिए एक दूसरे वातानुकूलित छिड़काव में पोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया को अच्छी तरह से समायोजित करें।488 नैनोमीटर पर कल्पना करें और उचित समायोजन करें। उपयोग से पहले 100 माइक्रोमोलर फ्लोरोसेंटली अनलेबल ट्यूबुलिन के 7.2 माइक्रोलीटर विभाज्य के साथ 10 माइक्रोमोलर 488 ट्यूबुलिन के तीन माइक्रोलीटर मिलाएं। फिर, पतला बायोटिन से संबंधित एक्टिन के तीन माइक्रोलीटर को फ्लोरोसेंटली अनलेबल और लेबल वाले एक्टिन की उचित मात्रा में मिलाएं जैसे कि अंतिम मिश्रण 10% से 30% फ्लोरोसेंट लेबल के साथ 12.5 माइक्रोमोलर कुल एक्टिन होगा।इमेजिंग से पहले ट्यूबुलिन स्टॉक मिश्रण के साथ 12.5 माइक्रोमोलर एक्टिन मिक्स स्टॉक के दो माइक्रोलीटर के संयोजन से साइटोस्केलेटन मिश्रण तैयार करें। उपयोग होने तक बर्फ पर स्टोर करें। 2x TIRF बफर, विरोधी ब्लीच, न्यूक्लियोटाइड, बफर, और गौण प्रोटीन सहित अन्य सभी प्रयोगात्मक घटकों और प्रोटीन के संयोजन से प्रोटीन प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।साइटोस्केलेटन मिश्रण और प्रोटीन प्रतिक्रिया मिश्रण को 30 से 60 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अलग से सेते हैं। प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए साइटोस्केलेटन मिश्रण में प्रोटीन प्रतिक्रिया मिश्रण की सामग्री जोड़ें और इसे मिलाएं। 15 माइक्रोमोलर मुक्त ट्यूबुलिन, एक मिलीमोलर जीटीपी, 0.5 माइक्रोमोलर एक्टिन मोनोमर्स, और छिड़काव कक्ष में बफर नियंत्रण की उचित मात्रा के साथ पूरक 1 एक्स टीआईआरएफ बफर युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर प्रवाह।15 से 20 मिनट के लिए हर पांच सेकंड प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक समय चूक फिल्म रिकॉर्ड करें। एक नया छिड़काव अच्छी तरह से शर्त और ब्याज और बफर नियंत्रण के नियामक प्रोटीन के साथ बफर मात्रा की जगह। आकस्मिक एक्टिन सूक्ष्मनलिका कार्यों के लिए नियामक प्रोटीन का आकलन करने के लिए प्राप्त करें।सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट गतिशीलता के उदाहरण माप इन छवियों में दिखाए गए हैं। ट्यूबलिन चैनल का औसत समय प्रक्षेपण कुशलतापूर्वक काइमोग्राफ भूखंडों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली लाइन स्कैन के लिए कुल सूक्ष्मनलिका लंबाई की कल्पना करता है। काली बिंदीदार रेखाएं गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं के दो उदाहरण काइमोग्राफ के अनुरूप हैं।सूक्ष्मनलिकाएं के विकास और विघटन चरणों को प्रत्येक किमोग्राफ पर दिखाया गया है। एकल एक्टिन फिलामेंट्स को सक्रिय रूप से पोलीमराइज़ करने वाले दो उदाहरण टाइम लैप्स इमेज मोंटेज यहां दिखाए गए हैं। बढ़ाव दरों की गणना प्रति माइक्रोमोलर एक्टिन समय के साथ एक्टिन फिलामेंट्स की लंबाई के भूखंडों की ढलान के रूप में की जाती है।इस प्रकार, आमतौर पर एक माइक्रोमोलर एक्टिन एकाग्रता पर निर्धारित दरों की तुलना करने के लिए 0.5 माइक्रोमोलर एक्टिन प्रतिक्रियाओं पर दो का एक सुधार कारक लागू किया जाना चाहिए। पांच फिलामेंट्स के उदाहरण यहां दिखाए गए हैं। कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति, या 250 नैनोमोलर ताऊ की अनुपस्थिति या उपस्थिति में एक्टिन फिलामेंट्स पोलीमराइजिंग में गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं की टीआईआरएफ छवियां यहां दिखाई गई हैं।नीली बिंदीदार रेखाएं और तीर निशान पहनते हैं प्रत्येक स्थिति के अनुरूप लाइन स्कैन भूखंडों के लिए एक रेखा खींची गई थी। एक्टिन क्षेत्रों में सूक्ष्मनलिकाएं के बीच ओवरलैप को प्रति क्षेत्र एक निर्धारित समय बिंदु पर स्कोर किया जा सकता है। साइटोस्केलेटल प्रोटीन, विशेष रूप से एक्टिन, सूक्ष्मनलिकाएं, और उनके नियामक फ्रीज / पिघलना चक्रों के प्रति बहुत संवेदनशील हैं।स्थिरता और सफलता के लिए, अत्यधिक शुद्ध और ठीक से संग्रहीत प्रोटीन का उपयोग करें।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

सह-अवसादन द्वारा एफ-एक्टिन के लिए प्रोटीन बाध्यकारी मापना

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

इन विट्रो बहुलकीकरण के F प-actin पर जल्दी Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

इमेजिंग Amyloid ऊतक Hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग द्वारा Luminescent संयुग्मित Oligothiophenes के साथ दाग

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

प्रतिलेखन फैक्टर के उच्च संवेदनशीलता माप-प्रतिस्पर्धी अनुमापन द्वारा डीएनए बाध्यकारी समानताएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

कल्पना सतह टी-सेल रिसेप्टर गतिशीलता चार आयामी जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

उच्च थ्रूपुट कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस और डायरेक्ट स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी एक फोटोनिक चिप का उपयोग कर

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

सिंगल नैनोपार्टिकल डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल झिल्ली पर गोल्ड नैनोरोड्स की प्रसार गतिशीलता की कल्पना करना

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

विस्तार माइक्रोस्कोपी के साथ पोडोसाइटिक प्रोटीन नेफ्रिन, ऐक्टिन और पोडोसिन की इमेजिंग

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

इन विट्रो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित गतिशीलता परख के मायोसिन-विशिष्ट अनुकूलन

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...