Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Я благодарен Марку Ридилье (Repair Biotechnologies) и Брайану Хаареру (SUNY Upstate) за полезные комментарии по этому протоколу. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (GM133485).

Нет никаких конфликтов интересов для раскрытия.

Использование флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) для визуализации очищенных белков было плодотворным и убедительным подходом к препарированию уникальных механизмов цитоскелетной регуляции 5,23,24,25,26,27,35. По сравнению с традиционными биохимическими анализами, реакции TIRF требуют очень малых объемов (50-100 мкл), а количественные измерения динамики цитоскелета могут быть получены из отдельного анализа. Большинство исследований динамики цитоскелета сосредоточены на одной полимерной системе (т.е. актиновых нитях или микротрубочках), поэтому подробные измерения перекрестных помех или эмерджентного поведения между актиновыми нитями и микротрубочками, обычно наблюдаемые в клетках, остаются неуловимыми и их трудно повторить в пробирке. Чтобы решить эту проблему, этот протокол описывает систему микроскопии TIRF с одной нитью, которая позволяет непосредственно визуализировать динамические полимеры актина и микротрубочек в одной и той же биохимической реакции. Таким образом, этот метод выходит за рамки традиционных анализов, которые повторяют динамическое поведение только актиновых нитей или микротрубочек. Этот метод также был выполнен с тау в качестве примера того, как несколько динамических свойств изменяются в присутствии фактора связи цитоскелетов. Этот протокол может быть использован с дополнительными белками, известными или подозреваемыми для координации динамики актина или микротрубочек, включая (но не ограничиваясь) MACF, GAS, формины и многое другое. Наконец, предоставленные примеры анализа могут быть использованы в качестве руководства для количественной оценки данных, полученных с помощью этого протокола.
«Видеть — значит верить» — это веская причина для проведения анализов на основе микроскопии. Однако при проведении и интерпретации экспериментов по микроскопии TIRF требуется осторожность. Одна из основных проблем цитоскелетных анализов совместной сборки заключается в том, что многие часто используемые условия визуализации не совместимы с каждым полимером. Микротрубочки и актин обычно имеют различные требования к буферу, температуре, соли, нуклеотидам и концентрации для полимеризации. Актин, тубулин, регуляторные белки, представляющие интерес, и буферы, используемые в этом протоколе, чувствительны к циклам замораживания-оттаивания. Поэтому для успешного выполнения этого протокола необходимо тщательное обращение с белками и буферами. Чтобы облегчить многие из этих проблем, настоятельно рекомендуется использовать свежепереработанный тубулин (замороженный в течение <6 недель) и предварительную очистку замороженных / повторно суспендированных актинов с помощью ультрацентрифугирования. Эти соображения также применимы к множеству регуляторных белков, подлежащих оценке с помощью этой процедуры, которые могут быть чувствительны к циклам замораживания-оттаивания или концентрации буферных солей 5,11,36.
К сожалению, не существует универсального буфера без экспериментальных компромиссов. Для присвоения большего объема белкам более низкой концентрации АТФ и ГТФ могут быть включены в 2-кратный буферный раствор TIRF (рис. 1С). Однако, поскольку эти нуклеотиды чрезвычайно чувствительны к циклам замораживания-оттаивания, это не рекомендуется. Используемые здесь кислородопоглощающие соединения (т.е. каталаза и глюкозооксидаза) необходимы для визуализации белков в течение длительных периодов времени (от минут до часов), но, как известно, ограничивают полимеризацию микротрубочек при высоких концентрациях5. В связи с этими буферными соображениями ограничение этого протокола заключается в том, что некоторым каноническим регуляторным белкам, связанным с микротрубочками, может потребоваться больше или меньше соли для рекапитуляции функций, обнаруженных в клетках или анализах с использованием одних только микротрубочек (без актина). Изменение природы или концентрации соли для решения этих проблем, вероятно, повлияет на скорость полимеризации актиновой нити и/или параметры динамики микротрубочек. Измерения нескольких описательных параметров (минимально, нуклеации, скорости удлинения и стабильности) (рисунок 3) необходимы для подтверждения успеха протокола или для явного документирования эффектов конкретных буферов или регуляторных белков. Например, слишком большая полимеризация актиновой нити может скрыть события связи актин-микротрубочки в течение нескольких секунд. Следовательно, тонкая настройка экспериментальных условий путем снижения общей концентрации актина или включения дополнительных белков для подавления нуклеации актина (т.е. профилина) продлит общий период, в течение которого можно будет четко увидеть скоординированную активность актин-микротрубочек. Элементы управления, отвечающие этим предварительным требованиям, и технические реплики (за пределами нескольких полей зрения) имеют решающее значение для пользователей для получения надежных и воспроизводимых результатов.
Клеточные исследования дают ограниченную возможность наблюдать прямые белково-белковые отношения или действие регуляторных комплексов. Напротив, некоторые из механизмов, почерпнутых из анализов in vitro, не всегда отражают точное поведение белков, наблюдаемое в клетках. Эта классическая дилемма биохимика может быть решена в будущих применениях этого метода с конкретными модификациями. Например, добавление функциональных флуоресцентно меченых соединительных белков расширяет этот метод от исследований с одной нитью до исследований с одной молекулой. Анализы могут быть дополнительно модифицированы для использования клеточных экстрактов, которые могут добавить «отсутствующие» неизвестные ключевые факторы, необходимые для повторения клеточных явлений. Например, анализы на основе TIRF с использованием дрожжей или экстрактов xenopus имеют восстановленные сократительные актомиозиновые кольца37, митотические веретена26,38, компоненты актина или сборки микротрубочек39,40 и даже динамику у центросом и кинетохоров 36,41,42,43 . Более того, такие системы могут проложить путь к системам искусственных клеток, которые имеют липиды или сигнальные факторы, присутствующие 44,45,46.

Исторически актин и микротрубочки рассматривались как отдельные сущности, каждая со своим собственным набором регуляторных белков, динамическим поведением и различными клеточными местоположениями. Многочисленные данные в настоящее время демонстрируют, что полимеры актина и микротрубочек участвуют в функциональных механизмах перекрестных помех, которые необходимы для выполнения многочисленных клеточных процессов, включая миграцию, позиционирование митотического веретена, внутриклеточный транспорт и морфологию клеток 1,2,3,4. Разнообразное скоординированное поведение, лежащее в основе этих примеров, зависит от сложного баланса факторов связи, сигналов и физических свойств. Тем не менее, молекулярные детали, лежащие в основе этих механизмов, до сих пор в значительной степени неизвестны, потому что большинство исследований сосредоточены на одном цитоскелетном полимере за раз 1,2,5.
Актин и микротрубочки напрямую не взаимодействуют 6,7,8. Скоординированная динамика актина и микротрубочек, наблюдаемая в клетках, опосредована дополнительными факторами. Многие белки, которые, как считается, регулируют перекрестные помехи актин-микротрубочки, были идентифицированы, и их активность хорошо характеризуется в отношении только цитоскелетного полимера 1,2. Растущие данные свидетельствуют о том, что этот однополимерный подход скрыл двойные функции некоторых белков / комплексов, которые позволяют событиям связи актин-микротрубочки 7,8,9,10,11,12,13. Эксперименты, в которых присутствуют оба полимера, редки и часто определяют механизмы с одним динамическим полимером и статически стабилизированной версией других 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Таким образом, необходимы методы для исследования эмерджентных свойств белков, координирующих актин-микротрубочки, которые могут быть полностью поняты только в экспериментальных системах, использующих оба динамических полимера.
Комбинация подходов к прямой маркировке белка, генетически закодированных меток сродства и микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) была применена с большим успехом в системах биомиметического восстановления 19,20,21,22,23. Многие схемы «снизу вверх» не содержат всех факторов, регулирующих белки в клетках. Однако технология «биохимия на покровном стекле» усовершенствовала многие механизмы динамики актина и микротрубочек в высоких пространственных и временных масштабах, включая компоненты, необходимые для сборки или разборки полимеров, и движение моторного белка 5,12,23,24,25,26,27 . Здесь описан минимальнокомпонентный однонитевой подход к исследованию связи актин-микротрубочек in vitro. Этот протокол может быть использован с коммерчески доступными или высокочистыми очищенными белками, флуоресцентно мечеными белками, перфузионными камерами и распространен на более сложные схемы, содержащие клеточные экстракты или синтетические системы. Здесь коммерчески доступный тау-белок используется для демонстрации того, как динамика цитоскелета изменяется в присутствии белка связи актин-микротрубочки, но может быть заменен другими предполагаемыми кодирующими факторы актин-микротрубочки. Основным преимуществом этой системы перед другими подходами является возможность одновременного мониторинга динамики нескольких цитоскелетных полимеров в одной реакции. Этот протокол также предоставляет пользователям примеры и простые инструменты для количественной оценки изменений цитоскелетных полимеров. Таким образом, пользователи протокола будут получать надежные, количественные данные о разрешении одной нити для описания механизмов, лежащих в основе того, как разнообразные регуляторные белки координируют динамику актин-микротрубочек.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Традиционно цитоскелеты актина и микротрубочек изучались как отдельные объекты, ограниченные конкретными клеточными областями или процессами и регулируемые различными наборами связывающих белков, уникальных для каждого полимера. Многие исследования в настоящее время демонстрируют, что динамика обоих цитоскелетных полимеров переплетена и что эти перекрестные помехи необходимы для большинства клеточных моделей поведения. Ряд белков, участвующих во взаимодействиях актин-микротрубочки, уже идентифицирован (т.е. Тау, МАКФ, ГАЗ, формины и т.д.) и хорошо охарактеризованы в отношении только актина или микротрубочек. Однако относительно немногие исследования показали анализы координации актин-микротрубочек с динамическими версиями обоих полимеров. Это может перекрыть возникающие механизмы связи между актином и микротрубочками. Здесь метод полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) на основе микроскопии in vitro позволяет визуализировать динамику как актина, так и микротрубочек из одной биохимической реакции. Этот метод сохраняет динамику полимеризации либо актиновой нити, либо микротрубочек по отдельности или в присутствии другого полимера. Коммерчески доступный тау-белок используется для демонстрации того, как поведение актин-микротрубочек изменяется в присутствии классического цитоскелетного сшивающего белка. Этот метод может обеспечить надежное функциональное и механистическое понимание того, как отдельные регуляторные белки координируют динамику актин-микротрубочек при разрешении отдельных нитей или комплексов более высокого порядка.

При условиях, описанных выше (рисунок 1), полимеры актина и микротрубочек должны быть видимыми (и динамическими) в течение 2 мин после получения изображения (рисунок 2). Как и в случае с любым протоколом, основанным на биохимии, оптимизация может потребоваться для различных регуляторных белков или партий белка. По этим причинам угол TIRF и экспозиция изображения устанавливаются в первую очередь с реакциями, содержащими каждый отдельный полимер. Это подтверждает, что хранимые белки функциональны и достаточно меченого белка присутствует для обнаружения. Хотя это не всегда необходимо (и не выполняется здесь), постобработка фильмов (т.е. вычитание фона, усреднение или преобразования Фурье) может быть использована для повышения контрастности изображения (особенно микротрубочек)5,25,33. Прямая визуализация одиночных актиновых нитей и микротрубочек, обеспечиваемая этим анализом, поддерживает количественное определение нескольких динамических показателей для компонента цитоскелета отдельно или вместе, включая параметры полимеризации (т.е. скорость зародыша или удлинения), параметры разборки (т.е. скорость усадки или катастрофы) и угольное выравнивание/перекрытие полимера (рисунок 3). ). Кроме того, эти меры могут быть использованы в качестве отправной точки для расшифровки связывания или влияния регуляторных лигандов, таких как тау (рисунок 3). Многие измерения одиночных актиновых нитей или микротрубочек могут быть сделаны из одного фильма TIRF. Однако из-за различий в покрытии крышки, пипетке и других факторах надежные измерения должны также включать в себя несколько технических реплицированных реакций / фильмов.
Многие аспекты динамики микротрубочек могут быть определены на примере кимографов, включая скорость удлинения микротрубочек, а также частоту катастроф и спасательных событий (рисунок 3А). Использование кимографов для измерения динамики актина в этой системе не так просто, потому что актиновые нити более запутаны, чем микротрубочки. Как следствие, параметры динамики актиновой нити измеряются вручную, что является трудоемким и трудоемким. Количество нуклеаций измеряется как количество актиновых нитей, присутствующих в последовательной точке времени для всех условий. Эти подсчеты широко варьируются в зависимости от полей визуализации TIRF, но могут использоваться со многими репликами или для дополнения наблюдений из других анализов полимеризации. Количество зародышей также может быть использовано для микротрубочек, если в условиях испытаний отсутствуют стабилизированные семена микротрубочек. Скорость удлинения актиновой нити измеряется как длина нити накала с течением времени по меньшей мере из четырех кадров фильма. Значения скорости передаются на микромолярный актин с поправочным коэффициентом 370 субъединиц для учета количества мономеров актина в микроне нити накала (фиг.3В)32. Измерения для определения скоординированного поведения между актином и микротрубочками менее четко определены. Тем не менее, корреляционный анализ был применен для измерения совпадения обоих полимеров, включая сканирование линий (рисунок 3C) или перекрывающее программное обеспечение 5,11,34.
Доступность данных: Все наборы данных, связанные с этой работой, были депонированы в Zenodo и доступны по обоснованному запросу по адресу: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> Рисунок 1. Экспериментальные схемы: сборка проточной камеры для получения изображения. (A) Сборка камеры визуализации. Сверху вниз: камеры визуализации IBIDI проклеены вдоль перфузионных скважин (обозначены стрелкой); второй (белый) слой ленточной подложки (оставленный на изображении, показанном для лучшего ориентации пользователей) удаляется и эпоксидная смола наносится на край перфузионной камеры (стрелка). Примечание: Чтобы легче ориентировать пользователей, где разместить эпоксидную смолу, на этом изображении была оставлена белая подложка. Очищенная и покрытая крышка прикреплена к камере визуализации стороной покрытия, обращенной к внутренней части перфузионного колодца. (B) Блок-схема, иллюстрирующая этапы кондиционирования камер визуализации для связей биотин-стрептавидин. С) Примеры реакций, используемых для получения фильмов TIRF динамических микротрубочек и актиновых нитей. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> Рисунок 2. Изображения последовательностей растущих актиновых нитей и микротрубочек при отсутствии или присутствии тау. Покадровый монтаж изображения из анализов TIRF, содержащих 0,5 мкМ актина (10% Alexa-647-актина и 0,09% биотин-актина) и 15 мкМ свободного тубулина (4% HiLyte-488 меченого) в отсутствие (A) или присутствие (B) 250 нМ тау. Показано время, прошедшее с момента начала реакции (смешивание трубки А и трубки В). Шкала, 25 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> Рисунок 3. Пример измерений динамики микротрубочек и актиновых нитей. (A) Средняя временная проекция канала тубулина эффективно визуализирует общую длину микротрубочек для сканирования линий, используемых для создания графиков кимографа. Черные пунктирные линии соответствуют двум примерам кимографов динамических микротрубочек, показанным справа. На каждом кимографе показаны фазы роста (сплошные черные линии) и разборки (пунктирные розовые линии; две обозначены розовыми стрелками) микротрубочек. Шкала времени, 3 мин. Длина шкалы, 10 мкм. Реакция содержит 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% 488-HiLyte метки). Показан только канал тубулина. (B) Два примера покадровых монтажей изображений, изображающих одноактиновые нити, активно полимеризующиеся. Скорости относительного удлинения рассчитываются как наклон участков длины актиновых нитей с течением времени на микромолярный актин. Таким образом, поправочный коэффициент, равный двум, должен быть применен к актиновым реакциям 0,5 мкМ для сравнения скоростей, обычно определяемых при концентрации актина 1 мкМ. Примеры из пяти нитей показаны справа. Шкала стержней, 10 мкм. Реакция содержит 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% 488-HiLyte метки). Показан только канал актина. (C) TIRF изображения динамических микротрубочек (MT) (зеленый) и актиновых нитей (фиолетовый), полимеризующихся в отсутствие (слева) или в присутствии 250 нМ тау (посередине). Синие пунктирные линии и стрелки обозначают, где была нарисована линия для графиков сканирования линий, соответствующих каждому условию (под каждым изображением). Перекрытие между микротрубочками и актиновыми областями (показано черным) может быть оценено в заданный момент времени для каждой области (справа). Шкала стержней, 25 мкм. Реакции содержат 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% метки 488-HiLyte) с 250 нМ тау или без него. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Этот протокол является руководством для визуализации динамических актинов и микротрубочек с использованием микроскопического анализа in vitro полной внутренней флуоресценции (TIRF).

Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Несмотря на множество примеров координации, большинство исследований изучают белки актина или микротрубочек по отдельности. Этот метод позволяет визуализировать оба динамических полимера в одной реакции. Этот метод позволяет пользователю оценивать различные регуляторные белки на предмет эмерджентных свойств, которые можно увидеть только с динамическими версиями актина и микротрубочек.Этот метод может быть расширен, чтобы включить липиды или экстракты, чтобы приблизиться к созданию синтетической клетки. Начните с размораживания аликвот порошков PEG-Silane и Biotin-PEG-Silane и растворения порошков PEG в 80% этаноле для получения растворов для покрытия 10 миллиграммов на миллилитр mPEG-Silane и от двух до четырех миллиграммов на миллилитр Biotin-PEG-Silane. Снимите чистую крышку из хранилища этанола с помощью щипцов.Высушите газообразным азотом и храните в чистой чашке Петри. Покройте крышку 100 микролитрами раствора покрытия и инкубируйте их при температуре 70 градусов Цельсия в течение не менее 18 часов или до использования. Вырежьте 12 полосок двухсторонней ленты длиной 24 миллиметра.Снимите одну сторону подложки ленты и закрепите куски ленты рядом с шестью канавками, присутствующими на чистой камере визуализации. Снимите второй кусок ленты, чтобы обнажить липкую сторону ленты вдоль каждой канавки камеры, и поместите ленту камеры стороной вверх на чистую поверхность. Смешайте эпоксидную смолу и растворы отвердителей один к одному в небольшой весовой лодке и используйте наконечник P1000, чтобы поместить каплю смешанной эпоксидной смолы между ленточными полосами на конце каждой канавки камеры визуализации.Затем поместите камеру, ленту или эпоксидную смолу стороной вверх, на чистую поверхность. Снимите крышку с покрытием из инкубатора при температуре 70 градусов Цельсия и промойте покрытые и непокрытые поверхности крышки двойной дистиллированной водой шесть раз. Высушите фильтрованным газообразным азотом, а затем прикрепите к камере визуализации с помощью крышки скользящего покрытия стороной к ленте.Используйте наконечник пипетки P200 или P1000 для оказания давления на интерфейс заклеенного стекла, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между лентой и крышкой. Инкубируйте собранные камеры при комнатной температуре в течение не менее пяти-10 минут, чтобы эпоксидная смола полностью запечатала колодцы камеры перед использованием. Перфузионные камеры истекают в течение 12-18 часов после сборки.Используйте перфузионный насос и последовательно обменивайтесь кондиционирующими растворами в перфузионной камере, пропуская 50 микролитров 1% BSA для грунтовки камеры визуализации. Извлеките лишний буфер из резервуара для крепления замка приманки. Затем протолкните 50 микролитров по 0,005 миллиграмма на миллилитр стрептавидина и инкубируйте в течение одной-двух минут при комнатной температуре.Удалите лишний буфер из резервуара. Проточите 50 микролитров 1% BSA, чтобы заблокировать неспецифическое связывание и инкубировать в течение 10-30 секунд. Удалите лишний буфер из резервуара.Затем пропустите 50 микролитров теплого 1x TIRF буфера, а затем 50 микролитров стабилизированных и 50% биотинилированных семян микротрубочек, разведенных в 1x TIRF буфере. Установите сцену или объективное нагревательное устройство для поддержания температуры от 35 до 37 градусов Цельсия в течение 30 минут до визуализации первой биохимической реакции. Затем установите интервал сбора каждые пять секунд в течение 15–20 минут.Затем установите 488 и 647 лазерных воздействий на 50-100 миллисекунд при мощности от 5% до 10%, сначала отрегулировав реакцию полимеризации, чтобы инициировать сборку актиновой нити. Получайте изображения на расстоянии 647 нанометров и вносите соответствующие коррективы. Затем отрегулируйте реакцию полимеризации во второй кондиционированной перфузионной скважине, чтобы инициировать сборку микротрубочек.Визуализируйте на 488 нанометрах и внесите соответствующие коррективы. Соедините три микролитра 10 микромолярного тубулина 488 с 7,2 микролитровой аликвотой 100 микромолярного флуоресцентно немаркированного тубулина не более чем за 15 минут до использования. Затем соедините три микролитра разбавленного актина, связанного с биотином, в соответствующих объемах флуоресцентно немаркированного и меченого актина таким образом, чтобы конечная смесь составила 12,5 микромолярного общего актина с флуоресцентной меткой от 10% до 30%.Приготовьте смесь цитоскелетов, объединив два микролитра 12,5 микромолярной актиновой смеси со смесью тубулина не более чем за 15 минут до получения изображения. Хранить на льду до использования. Приготовьте белковую реакционную смесь, объединив все другие экспериментальные компоненты и белки, включая 2x TIRF-буфер, антибелок, нуклеотиды, буферы и вспомогательные белки.Инкубируйте смесь цитоскелетов и белковую реакционную смесь отдельно при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 секунд. Чтобы начать реакцию, добавьте содержимое белковой реакционной смеси в смесь цитоскелетов и перемешайте ее. Поток 50 микролитров реакционной смеси, содержащей 1x TIRF буфера, дополненного 15 микромолярными свободными тубулинами, одним миллимолярным GTP, 0,5 микромолярными мономерами актина и соответствующими объемами буферных регуляторов в перфузионную камеру.Записывайте покадровый видеоролик с помощью программного обеспечения микроскопа для получения каждые пять секунд в течение 15-20 минут. Обусловите новую перфузионную скважину и замените буферный объем регуляторным белком, представляющим интерес, и буферными элементами управления. Приобретайте для оценки регуляторных белков для эмерджентных функций актиновых микротрубочек.На этих изображениях показаны примеры измерений микротрубочек и динамики актиновых нитей. Средняя временная проекция канала тубулина эффективно визуализирует общую длину микротрубочек для сканирования линий, используемых для создания графиков кимографа. Черные пунктирные линии соответствуют двум примерам кимографов динамических микротрубочек.Фазы роста и разборки микротрубочек показаны на каждом кимографе. Здесь показаны два примера монтажей покадровых изображений, изображающих активные полимеризующиеся одиночные актиновые нити. Скорости относительного удлинения рассчитываются как наклон участков длины актиновых нитей с течением времени на микромолярный актин.Таким образом, поправочный коэффициент в два раза должен быть применен к 0,5 микромолярным актиновым реакциям для сравнения скоростей, обычно определяемых при концентрации актина в одном микромоляре. Примеры из пяти нитей показаны здесь. Здесь показаны флуоресценция полного внутреннего отражения, или TIRF изображения динамических микротрубочек в актиновых нитях, полимеризующихся при отсутствии или присутствии 250 наномоляров тау.Синими пунктирными линиями и стрелками знака изнашивается линия, нарисованная для линии сканирования графиков, соответствующих каждому условию. Перекрытие между микротрубочками в актиновых областях может быть оценено в установленный момент времени для каждой области. Цитоскелетные белки, в частности актин, микротрубочки и их регуляторы очень чувствительны к циклам замораживания/оттаивания.Для консистенции и успеха используйте высокочистые и правильно хранящиеся белки.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

В пробирке Полимеризация F-актина на ранних Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Высокопроходимых Всего внутреннего отражения флуоресценции и прямой стохастической оптической реконструкции микроскопии с помощью фотонического чипа

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Визуализация диффузной динамики золотых нанородов на клеточной мембране с помощью одной наночастицы Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Изображение подоцитических белков Нефрин, Актин и Подоцин с помощью микроскопии расширения

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...