Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Marc Ridilla(Repair Biotechnologies)とBrian Haarer(SUNY Upstate)に、このプロトコルに関する有益なコメントをいただいたことに感謝しています。この研究は、国立衛生研究所(GM133485)の支援を受けた。

開示すべき利益相反はありません。

可視化された精製タンパク質に全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用することは、細胞骨格調節のユニークなメカニズムを解剖するための実りある説得力のあるアプローチでした5、23、24、25、26、27、35。従来の生化学的アッセイと比較して、TIRF反応は非常に少量(50-100μL)を必要とし、細胞骨格ダイナミクスの定量的測定は個々のアッセイから収集することができる。細胞骨格ダイナミクスのほとんどの研究は、単一のポリマー系(すなわち、アクチンフィラメントまたは微小管)に焦点を当てているため、細胞で典型的に見られるアクチンフィラメントと微小管との間のクロストークまたは創発的挙動の詳細な測定は、とらえどころがなく、試験管内で反復することが困難であった。この問題を解決するために、このプロトコルは、同じ生化学反応における動的アクチンおよび微小管ポリマーの直接可視化を可能にするシングルフィラメントTIRF顕微鏡システムを記述する。したがって、この方法は、アクチンフィラメントまたは微小管のみの動的挙動を再現する従来のアッセイを超えています。この技術は、細胞骨格結合因子の存在下でいくつかの動的特性がどのように変化するかの例としてタウを用いても行われた。このプロトコルは、MACF、GAS、ホルミンなどを含む(ただしこれらに限定されない)アクチンまたは微小管ダイナミクスを調整することが知られている、または疑われる追加のタンパク質と共に使用することができる。最後に、提供されたサンプル分析は、このプロトコルで取得したデータを定量化するためのガイドとして使用できます。
「見ることは信じること」は、顕微鏡ベースのアッセイを実行する説得力のある理由です。しかしながら、TIRF顕微鏡実験の実行および解釈には注意が必要である。細胞骨格共集合アッセイの1つの大きな課題は、一般的に使用される多くのイメージング条件が各ポリマーに適合しないことである。微小管およびアクチンは、典型的には、重合のための異なる緩衝液、温度、塩、ヌクレオチド、および濃度要件を有する。アクチン、チューブリン、目的の調節タンパク質、およびこのプロトコルで利用されるバッファーは、凍結融解サイクルに敏感です。したがって、このプロトコルを正常に実行するには、タンパク質とバッファーの慎重な取り扱いが必要です。これらの懸念の多くを軽減するために、新しくリサイクルされたチューブリン(<6週間凍結)を使用し、超遠心分離による凍結/再懸濁アクチンの事前除去を強く推奨します。これらの考慮事項は、この手順で評価される無数の調節タンパク質にも適用され、凍結融解サイクルまたは緩衝塩の濃度に敏感である可能性がある5、11、36。
残念ながら、実験的なトレードオフのない万能のバッファは存在しません。より低濃度のタンパク質に対してより多くの容量を適切とするために、ATPおよびGTPを2x TIRF緩衝液に含ませてもよい(図1C)。しかし、これらのヌクレオチドは凍結融解サイクルに対して非常に敏感であるため、推奨されません。ここで用いられる脱酸素化合物(カタラーゼおよびグルコースオキシダーゼ)は、タンパク質を長期間(数分から数時間)可視化するために必要であるが、高濃度での微小管重合を制限することが知られている5。これらのバッファーに関する考慮事項に関連して、このプロトコルの限界は、いくつかの標準的な微小管関連調節タンパク質が、微小管のみ(アクチンを含まない)を用いた細胞またはアッセイにおいて見出される機能を再現するために多かれ少なかれ塩を必要とする可能性があることである。これらの懸念に対処するために塩の性質または濃度を変更することは、アクチンフィラメント重合の速度および/または微小管ダイナミクスのパラメータに影響を与える可能性が高い。複数の記述パラメータ(最小、核生成、伸長速度、および安定性)の測定(図3)は、プロトコルの成功を確認したり、特定のバッファーや調節タンパク質の影響を明示的に文書化したりするために必要です。例えば、アクチンフィラメント重合が多すぎると、数秒以内にアクチン-微小管結合イベントが不明瞭になる可能性があります。その結果、アクチンの全体的な濃度を低下させることによる、またはアクチン核形成を抑制するための追加のタンパク質(すなわち、プロフィリン)を含むことによって実験条件を微調整することは、アクチン−微小管活性を協調させる全体的な期間を延長することが明確に見ることができる。これらの前提条件に対処するコントロールと技術的な複製 (複数の視野を超えて) は、ユーザーが信頼性と再現性のある結果を生成するために不可欠です。
細胞ベースの研究は、タンパク質とタンパク質の直接的な関係や調節複合体の作用を観察する機会が限られています。対照的に、in vitroアッセイから収集されたメカニズムのいくつかは、細胞で見られるタンパク質の正確な挙動を必ずしも反映しているとは限らない。この古典的な生化学者のジレンマは、この技術の将来の応用において、特定の修正を加えて対処することができる。例えば、機能的に蛍光標識されたカップリングタンパク質を添加すると、この方法はシングルフィラメント研究から単一分子研究に拡張されます。アッセイは、細胞様現象を再現するために必要な「欠落している」未知の重要な因子を追加する可能性のある細胞抽出物を使用するようにさらに修正することができる。例えば、酵母またはアフリカツメガエル抽出物を用いるTIRFベースのアッセイは、収縮性アクトミオシン環37、有糸分裂紡錘体26、38、アクチンまたは微小管集合体39、40の構成要素、さらにはセントロソームおよびキネトコール36、41、42、43におけるダイナミクスを再構成した。.さらに、そのようなシステムは、脂質またはシグナル伝達因子が存在する人工細胞系への道を開き得る44、45、46。

歴史的に、アクチンと微小管は別々の実体と見なされ、それぞれが独自の調節タンパク質のセット、ダイナミクス行動、および異なる細胞位置を有する。アクチンおよび微小管ポリマーが、遊走、有糸分裂紡錘体位置決め、細胞内輸送、および細胞形態を含む多数の細胞プロセスを実行するために不可欠な機能的クロストーク機構に関与することを、現在実証している1,2,3,4。これらの例の根底にある多様な協調挙動は、結合因子、信号、および物理的特性の複雑なバランスに依存しています。しかし、これらのメカニズムを支える分子の詳細は、ほとんどの研究が一度に単一の細胞骨格ポリマーに焦点を当てているため、まだほとんど不明です1,2,5。
アクチンと微小管は直接相互作用しない6、7、8。細胞に見られるアクチンおよび微小管の協調ダイナミクスは、追加の因子によって媒介される。アクチン-微小管クロストークを調節すると考えられる多くのタンパク質が同定されており、その活性は細胞骨格ポリマー単独のいずれに関しても十分に特徴付けられている1,2。増え続ける証拠は、この単一のポリマーアプローチが、アクチン - 微小管結合事象7,8,9,10,11,12,13を可能にするいくつかのタンパク質/複合体の二重機能を隠蔽したことを示唆している。両方のポリマーが存在する実験はまれであり、しばしば単一の動的ポリマーおよび他の6,8,9,10,11,14,15,16,17,18の静的安定化バージョンによるメカニズムを定義する.したがって、アクチン-微小管調整タンパク質の創発的な特性を調査するには、両方の動的ポリマーを使用する実験系でのみ完全に理解できる方法が必要である。
直接タンパク質標識アプローチ、遺伝的にコードされた親和性タグ、および全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法の組み合わせは、生体模倣再構成系において大きな成功を収めて適用されている19、20、21、22、23。多くのボトムアップスキームには、細胞内のタンパク質を調節するすべての因子が含まれているわけではありません。しかし、「カバーグラス上の生化学」技術は、ポリマーの組み立てまたは分解に必要な成分、およびモータータンパク質の動きを含む、高い空間的および時間的スケールでのアクチンおよび微小管ダイナミクスの多くのメカニズムを洗練させました5、12、23、24、25、26、27.ここでは、インビトロでアクチン-微小管結合を調査するための最小成分単一フィラメントアプローチが記載されている。このプロトコールは、市販または高純度の精製タンパク質、蛍光標識タンパク質、灌流チャンバー、および細胞抽出物または合成系を含むより複雑なスキームに拡張して使用することができる。ここで、市販のタウタンパク質は、アクチン-微小管結合タンパク質の存在下で細胞骨格ダイナミクスがどのように変化するかを実証するために使用されるが、他の推定アクチン-微小管協調因子と置き換えることができる。他のアプローチに対するこのシステムの主な利点は、1つの反応で複数の細胞骨格ポリマーのダイナミクスを同時に監視できることです。このプロトコルは、細胞骨格ポリマーへの変化を定量化するための例と簡単なツールをユーザーに提供します。したがって、プロトコルユーザーは、信頼性の高い定量的なシングルフィラメント分解能データを生成して、多様な調節タンパク質がアクチン-微小管ダイナミクスをどのように調整するかの根底にあるメカニズムを記述します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

伝統的に、アクチンおよび微小管細胞骨格は、別個の実体として研究され、特定の細胞領域またはプロセスに制限され、各ポリマーに固有の結合タンパク質の異なるスイートによって調節されてきた。多くの研究は、両方の細胞骨格ポリマーのダイナミクスが絡み合っており、このクロストークがほとんどの細胞行動に必要であることを実証しています。アクチン-微小管相互作用に関与する多くのタンパク質(すなわち、タウ、MACF、GAS、ホルミンなど)がすでに同定されており、アクチンまたは微小管のみに関して十分に特徴付けられている。しかし、比較的少数の研究は、両方のポリマーの動的バージョンとのアクチン - 微小管配位アッセイを示した。これは、アクチンと微小管との間の創発的な連結機構を閉塞する可能性がある。ここで、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡ベースの in vitro 再構成技術は、1つの生化学反応からアクチンおよび微小管の両方のダイナミクスの視覚化を可能にする。この技術は、アクチンフィラメントまたは微小管のいずれかの重合動力学を個々に、または他のポリマーの存在下で保存する。市販のタウタンパク質は、古典的な細胞骨格架橋タンパク質の存在下でアクチン - 微小管挙動がどのように変化するかを実証するために使用される。この方法は、個々の調節タンパク質が単一フィラメントまたは高次複合体の分解能でアクチン - 微小管ダイナミクスをどのように調整するかについての信頼性の高い機能的および機構的洞察を提供することができる。

上記の条件(図1)により、アクチンおよび微小管ポリマーは、画像取得から2分以内に可視(および動的)になるはずです(図2)。他の生化学ベースのプロトコルと同様に、異なる調節タンパク質またはタンパク質のバッチに対して最適化が必要な場合があります。これらの理由から、TIRF角度と画像露光は、個々のポリマーを含む反応で最初に設定されます。これは、保存されたタンパク質が機能的であり、検出に十分な標識タンパク質が存在することを確認する。必ずしも必要ではない(ここでは実行されない)が、映画の後処理(すなわち、背景減算、平均化、またはフーリエ変換)を使用して、画像コントラスト(特に微小管)を増強することができる5、25、33。このアッセイによってもたらされる単一アクチンフィラメントおよび微小管の直接可視化は、重合パラメータ(すなわち、核生成または伸長速度)、分解パラメータ(すなわち、収縮速度または大惨事事象)、およびポリマーのコアラインメント/オーバーラップを含む、細胞骨格成分単独または一緒にいくつかの動的測定の定量的決定を支持する(図3).さらに、これらの測定は、タウのような調節リガンドの結合または影響を解読するための出発点として使用することができる(図3)。単一のアクチンフィラメントまたは微小管の多くの測定は、1つのTIRFフィルムから行うことができる。ただし、カバースリップコーティング、ピペッティング、およびその他の要因のばらつきにより、信頼性の高い測定には複数の技術的複製反応/ムービーも含める必要があります。
微小管ダイナミクスの多くの側面は、微小管の伸び率、大惨事や救助イベントの頻度など、キモグラフの例から決定することができます(図3A)。このシステムでアクチンダイナミクスを測定するためにキモグラフを使用することは、アクチンフィラメントが微小管よりも複雑であるため、それほど簡単ではありません。その結果、アクチンフィラメントダイナミクスのパラメータは手作業で測定され、時間と労力がかかります。核生成カウントは、すべての条件について一貫した時点で存在するアクチンフィラメントの数として測定される。これらのカウントは、TIRFイメージング分野によって大きく異なりますが、多くの反復で使用したり、他の重合アッセイからの観察を補完するために使用できます。核生成カウントは、試験条件が安定化微小管種子を欠いている場合、微小管にも使用することができる。アクチンフィラメント伸長速度は、少なくとも4つのムービーフレームからの経時的なフィラメントの長さとして測定される。レート値は、ミクロンのフィラメント中のアクチンモノマーの数を説明するために、370サブユニットの補正係数でマイクロモルアクチン当たりに搬送される(図3B)32。アクチンと微小管との間の協調挙動を定義するための測定は、あまり明確に定義されていない。しかし、相関分析は、ラインスキャン(図3C)またはオーバーラップソフトウェア5、11、34を含む両方のポリマーの一致を測定するために適用されている。
データの可用性: この作業に関連するすべてのデータセットはZenodoに寄託されており、10.5281/zenodo.6368327で合理的な要求で入手できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> 図1.実験回路図:フローチャンバアセンブリから画像取得まで。(A)イメージングチャンバアセンブリ。上から下へ:IBIDIイメージングチャンバは、灌流ウェル(矢印で示す)に沿ってテープで固定される。テープバッキングの2番目の(白い)層(ユーザーの向きを良くするために示されている画像では左側)が除去され、エポキシが灌流チャンバの端(矢印)に塗布される。注: エポキシを配置する場所をユーザーにより簡単に指示するために、このイメージでは白いバッキングがオンのままになっています。洗浄およびコーティングされたカバースリップは、コーティング側が灌流ウェルの内側に面して画像化チャンバに取り付けられる。(b)画像化チャンバをビオチン−ストレプトアビジン結合のためにコンディショニングするためのステップを示すフローチャート。(c)動的微小管およびアクチンフィラメントのTIRF膜を取得するために用いられる反応の例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> 図2.Tauの非存在下または存在下で増殖するアクチンフィラメントおよび微小管の画像配列。 250 nM Tauの非存在下(A)または存在下(B)において、0.5μMアクチン(10%Alexa-647-アクチンおよび0.09%ビオチン-アクチン標識)および15μM遊離チューブリン(4%HiLyte-488標識)を含むTIRFアッセイからのタイムラプス画像モンタージュ。反応開始からの経過時間(チューブAとチューブBの混合)を示す。スケール バー、25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> 図3.微小管およびアクチンフィラメントダイナミクスの測定例。 (A)チューブリンチャネルの平均時間投影は、カイモグラフプロットを生成するために使用されるラインスキャンの微小管総長を効率的に視覚化します。黒い点線は、右に示す動的微小管の2つのキモグラフの例に対応する。微小管の成長段階(実線の黒い線)と分解段階(ピンクの点線、ピンク色の矢印で表記された2本)が各キモグラフに表示されます。タイムスケールバー、3分。長さスケールバー、10μm。反応は、0.5μMアクチン(10%647標識)および15μM遊離チューブリン(4%488-HiLyte標識)を含有する。チューブリンチャネルのみが表示されます。(B)活発に重合するシングルアクチンフィラメントを描いた2つの例のタイムラプス画像モンタージュ。伸長率は、マイクロモルアクチン当たりの経時的なアクチンフィラメントの長さのプロットの傾きとして計算される。したがって、1 μM アクチン濃度で典型的に決定される速度の比較のために、2 つの補正係数を 0.5 μM アクチン反応に適用する必要があります。5本のフィラメントの例を右に示す。スケールバー、10μm。反応は、0.5μMアクチン(10%647標識)および15μM遊離チューブリン(4%488-HiLyte標識)を含有する。アクチンチャネルのみが表示されます。(c)動的微小管(MT)(緑色)およびアクチンフィラメント(紫色)の非存在下(左)または250nM Tau(中央)の存在下で重合するTIRF画像。青い点線と矢印は、各条件に対応するラインスキャンプロットの線が引かれた場所を示します(各画像の下)。微小管とアクチン領域(黒で表示)の間の重なりは、面積ごとに設定された時点でスコアリングすることができる(右)。スケールバー、25μm。反応には、0.5 μM アクチン (10% 647-標識) および 15 μM 遊離チューブリン (4% 488-HiLyte 標識) が含まれ、250 nM Tau の有無にかかわらず含まれます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

協調の多くの例にもかかわらず、ほとんどの研究はアクチンまたは微小管タンパク質を個別に調べる。この方法は、単一の反応における両方の動的ポリマーの視覚化を可能にする。この技術により、ユーザーは、アクチンおよび微小管の動的バージョンでのみ見ることができた創発的な特性について、多様な調節タンパク質を評価することができる。この技術は、合成細胞の構築に近づくために脂質または抽出物を含むように拡張することができる。PEGシランおよびビオチン-PEG-シラン粉末のアリコートを解凍し、PEG粉末を80%エタノールに溶解して、mPEGシラン1ミリリットルあたり10ミリグラム、ビオチン-PEGシラン1ミリリットルあたり2〜4ミリグラムのコーティングストック溶液を生成することから始めます。鉗子を使用してエタノール貯蔵からきれいなカバースリップを取り外します。窒素ガスで乾燥させ、清潔なペトリ皿に保管してください。カバースリップを100マイクロリットルのコーティング溶液でコーティングし、少なくとも18時間または使用時まで摂氏70度でインキュベートする。両面テープを 12 枚切り取って、長さ 24 mm にします。テープバッキングの片側を取り外し、クリーンなイメージングチャンバにある6つの溝に隣接するテープ片を固定します。テープの粘着面を各チャンバー溝に沿って露出させるために2枚目のテープバッキングを取り外し、チャンバーテープ側を上向きに清潔な面に置きます。小さな計量ボートでエポキシ樹脂と硬化剤溶液を1対1で混合し、P1000チップを使用して、各イメージングチャンバ溝の端にあるテープストリップ間に混合エポキシの滴を配置します。次に、チャンバー、テープ、またはエポキシ側を上にして、きれいな表面に置きます。コーティングされたカバースリップを摂氏70度のインキュベーターから取り出し、カバースリップのコーティングされた表面とコーティングされていない表面を二重蒸留水で6回すすいでください。ろ過した窒素ガスで乾燥させた後、カバースリップコーティング側をテープに向けて撮影室に貼り付けます。P200またはP1000ピペットチップを使用してテープ付きガラスのインターフェースに圧力をかけ、テープとカバースリップの間の良好なシールを確保します。組み立てたチャンバーを室温で少なくとも5〜10分間インキュベートして、エポキシが使用前にチャンバーウェルを完全に密閉できるようにします。灌流チャンバーは、組み立てから12〜18時間以内に期限切れになります。灌流ポンプを使用し、50マイクロリットルの1%BSAを流して灌流チャンバ内のコンディショニング溶液を順次交換し、イメージングチャンバをプライミングします。ルアーロックフィッティングリザーバから余分なバッファを取り除きます。次いで、ストレプトアビジン1ミリリットル当たり0.005ミリグラムの50マイクロリットルを流し、室温で1〜2分間インキュベートする。余分なバッファーをリザーバーから取り出します。50マイクロリットルの1%BSAを流して非特異的結合をブロックし、10〜30秒間インキュベートする。余分なバッファーをリザーバーから取り出します。次に、50マイクロリットルの温かい1x TIRF緩衝液を流し、次いで50マイクロリットルの安定化および50%ビオチン化微小管種子を1x TIRF緩衝液で希釈する。最初の生化学反応をイメージングする前に、ステージまたは対物ヒーター装置を35〜37°Cの温度を30分間維持するように設定します。次に、取得間隔を15~20分間5秒毎に設定します。次に、まず重合反応を調整してアクチンフィラメントアセンブリを開始することにより、488および647レーザー露光を5%〜10%パワーで50〜100ミリ秒に設定した。647ナノメートルで画像を取得し、適切な調整を行います。次いで、第2の馴化灌流ウェルで重合反応を調整し、微小管アセンブリを開始する。488ナノメートルで可視化し、適切な調整を行います。使用の15分以内に、3マイクロリットルの10マイクロモル488チューブリンを100マイクロモルの蛍光標識されていないチューブリンの7.2マイクロリットルアリコートと組み合わせる。次いで、3マイクロリットルの希釈ビオチン関連アクチンを、蛍光的に標識されていない標識アクチンの適切な体積に結合して、最終混合物が10%〜30%の蛍光標識を有する総アクチンの12.5マイクロモルになるようにする。イメージングの15分前までに、2マイクロリットルの12.5マイクロモルのアクチンミックスストックをチューブリンストックミックスと組み合わせることによって、細胞骨格ミックスを調製する。使用時まで氷の上に保管してください。2x TIRFバッファー、抗漂白剤、ヌクレオチド、バッファー、およびアクセサリータンパク質を含む他のすべての実験成分およびタンパク質を組み合わせて、タンパク質反応ミックスを調製します。細胞骨格ミックスとタンパク質反応ミックスを別々に摂氏37度で30〜60秒間インキュベートする。反応を開始するには、タンパク質反応ミックスの内容物を細胞骨格ミックスに追加し、それを混合する。15マイクロモルの遊離チューブリン、1ミリモルのGTP、0.5マイクロモルのアクチンモノマー、および適切な量の緩衝液を添加した1x TIRF緩衝液を含む反応混合物の50マイクロリットルを灌流チャンバに流す。顕微鏡ソフトを使用してタイムラプス動画を録画し、5秒ごとに15~20分間取得します。新しい灌流をウェルにコンディショニングし、バッファー容量を目的の調節タンパク質およびバッファーコントロールに置き換えます。創発的なアクチン微小管機能に対する調節タンパク質を評価するために取得する。微小管およびアクチンフィラメントダイナミクスの測定例をこれらの画像に示す。チューブリンチャネルの平均時間投影は、Kymographプロットの生成に使用されるラインスキャンの全微小管長を効率的に視覚化します。黒い点線は、動的微小管の2つの例のキモグラフに対応する。微小管の成長および分解段階は、各Kymographに示されている。活発に重合する単一のアクチンフィラメントを描いた2つのタイムラプス画像モンタージュの例がここに示されている。伸長率は、マイクロモル当たりのアクチンフィラメントの長さのプロットの傾きとして計算され、経時的にアクチンがかかる。したがって、2つの補正係数を0.5マイクロモルアクチン反応に適用して、1マイクロモルアクチン濃度で典型的に決定される速度を比較しなければならない。5本のフィラメントの例をここに示します。全内部反射蛍光、または250ナノモルタウの非存在下で重合するアクチンフィラメント中の動的微小管のTIRF画像がここに示されている。青色の点線及び矢印マークは、各条件に対応する線走査プロットについて線を引いた。アクチン領域における微小管間の重なりは、面積当たり設定された時点でスコアリングすることができる。細胞骨格タンパク質、特にアクチン、微小管、およびそれらの調節因子は、凍結/融解サイクルに対して非常に敏感である。一貫性と成功のためには、高純度で適切に保存されたタンパク質を使用してください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

拡張顕微鏡によるポドサイクタンパク質のイメージングニーフリン、アクチン、ポドシン

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのインビトロでの可視化