Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Jeg er takknemlig til Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) og Brian Haarer (SUNY Upstate) for nyttige kommentarer til denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (GM133485).

1. Vasking av dekslene
MERK: Vask (24 mm x 60 mm, #1,5) deksler i henhold til Smith et al., 201328.
<ol><li>Ordne deksler i en skyvebeholder i plast.</li>
	<li>Senk dekslene sekvensielt i følgende løsninger og soniker i 30-60 min, skylling med ddH2O 10 ganger mellom hver løsning: ddH2O med en dråpe oppvasksåpe; 0,1 M KOH. Oppbevar coverlips i 100% etanol i opptil 6 måneder. MERK: Ikke berør glassoverflater med ukjærlige fingre. Bruk tang i stedet.</li>
</ol>2. Beleggrengjort (24 mm x 60 mm, #1,5) deksler med mPEG- og biotin-PEG-silan
MERK: Denne protokollen bruker spesifikt et biotin-streptavidin-system for å plassere aktin- og mikrotubuler i TIRF-bildeplanet. Andre belegg og systemer kan brukes (f.eks. antistoffer, poly-L-lysin, NEM myosin, etc.).
<ol><li>Tine aliquots av PEG-silan og biotin-PEG-sitanpulver.</li>
	<li>Løs opp PEG pulver i 80% etanol (pH 2.0) for å generere belegg lagerløsninger på 10 mg / ml mPEG-silan og 2-4 mg / ml biotin-PEG-silan, like før bruk. MERK: PEG-pulver vises ofte oppløst, men er kanskje ikke på mikroskopisk nivå. Riktig resuspension tar ~ 1-2 min med konstant pipettering. Brukere oppfordres til å pipette ytterligere 10 ganger etter utseendet av pulveroppløsning. FORSIKTIG: Bruk hansker for å beskytte huden mot konsentrert HCl når du lager 80 % etanol (pH 2.0).</li>
	<li>Fjern det rene (24 mm x 60 mm, #1,5) dekslet fra etanollagring ved hjelp av tang. Tørk med nitrogengass og oppbevar i en ren Petri-tallerken.</li>
	<li>Frakkdeksler med 100 μL beleggløsning: en blanding av 2 mg/ml mPEG-silan (MW 2000) og 0,04 mg/ml biotin-PEG-silan (MW 3400) i 80% etanol (pH 2,0). MERK: For sparsomt belegg (anbefales) bruk 2 mg/ml mPEG-silan og 0,04 mg/ml biotin-PEG-silan. For tett belegg bruk 2 mg / ml mPEG-silan, 4 mg / ml biotin-PEG-silan.</li>
	<li>Inkuber deksler ved 70 °C i minst 18 timer eller til bruk. MERK: Belagte deksler forringes hvis de oppbevares ved 70 °C i mer enn 2 uker.</li>
</ol>3. Montering av bildestrømningskamre
<ol><li>Klipp 12 strimler med dobbeltsidig dobbeltsidig tape til en lengde på 24 mm. Fjern den ene siden av båndunderlaget og fest tapestykkene ved siden av de seks sporene som er til stede på et rent bildekammer. MERK: Tape må være flatt for riktig montering, ellers vil bildekamrene lekke. Fjern tapeunderlaget forsiktig for å unngå støt. Det anbefales å skyve teipede kamre på en ren overflate for å glatte båndkammerkontakter.</li>
	<li>Fjern det andre stykke tapeunderlag for å eksponere den klissete siden av båndet langs hvert kammerspor. Plasser kammerbåndsiden opp på et rent underlag.</li>
	<li>Bland epoksyharpiks og herderløsninger 1:1 (eller i henhold til produsentens instruksjoner) i en liten veiebåt.</li>
	<li>Bruk en P1000-spiss til å plassere en dråpe blandet epoksy mellom båndstrimlene på slutten av hvert bildekammerspor (rød pil; Figur 1A). Plasser kammerbånd/epoksyside opp på et rent underlag.</li>
	<li>Fjern en belagt deksleslip fra 70 °C inkubator. Skyll belagte og ubestrøket overflater av deksler med ddH2O seks ganger, tørk med filtrert nitrogengass, og fest deretter til bildekammeret med dekslene mot båndet.</li>
	<li>Bruk en P200- eller P1000 pipettespiss for å legge trykk på tapeglassgrensesnittet for å sikre en god forsegling mellom båndet og dekslene. MERK: Med riktig tetning blir dobbeltsidig tape gjennomskinnelig. Bildekamre som mangler tilstrekkelige båndkammerkontakter, vil lekke.</li>
	<li>Inkuber monterte kamre ved romtemperatur i minst 5-10 min for å la epoksyet forsegle kammerbrønnene helt før bruk. Perfusjonskamrene utløper innen 12-18 timer etter montering. MERK: Avhengig av tapeplassering og tykkelsen på dobbeltsidig tape som brukes, vil det monterte kammeret ha et sluttvolum på 20-50 μL.</li>
</ol>4. Kondisjonering av perfusjonskamre
<ol><li>Bruk en perfusjonspumpe (hastighet satt til 500 μL/min) for sekvensielt utveksling av kondisjoneringsløsninger i perfusjonskammeret som følger:<ol>
<li>Strømning 50 μL av 1% BSA for å prime bildekammeret. Fjern overflødig buffer fra Luer låsemonteringsbeholder.</li>
		<li>Strømning 50 μL 0,005 mg/ml streptavidin. Inkuber i 1-2 min ved romtemperatur. Fjern overflødig buffer fra reservoaret.</li>
		<li>Strømning 50 μL av 1% BSA for å blokkere ikke-spesifikk binding. Inkuber i 10-30 s. Fjern overflødig buffer fra reservoaret.</li>
		<li>Strømning 50 μL varm (37 °C) 1x TIRF-buffer (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glukose, 0,25 % (v/v) metylcellulose (4000 cp)). MERK: Ikke fjern overflødig buffer fra reservoaret. Dette forhindrer at kammeret tørker ut, noe som kan introdusere luftbobler i systemet.</li>
		<li>Valgfritt: Strømning 50 μL stabilisert29 og 50% biotinylerte mikrotubulfrø fortynnet i 1x TIRF buffer. MERK: Riktig fortynning må bestemmes empirisk og inneholde batch til batch variabilitet. Protokoller fra 27,29 anbefales som utgangspunkt. En fortynning som gir 10-30 frø per synsfelt fungerer bra med dette oppsettet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Mikroskop forberedelse
MERK: Biokjemiske reaksjoner som inneholder dynamiske aktinfilamenter og mikrotubuler visualiseres/utføres ved hjelp av et invertert TIRF-mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence) utstyrt med 120-150 mW solid-state lasere, en temperaturkorrigert 63x oljeinnlevelse TIRF-mål og et EMCCD-kamera. Proteiner i dette eksemplet visualiseres ved følgende bølgelengder: 488 nm (mikrotubuler) og 647 nm (aktin).
<ol><li>Still inn scenen/objektiv varmeapparatet for å opprettholde 35-37 °C minst 30 minutter før du ser for deg den første biokjemiske reaksjonen.</li>
	<li>Angi bildeanskaffelsesparameterne på følgende måte:<ol>
<li>Sett anskaffelsesintervallet til hver 5 s i 15-20 min.</li>
		<li>Sett 488 og 647 lasereksponeringer til 50-100 ms ved 5% -10% strøm. Angi passende TIRF-vinkel for mikroskop. MERK: Uavhengig av mikroskopoppsett er den enkleste måten å stille inn lasereffekt, eksponering og TIRF-vinkel, å gjøre justeringer på bilder av en av polymerene alene (se 5.2.2.1 og 5.2.2.2 nedenfor). Brukere oppfordres på det sterkeste til å bruke de laveste innstillingene for laserstrøm og eksponering som fortsatt tillater deteksjon.<ol>
<li>Juster polymerisasjonsreaksjonen (figur 1C) for å starte aktinfilamentmontering og skaffe bilder ved 647 nm. Foreta passende justeringer.</li>
			<li>Juster polymerisasjonsreaksjonen i en annen betinget perfusjonsbrønn for å starte mikrotubulmontering (figur 1C) og visualiser ved 488 nm. Foreta passende justeringer.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Fremstilling av proteinreaksjonsblandinger
<ol><li>Forbered lagerløsning av fluorescerende merket tubulin.<ol>
<li>Bestem konsentrasjonen av hjemmelaget umerket tubulin via spektrofotometri ved Abs280, som følger:<ol>
<li>Blankt spektrofotometer med 1xBRB80 mangler GTP.</li>
			<li>Beregn konsentrasjonen av tubulin ved hjelp av den bestemte utryddelseskoeffisienten på 115 000 M-1 cm-1 og følgende formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq01.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Resuspend kommersielt laget lyofilisert lysin-merket 488-tubulin til 10 μM (1 mg / ml; 100% etikett) med 20 μL av 1x BRB80 mangler GTP.</li>
		<li>Tine en 7,2 μL aliquot på 100 μM umerket resirkulert tubulin29 på is. MERK: Resirkulert tubulin er avgjørende for vellykket mikrotubul montering in vitro fordi den fjerner polymerisasjon-inkompetente dimorer dannet i frosne proteinlagre29,30.</li>
		<li>Kombiner 3 μL μM 488-tubulin med 7,2 μL aliquot på 100 μM umerket tubulin, ikke mer enn 15 minutter før bruk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered lagerløsningen av fluorescerende merket aktin.<ol>
<li>For hjemmelagde proteiner, bestem konsentrasjonen og prosentetiketten av aktin via spektrofotometri Abs290 og Abs650, som følger:<ol>
<li>Tomt spektrofotometer med G-buffer.</li>
			<li>Beregn konsentrasjonen av umerket aktin ved hjelp av den bestemte utryddelseskoeffisienten på 25 974 M-1 cm-1 og følgende formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
			<li>Beregn konsentrasjonen av lysin merket Alexa-647-aktin ved hjelp av utryddelseskoeffisienten til umerket aktin, fluorkorreksjonsfaktoren på 0,03 og følgende formel: [Alexa-647 aktin], μM = (Abs290 - <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq03.jpg" style="opacity: 0.9; margin: auto;">
</li>
			<li>Beregn prosentetiketten til Alexa-647-aktin ved hjelp av den bestemte ε for Alexa-647 på 239 000 M-1 cm-1, som følger: % etikett på Alexa-647-aktin = (Abs290 - (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq04.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tine en 2 μL aliquot på 3 μM 100% merket biotin-aktin (merket på lysinrester). Fortynn 10 ganger ved å tilsette 18 μL G-buffer.</li>
		<li>Kombiner 3 μL fortynnet biotinylert aktin, passende volumer av umerket og merket aktin (over) slik at den endelige blandingen vil være 12,5 μM total aktin med 10% -30% fluorescerende etikett. MERK: Mer enn 30% prosent fluorescerende aktinmonomerer (endelig) kan kompromittere bildeoppløsningen ettersom filamenter blir vanskelige å skjelne fra bakgrunnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargjør reaksjonsblandinger (figur 1C).<ol>
<li>Forbered cytoskjelettblanding (rør A) ved å kombinere 2 μL av 12,5 μM aktinblandingslageret (6,2,3) med tubulinlagerblandingen (6,1,4), ikke mer enn 15 minutter før avbildning. Oppbevars på is til bruk.</li>
		<li>Forbered proteinreaksjonsblanding (tube B) ved å kombinere alle andre eksperimentelle komponenter og proteiner, inkludert: 2x TIRF-buffer, antiblekemiddel, nukleotider, buffere og tilbehørsproteiner. Et eksempel vises i figur 1C. MERK: Den endelige fortynning resulterer i en 1x TIRF buffer som inneholder ATP, GTP og ionisk styrke innenfor det estimerte fysiologiske området.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkuber rør A og rør B separat ved 37 °C i 30–60 s. For å starte reaksjon, bland og legg innholdet i rør B til rør A (nedenfor).</li>
</ol>7. Bilde aktin og mikrotubule dynamikk
<ol><li>Kondisjonsperfusjonsbrønn (figur 1B; trinn 4 ovenfor).</li>
	<li>Start aktin- og mikrotubulmontering samtidig ved å legge til innholdet i rør B (reaksjonsblanding) i rør A (cytoskjelettblanding) (figur 1C).</li>
	<li>Strømning 50 μL reaksjon som inneholder 1x TIRF-buffer supplert med 15 μM fri tubulin, 1 mM GTP og 0,5 μM aktinmonomerer og passende volumer av bufferkontroller.</li>
	<li>Ta opp tidsforløpfilm ved hjelp av mikroskopprogramvare for å skaffe hver 5 s i 15-20 min. MERK: Initiering av aktin- og mikrotubuldynamikk skjer innen 2-5 min (figur 2). Lengre forsinkelser indikerer problemer med temperaturkontroll eller konsentrasjonsrelaterte problemer med proteiner i reaksjonsblandingen.</li>
	<li>Kondisjoner en ny perfusjonsbrønn (trinn 4) og erstatt buffervolumet med regulatoriske proteiner av interesse (dvs. tau) og bufferkontroller (figur 1C). Anskaffe som skissert i trinn 7 (ovenfor) for å vurdere regulatoriske proteiner for nye aktinmikrotubulfunksjoner.</li>
</ol>8. Behandle og analysere bilder ved hjelp av FIJI-programvare31
<ol><li>Åpne lagrede TIRF-filmer og vis som en sammensetning.</li>
	<li>Analyser mikrotubuldynamikk (figur 3A), som følger:<ol>
<li>Generer en tidsbasert maksimal Z-projeksjon fra bildestakkmenyen.</li>
		<li>Synkroniser Z-projeksjonsvinduet med den opprinnelige TIRF-filmen fra menyen Analyser> verktøy> Synkroniser Windows .</li>
		<li>Tegn en linje ved hjelp av det lineære verktøyet langs en mikrotubule av interesse for det beregnede bildet.<ol>
<li>Åpne interesseområdet (ROI) fra analysemenyen (Analyser> Verktøy> ROI Manager).</li>
			<li>Lagre individuelle mikrotubule steder ved å trykke på "t". Gjenta for alle mikrotubuler av interesse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plott kymografier av utvalgte linjer ved hjelp av "/" eller kjør multi-kymo makroen som genererer en video og kymografi for hver mikrotubule i ROI manager31.<ol>
<li>Legg til skalastolper med både lengde (μm) og tid (min) i kymografier fra menyen Analyser> verktøy> skalalinjer .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mål mikrotubule veksthastigheter fra kymografbakker (figur 3A, 1-2; helling av svarte linjer).</li>
		<li>Tell dynamiske mikrotubulhendelser (katastrofe eller gjenvekst) fra den genererte kymografen eller bruk av tilgjengelige analysemakroer 5,8,18,25. Røde stiplede linjer i figur 3A, 1-2 representerer katastrofe / raske demonteringshendelser.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser aktindynamikk (figur 3B), som følger:<ol>
<li>Mål aktinkjernedannelse, som følger:<ol>
<li>Tell antall aktinfilamenter som er tilstede innen synsfeltet 100 s etter initiering av reaksjonen og uttrykk av området (filamenter per μm2).</li>
			<li>Registrer og lagre data i ROI Manager, som i trinn 8.2.3.1 ovenfor.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mål aktinfilamentforlengelseshastigheter (figur 3B), som følger:<ol>
<li>Tegn en linje langs en aktinfilament av interesse ved hjelp av det segmenterte linjeverktøyet.</li>
			<li>Legg til linje i ROI manager som i trinn 8.2.3.1 ovenfor.</li>
			<li>Gjenta etter linjen (legge til hvert mål i ROI manager) for minst fire filmrammer. MERK: Måling av syv til åtte påfølgende rammer anbefales, men noen forhold langsom aktinpolymerisering under den påvisbare grensen som kan løses ved objektive / mikroskopoppsett. I et slikt tilfelle kan målinger gjøres med jevne mellomrom over ikke-etterfølgende rammer (f.eks. hver femte ramme).</li>
			<li>Tegn målte lengdeverdier over brukt tid. Hellingen av den genererte linjen er aktinforlengelseshastigheten i mikroner / s.</li>
			<li>Formidle endelige beregnede satser som underenheter s-1 μM-1 ved hjelp av en korreksjonsfaktor på 370 underenheter for å gjøre rede for antall aktinmonomerer i et mikron filament32.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Utføre korrelasjonsanalyser for områder med parallell aktin-mikrotubule-tilknytning (figur 3C), som følger:<ol>
<li>Tegn en linje langs en mikrotubul av interesse på et bestemt tidspunkt (dvs. 300 s etter reaksjonsstart), ved hjelp av det lineære verktøyet.<ol>
<li>Legg til linje i ROI manager som i trinn 8.2.3.1 ovenfor.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plott fluorescensintensiteten langs linjen i hver kanal.<ol>
<li>Velg hver kanal med bildeglidebryteren og tegn inn intensitetene langs linjen ved hjelp av "kommando k".</li>
			<li>Lagre eller eksporter verdier ved å klikke på "liste" -knappen i utdatavinduet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uttrykke aktin-mikrotubule koblingshendelser som et forhold (aktin overlapping med mikrotubuler) fra individuelle hendelser eller som antall hendelser i et gitt synsfelt på et konsekvent tidspunkt (figur 3C).</li>
		<li>Alternativ: Bruk programvare for å bestemme prosentoverlappingen av begge kanalene 5,12.</li>
	</ol></li>
</ol>

Det er ingen interessekonflikter å avsløre.

Bruken av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi til visualiserte rensede proteiner har vært en fruktbar og overbevisende tilnærming for å dissekere unike mekanismer for cytoskeletal regulering 5,23,24,25,26,27,35. Sammenlignet med tradisjonelle biokjemiske analyser krever TIRF-reaksjoner svært små volumer (50-100 μL), og kvantitative målinger av cytoskeletal dynamikk kan hentes fra en individuell analyse. De fleste studier av cytoskeletal dynamikk fokuserer på et enkelt polymersystem (dvs. aktinfilamenter eller mikrotubuler), og dermed har detaljerte målinger av krysstale eller fremvoksende atferd mellom aktinfilamenter og mikrotubuler som vanligvis ses i celler, forblitt unnvikende og vanskelig å rekapitulere i reagensrøret. For å løse dette problemet beskriver denne protokollen et enkeltfilament TIRF mikroskopisystem som muliggjør direkte visualisering av dynamisk aktin- og mikrotubulpolymerer i samme biokjemiske reaksjon. Dermed går denne metoden utover tradisjonelle analyser som rekapitulerer den dynamiske oppførselen til aktinfilamenter eller mikrotubuler alene. Denne teknikken ble også utført med Tau som et eksempel på hvordan flere dynamiske egenskaper endres i nærvær av en cytoskjelettkoblingsfaktor. Denne protokollen kan brukes med ekstra proteiner kjent eller mistenkt for å koordinere aktin- eller mikrotubuldynamikk, inkludert (men ikke begrenset til) MACF, GAS, formins og mer. Til slutt kan gitte eksempelanalyser brukes som en veiledning for å kvantifisere data som er samlet inn med denne protokollen.
"Seeing is believeing" er en overbevisende grunn til å utføre mikroskopibaserte analyser. Det kreves imidlertid forsiktighet ved utførelse og tolkning av TIRF mikroskopiforsøk. En stor utfordring med cytoskeletal co-assembly analyser er at mange ofte brukte bildeforhold ikke er kompatible hver polymer. Mikrotubuler og aktin har vanligvis forskjellige krav til buffer, temperatur, salt, nukleotid og konsentrasjon for polymerisering. Aktin, tubulin, regulatoriske proteiner av interesse, og bufferne som brukes i denne protokollen er følsomme for fryse-tine sykluser. Derfor er forsiktig håndtering av proteiner og buffere nødvendig for å kunne utføre denne protokollen. For å lindre mange av disse bekymringene anbefales det på det sterkeste å bruke nykokt tubulin (frosset i <6 uker) og forhåndsklarere frosne/resuspenderte aktiner via ultracentrifugation. Disse hensynene gjelder også for mylderet av regulatoriske proteiner som skal vurderes med denne prosedyren, som kan være følsomme for fryse-tine sykluser eller konsentrasjonen av buffersalter 5,11,36.
Dessverre finnes det ingen buffer som passer til alle størrelser uten eksperimentelle avveininger. For å passende mer volum for proteiner med lavere konsentrasjon, kan ATP og GTP inkluderes i 2x TIRF-bufferløsningen (figur 1C). Men fordi disse nukleotidene er ekstremt følsomme for fryse-tine sykluser, anbefales det ikke. Oksygenfangstforbindelsene som brukes her (dvs. katalase og glukoseoksidase) er nødvendige for å visualisere proteiner i lange perioder (minutter til timer), men er kjent for å begrense mikrotubul polymerisering ved høye konsentrasjoner5. Relatert til disse bufferhensynene er en begrensning i denne protokollen at noen kanoniske mikrotubule-assosierte regulatoriske proteiner kan kreve mer eller mindre salt for å rekapitulere funksjoner som finnes i celler eller analyser ved hjelp av mikrotubuler alene (uten aktin). Endring av saltets natur eller konsentrasjon for å løse disse bekymringene vil sannsynligvis påvirke frekvensen av aktinfilamentpolymerisering og / eller parametere for mikrotubuldynamikk. Målinger av flere beskrivende parametere (minimalt, kjernedannelse, forlengelseshastigheter og stabilitet) (figur 3) kreves for å bekrefte protokollsuksess eller eksplisitt dokumentere effekten av spesifikke buffere eller regulatoriske proteiner. For eksempel kan for mye aktinfilamentpolymerisering skjule aktin-mikrotubule koblingshendelser i løpet av sekunder. Følgelig vil finjustering av eksperimentelle forhold ved å senke den totale konsentrasjonen av aktin eller inkludert ekstra proteiner for å undertrykke aktinkjernedannelse (dvs. profilin) forlenge den totale perioden som koordinerte aktin-mikrotubule aktiviteter kan sees tydelig. Kontroller som adresserer disse forutsetningene, og tekniske replikeringer (utover flere synsfelt), er avgjørende for at brukerne skal kunne generere pålitelige og reproduserbare resultater.
Cellebaserte studier gir begrenset mulighet til å observere direkte proteinproteinrelasjoner eller virkningen av regulatoriske komplekser. I motsetning gjenspeiler noen av mekanismene som kommer fra in vitro-analyser ikke alltid den nøyaktige oppførselen til proteiner sett i celler. Dette klassiske biokjemiske dilemmaet kan løses i fremtidige anvendelser av denne teknikken med spesifikke modifikasjoner. For eksempel utvider tilsetning av funksjonelle fluorescerende merkede koblingsproteiner denne metoden fra enkeltfilamentstudier til enkeltmolekylstudier. Analyser kan endres ytterligere for å bruke celleekstrakter som kan legge til de "manglende" ukjente nøkkelfaktorene som kreves for å rekapitulere cellelignende fenomener. For eksempel har TIRF-baserte analyser som bruker gjær eller Xenopus-ekstrakter rekonstituert kontraktil actomyosin ringer37, mitatiske spindler26,38, komponenter av aktin- eller mikrotubulemontering39,40, og til og med dynamikk ved sentrosom- og kinetochores 36,41,42,43 . Videre kan slike systemer bane vei mot kunstige cellesystemer som har lipider eller signalfaktorer til stede 44,45,46.

Historisk sett har aktin- og mikrotubuler blitt sett på som separate enheter, hver med sitt eget sett med regulatoriske proteiner, dynamikkatferd og distinkte cellulære steder. Rikelig bevis viser nå at aktin- og mikrotubulpolymerer engasjerer seg i funksjonelle krysstalemekanismer som er avgjørende for å utføre mange celleprosesser, inkludert migrasjon, mitotisk spindelposisjonering, intracellulær transport og cellemorfologi 1,2,3,4. De forskjellige koordinerte atferdene som ligger til grunn for disse eksemplene, er avhengige av en intrikat balanse mellom koblingsfaktorer, signaler og fysiske egenskaper. Imidlertid er de molekylære detaljene som underbygger disse mekanismene fortsatt stort sett ukjente fordi de fleste studier fokuserer på en enkelt cytoskeletal polymer om gangen 1,2,5.
Aktin- og mikrotubuler samhandler ikke direkte 6,7,8. Den koordinerte dynamikken i aktin og mikrotubuler sett i celler formidles av flere faktorer. Mange proteiner som antas å regulere aktin-mikrotubul krysstale har blitt identifisert og deres aktiviteter er godt preget med hensyn til enten cytoskeletal polymer alene 1,2. Voksende bevis tyder på at denne enkeltpolymertilnærmingen har skjult de doble funksjonene til noen av proteinene / kompleksene som muliggjør aktinmikrotubulkoblingshendelser 7,8,9,10,11,12,13. Eksperimenter der begge polymerene er til stede er sjeldne og definerer ofte mekanismer med en enkelt dynamisk polymer og statisk stabilisert versjon av de andre 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Dermed er det nødvendig med metoder for å undersøke de fremvoksende egenskapene til aktin-mikrotubule koordinerende proteiner som bare kan forstås fullt ut i eksperimentelle systemer som bruker begge dynamiske polymerer.
Kombinasjonen av direkte proteinmerkingsmetoder, genetisk kodede affinitetskoder og total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi har blitt brukt med stor suksess i biomimetiske rekonstitueringssystemer 19,20,21,22,23. Mange nedenfra-og-opp-ordninger inneholder ikke alle faktorene som regulerer proteiner i celler. Imidlertid har "biokjemi på et coverglass" -teknologi raffinert mange mekanismer for aktin- og mikrotubuldynamikk ved høye romlige og tidsmessige skalaer, inkludert komponentene som kreves for polymermontering eller demontering, og motorproteinbevegelse 5,12,23,24,25,26,27 . Her beskrives en minimal komponentfilamenttilnærming for å undersøke aktinmikrotubulkobling in vitro. Denne protokollen kan brukes med kommersielt tilgjengelige eller svært rene rensede proteiner, fluorescerende merkede proteiner, perfusjonskamre og utvidet til mer kompliserte ordninger som inneholder celleekstrakter eller syntetiske systemer. Her brukes kommersielt tilgjengelig Tau-protein for å demonstrere hvordan cytoskeletal dynamikk endres i nærvær av et aktin-mikrotubule koblingsprotein, men kan erstattes med andre putative aktin-mikrotubule koordinerende faktorer. Den største fordelen med dette systemet over andre tilnærminger er evnen til samtidig å overvåke dynamikken i flere cytoskeletale polymerer i en reaksjon. Denne protokollen gir også brukerne eksempler og enkle verktøy for å kvantifisere endringer i cytoskeletale polymerer. Dermed vil protokollbrukere produsere pålitelige, kvantitative, enkeltfilamentoppløsningsdata for å beskrive mekanismer som ligger til grunn for hvordan forskjellige regulatoriske proteiner koordinerer aktin-mikrotubuledynamikk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Tradisjonelt har aktin og mikrotubule cytoskeletoner blitt studert som separate enheter, begrenset til spesifikke cellulære regioner eller prosesser, og regulert av forskjellige suiter med bindende proteiner som er unike for hver polymer. Mange studier viser nå at dynamikken i begge cytoskeletale polymerer er sammenflettet og at denne krysstale er nødvendig for de fleste cellulære atferd. En rekke proteiner involvert i aktin-mikrotubule interaksjoner er allerede identifisert (dvs. Tau, MACF, GASS, formins og mer) og er godt preget med hensyn til enten aktin eller mikrotubuler alene. Imidlertid viste relativt få studier analyser av aktin-mikrotubul koordinering med dynamiske versjoner av begge polymerer. Dette kan okkludere fremvoksende koblingsmekanismer mellom aktin- og mikrotubuler. Her tillater en total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopibasert in vitro rekonstitueringsteknikk visualisering av både aktin- og mikrotubuldynamikk fra den biokjemiske reaksjonen. Denne teknikken bevarer polymerisasjonsdynamikken til enten aktinfilament eller mikrotubuler individuelt eller i nærvær av den andre polymeren. Kommersielt tilgjengelig Tau protein brukes til å demonstrere hvordan aktin-mikrotubul atferd endres i nærvær av en klassisk cytoskeletal crosslinking protein. Denne metoden kan gi pålitelig funksjonell og mekanistisk innsikt i hvordan individuelle regulatoriske proteiner koordinerer aktinmikrotubuldynamikk ved en oppløsning av enkeltfilamenter eller komplekser med høyere rekkefølge.

Med betingelsene beskrevet ovenfor (figur 1) skal aktin- og mikrotubulpolymerer være synlige (og dynamiske) innen 2 min etter bildeanskaffelse (figur 2). Som med alle biokjemibaserte protokoller, kan optimalisering være nødvendig for forskjellige regulatoriske proteiner eller partier med protein. Av disse grunnene settes TIRF-vinkelen og bildeeksponeringene først med reaksjoner som inneholder hver enkelt polymer. Dette bekrefter at lagrede proteiner er funksjonelle og nok merket protein er til stede for deteksjon. Selv om det ikke alltid er nødvendig (og ikke utført her), kan etterbehandling av filmer (dvs. bakgrunnsdelsnitt, gjennomsnitt eller Fourier-transformasjoner) brukes til å forbedre bildekontrasten (spesielt mikrotubuler)5,25,33. Den direkte visualiseringen av enkeltgangsfilamenter og mikrotubuler gitt av denne analysen støtter kvantitativ bestemmelse av flere dynamiske tiltak for enten cytoskjelettkomponent alene eller sammen, inkludert polymerisasjonsparametere (dvs. kjernedannelse eller forlengelseshastighet), demonteringsparametere (dvs. krympehastigheter eller katastrofehendelser) og polymerkulljustering /overlapping (figur 3 ). Videre kan disse tiltakene brukes som utgangspunkt for å dechiffrere bindingen eller påvirkningen av regulatoriske ligander som Tau (figur 3). Mange målinger av enkelt aktinfilamenter eller mikrotubuler kan gjøres fra en TIRF-film. På grunn av variasjoner i coverlipbelegg, pipettering og andre faktorer, bør imidlertid pålitelige målinger også omfatte flere tekniske replikeringsreaksjoner / filmer.
Mange fasetter av mikrotubuldynamikk kan bestemmes fra eksempel kymografier, inkludert hastigheten på mikrotubul forlengelse, samt frekvensen av katastrofe- og redningshendelser (figur 3A). Å bruke kymografer for å måle aktindynamikk i dette systemet er ikke så enkelt fordi aktinfilamenter er mer innviklet enn mikrotubuler. Som en konsekvens måles parametere av aktinfilamentdynamikk for hånd, noe som er tidkrevende og arbeidskrevende. Kjernetall måles som antall aktinfilamenter som er tilstede på et konsistent tidspunkt for alle forhold. Disse tellingene varierer mye på tvers av TIRF-bildefelt, men kan brukes med mange repliker eller for å supplere observasjoner fra andre polymerisasjonsanalyser. Nukleasjonstall kan også brukes til mikrotubuler dersom forsøksforholdene mangler stabiliserte mikrotubulfrø. Aktin filament forlengelseshastigheter måles som lengden på filament over tid fra minst fire filmrammer. Hastighetsverdier formidles per mikromolar aktin med en korreksjonsfaktor på 370 underenheter for å ta hensyn til antall aktinmonomerer i et mikron filament (figur 3B)32. Målinger for å definere koordinert atferd mellom aktin- og mikrotubuler er mindre veldefinerte. Det er imidlertid brukt korrelative analyser for å måle tilfeldighetene til begge polymerene, inkludert linjeskanninger (figur 3C) eller overlappingsprogramvare 5,11,34.
Datatilgjengelighet: Alle datasett knyttet til dette arbeidet er deponert i Zenodo og er tilgjengelige med rimelig forespørsel på: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> Figur 1. Eksperimentelle skjemaer: strømningskammermontering til bildeanskaffelse. (A) Montering av bildekammer. Fra topp til bunn: IBIDI-bildekamre teipes langs perfusjonsbrønner (betegnet med pil); Det andre (hvite) laget av båndunderlag (venstre på i bildet som vises for å orientere brukerne bedre) fjernes og Epoxy påføres på kanten av perfusjonskammeret (pilen). Merk: For å lettere orientere brukere hvor de skulle plassere epoksyen, ble den hvite underlaget igjen i dette bildet. Den rengjorte og belagte dekslen er festet til bildekammeret med beleggsiden vendt mot innsiden av perfusjonsbrønnen. (B) Flytskjema som illustrerer trinnene for kondisjonering av bildekamre for biotin-streptavidin-koblinger. (C) Eksempler på reaksjoner som brukes til å skaffe TIRF-filmer av dynamiske mikrotubuler og aktinfilamenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> Figur 2. Bildesekvenser av voksende aktinfilamenter og mikrotubuler i fravær eller tilstedeværelse av Tau. Tidsforløp bildemontasje fra TIRF-analyser som inneholder 0,5 μM aktin (10% Alexa-647-aktin og 0,09% biotin-aktin merket) og 15 μM fri tubulin (4% HiLyte-488 merket) i fravær (A) eller tilstedeværelse (B) på 250 nM Tau. Tid som går fra reaksjonsstart (blanding av rør A og rør B) vises. Skalastenger, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> Figur 3. Eksempelmålinger av mikrotubuler og aktinfilamentdynamikk. (A) Gjennomsnittlig tidsprojeksjon av tubulinkanalen visualiserer effektivt totale mikrotubullengder for linjeskanningene som brukes til å generere kymografiplott. Svarte stiplede linjer tilsvarer de to eksempel kymoografiene til dynamiske mikrotubuler vist til høyre. Veksten (faste svarte linjer) og demonteringsfaser (prikkede rosa linjer, to betegnet med rosa piler) av mikrotubuler vises på hver kymograf. Tidsskala bar, 3 min. Lengde skala bar, 10 μm. Reaksjonen inneholder 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) og 15 μM fri tubulin (4% 488-HiLyte etikett). Bare tubulinkanalen vises. (B) To eksempel tidsforløp bilde montasjer som viser single-actin filaments aktivt polymeriserende. Forlengelseshastigheter beregnes som skråningen av tomter av lengden på aktinfilamenter over tid per mikromolar actin. Dermed må en korreksjonsfaktor på to påføres 0,5 μM aktinreaksjoner for sammenligning for priser som vanligvis bestemmes ved 1 μM aktinkonsentrasjon. Eksempler fra fem filamenter vises til høyre. Skalastenger, 10 μm. Reaksjonen inneholder 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) og 15 μM fri tubulin (4% 488-HiLyte etikett). Bare aktinkanalen vises. (C) TIRF-bilder av dynamiske mikrotubuler (MT) (grønn) og aktinfilamenter (lilla) polymerisering i fravær (venstre) eller tilstedeværelse av 250 nM Tau (midten). Blå prikkede linjer og piler markerer hvor en linje ble tegnet for linjeskanningstegningene som tilsvarer hver betingelse (under hvert bilde). Overlapping mellom mikrotubuler og aktinregioner (vist som svart) kan skåres på et angitt tidspunkt per område (høyre). Skalastenger, 25 μm. Reaksjonene inneholder 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) og 15 μM fri tubulin (4% 488-HiLyte etikett) med eller uten 250 nM Tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Denne protokollen er en veiledning for visualisering av dynamisk aktin og mikrotubuler ved hjelp av en in vitro total intern fluorescens (TIRF) mikroskopianalyse.

Visualisere Actin og Microtubule Koblingsdynamikk In Vitro av Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Til tross for mange eksempler på koordinering, undersøker de fleste studier aktin- eller mikrotubulproteinene individuelt. Denne metoden tillater visualisering av begge dynamiske polymerer i en enkelt reaksjon. Denne teknikken lar brukeren vurdere forskjellige regulatoriske proteiner for nye egenskaper som bare kunne ses med dynamiske versjoner av aktin og mikrotubuler.Denne teknikken kan utvides til å omfatte lipider eller ekstrakter for å komme nærmere å bygge en syntetisk celle. Begynn med å tine aliquots av PEG-Silane og Biotin-PEG-Silane pulver, og oppløse PEG pulver i 80% etanol for å generere belegg lagerløsninger på 10 milligram per milliliter mPEG-Silane og to til fire milligram per milliliter Biotin-PEG-Silane. Fjern det rene dekselsklien fra etanollagring ved hjelp av tang.Tørk med nitrogengass og oppbevar i en ren Petri-tallerken. Belegge dekselet glir med 100 mikroliter beleggløsning og inkuber dem ved 70 grader Celsius i minst 18 timer eller til bruk. Klipp 12 strimler med dobbeltsidig dobbeltsidig tape til en lengde på 24 millimeter.Fjern den ene siden av båndunderlaget og fest tapestykkene ved siden av de seks sporene som er til stede på et rent bildekammer. Fjern det andre stykke tapeunderlag for å eksponere den klissete siden av båndet langs hvert kammerspor, og plasser kammerbåndsiden opp på en ren overflate. Bland epoksyharpiks og herderløsninger en-til-en i en liten veiebåt, og bruk en P1000-spiss for å plassere en dråpe blandet epoksy mellom båndstrimlene på slutten av hvert bildekammerspor.Plasser deretter kammer, tape eller epoksyside opp, på en ren overflate. Fjern en belagt dekselslipp fra 70 grader Celsius inkubator og skyll de belagte og ubestrøket overflatene på dekselet med dobbelt destillert vann seks ganger. Tørk med filtrert nitrogengass og fest deretter til bildekammeret med dekselsklibeleggsiden mot båndet.Bruk en P200- eller P1000 pipettespiss for å legge trykk på det teipede glassgrensesnittet for å sikre en god forsegling mellom båndet og dekselslippet. Inkuber de monterte kamrene ved romtemperatur i minst fem til 10 minutter slik at epoksyet kan forsegle kammerbrønnene helt før bruk. Perfusjonskamrene utløper innen 12 til 18 timer etter montering.Bruk en perfusjonspumpe og bytt kondisjoneringsløsninger sekvensielt i perfusjonskammeret ved å strømme 50 mikroliter med 1% BSA for å prime bildekammeret. Fjern overflødig buffer fra lokkelåsmonteringsbeholderen. Deretter strømmer 50 mikroliter på 0,005 milligram per milliliter streptavidin og inkuberer i ett til to minutter ved romtemperatur.Fjern overflødig buffer fra reservoaret. Strømning 50 mikroliter av 1%BSA for å blokkere den ikke-spesifikke bindingen og inkubere i 10 til 30 sekunder. Fjern overflødig buffer fra reservoaret.Deretter strømmer 50 mikroliter varme 1x TIRF buffer og deretter 50 mikroliter stabiliserte og 50% biotinylerte mikrotubulfrø fortynnet i 1x TIRF buffer. Still inn scenen eller objektiv varmeapparatet for å opprettholde 35 til 37 grader Celsius temperatur i 30 minutter før bildebehandling av den første biokjemiske reaksjonen. Sett deretter anskaffelsesintervallet til hvert femte sekund i 15 til 20 minutter.Deretter setter du 488 og 647 lasereksponeringer til 50 til 100 millisekunder ved 5% til 10% effekt ved først å justere polymerisasjonsreaksjonen for å initiere aktinfilamentenheten. Skaff bildene på 647 nanometer og gjør passende justeringer. Juster deretter polymerisasjonsreaksjonen i en annen betinget perfusjonsbrønn for å starte mikrotubuleenheten.Visualiser med 488 nanometer og gjør passende justeringer. Kombiner tre mikroliter med 10 mikromolar 488 tubulin med 7,2 mikroliter aliquot av 100 mikromolar fluorescerende umerket tubulin ikke mer enn 15 minutter før bruk. Kombiner deretter tre mikroliter fortynnet biotinrelatert aktin i passende mengder fluorescerende umerket og merket akti, slik at den endelige blandingen vil være 12,5 mikromolar total aktin med 10% til 30% fluorescerende etikett.Forbered cytoskjelettblandingen ved å kombinere to mikroliter av 12,5 mikromolar actin mix lager med tubulin lagerblandingen ikke mer enn 15 minutter før avbildning. Oppbevars på is til bruk. Forbered proteinreaksjonsblandingen ved å kombinere alle andre eksperimentelle komponenter og proteiner, inkludert 2x TIRF-buffer, antiblekemiddel, nukleotider, buffere og tilbehørsproteiner.Inkuber cytoskjelettblandingen og proteinreaksjonen blandes separat ved 37 grader Celsius i 30 til 60 sekunder. For å starte reaksjonen, legg til innholdet i proteinreaksjonsblandingen til cytoskjelettblandingen og bland den. Strømning 50 mikroliter av reaksjonsblandingen som inneholder 1x TIRF-buffer supplert med 15 mikromolarfrie tubulin, en millimolar GTP, 0,5 mikromolar actin monomerer og passende volumer av bufferkontroller til perfusjonskammeret.Ta opp en tidsforløpfilm ved hjelp av mikroskopprogramvare for å skaffe hvert femte sekund i 15 til 20 minutter. Kondisjoner en ny perfusjonsbrønn og erstatt buffervolumet med det regulatoriske proteinet av interesse- og bufferkontroller. Anskaffe for å vurdere regulatoriske proteiner for emergent actin mikrotubule funksjoner.Eksempelmålinger av mikrotubuler og aktinfilamentdynamikk vises i disse bildene. Den gjennomsnittlige tidsprojeksjonen av tubulinkanalen visualiserer effektivt de totale mikrotubullengdene for linjeskanningene som brukes til å generere Kymograph-plottene. Svarte stiplede linjer tilsvarer de to eksempel kymoografiene til de dynamiske mikrotubulene.Vekst- og demonteringsfasene av mikrotubuler vises på hver Kymograph. To eksempler på tidsforløp bildemontasjer som viser enkelt aktinfilamenter som aktivt polymeriserer, vises her. Forlengelseshastigheter beregnes som skråningen av tomtene av lengden på aktinfilamenter over tid per mikromolar actin.Dermed må en korreksjonsfaktor på to påføres 0,5 mikromolar actin reaksjoner for å sammenligne frekvensene som vanligvis bestemmes ved den ene mikromolar actin-konsentrasjonen. Eksempler fra fem filamenter vises her. Total intern refleksjon fluorescens, eller TIRF bilder av de dynamiske mikrotubuler i aktin filamenter polymerisere i fravær eller tilstedeværelse av 250 nanomolar Tau er vist her.Blå stiplede linjer og piler merker slitasje en linje ble tegnet for linje skanning plott som tilsvarer hver betingelse. Overlapping mellom mikrotubulene i aktinområdene kan scores på et bestemt tidspunkt per område. Cytoskeletale proteiner, spesielt aktin, mikrotubuler, og deres regulatorer er svært følsomme for å fryse / tine sykluser.For konsistens og suksess, bruk svært rene og riktig lagrede proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling av proteinbinding til F-aktin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Av F-utgangen på tidlig Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vev beiset med selvlysende konjugert Oligothiophenes av hyperspektral AC Confocal mikroskopi og fluorescens levetid bildebehandling

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Høy-gjennomstrømning total intern refleksjon fluorescens og direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi bruke en fotoniske chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisere diffus dynamikk av gull nanorods på cellemembran ved hjelp av enkelt nanopartikkel Darkfield mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Avbildning av podocytiske proteiner Nephrin, Actin og Podocin med ekspansjonsmikroskopi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosinspesifikke tilpasninger av in vitro fluorescensmikroskopibaserte motilitetsanalyser

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...