Name: visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Jag är tacksam mot Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) och Brian Haarer (SUNY Upstate) för hjälpsamma kommentarer om detta protokoll. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (GM133485).

1. Tvätta täckglassen
OBS: Tvätta (24 mm x 60 mm, #1.5) täckglas enligt Smith et al., 201328.
<ol><li>Ordna omslagsglas i en plastbehållare för postsändare.</li>
	<li>Sänk ner täckglas i följd i följande lösningar och ultraljudsbehandling i 30-60 min, skölj med ddH2O 10 gånger mellan varje lösning: ddH2O med en droppe diskmedel; 0,1 M KOH. Förvara täckglas i 100% etanol i upp till 6 månader. OBS: Rör inte glasytor med oälskade fingrar. Använd pincett istället.</li>
</ol>2. Beläggning rengjorda (24 mm x 60 mm, #1.5) täckglas med mPEG- och biotin-PEG-silan
OBS: Detta protokoll använder specifikt ett biotin-streptavidinsystem för att placera aktin och mikrotubuli inom TIRF-bildplanet. Andra beläggningar och system kan användas (t.ex. antikroppar, poly-L-lysin, NEM-myosin, etc.).
<ol><li>Tina alikvoter av PEG-silan och biotin-PEG-silanpulver.</li>
	<li>Lös upp PEG-pulver i 80% etanol (pH 2,0) för att generera beläggningslösningar av 10 mg / ml mPEG-silan och 2-4 mg / ml biotin-PEG-silan, strax före användning. OBS: PEG-pulver verkar ofta upplösta men kanske inte på mikroskopisk nivå. Korrekt resuspension tar ~1-2 min med konstant pipettering. Användare uppmuntras att pipettera ytterligare 10 gånger efter uppkomsten av pulverupplösning. VARNING: Använd handskar för att skydda huden mot koncentrerad HCl när du gör 80% etanol (pH 2,0).</li>
	<li>Ta bort det rena (24 mm x 60 mm, #1,5) täckglaset från etanolförvaringen med pincett. Torka med kvävgas och förvara i en ren petriskål.</li>
	<li>Täckglas med 100 μL beläggningslösning: en blandning av 2 mg/ml mPEG-silan (MW 2 000) och 0,04 mg/ml biotin-PEG-silan (MW 3 400) i 80 % etanol (pH 2,0). OBS: För gles beläggning (rekommenderas) använd 2 mg / ml mPEG-silan och 0,04 mg / ml biotin-PEG-silan. För tät beläggning använd 2 mg/ml mPEG-silan, 4 mg/ml biotin-PEG-silan.</li>
	<li>Inkubera täckglas vid 70 °C i minst 18 timmar eller fram till användning. OBS: Belagda täckglas bryts ned om de förvaras vid 70 °C i mer än 2 veckor.</li>
</ol>3. Montering av bildflödeskammare
<ol><li>Skär 12 remsor dubbelsidig tejp med dubbla ryggar till en längd av 24 mm. Ta bort ena sidan av tejpens baksida och fixera tejpbitar intill de sex spåren som finns på en ren bildkammare. OBS: Tejpen måste vara platt för korrekt montering, annars läcker bildkammare. Ta försiktigt bort tejpens baksida för att undvika stötar. Glidande tejpade kamrar på en ren yta för att jämna ut bandkammarkontakter rekommenderas.</li>
	<li>Ta bort den andra tejpbiten för att exponera tejpens klibbiga sida längs varje kammarspår. Placera kammartejpen uppåt på en ren yta.</li>
	<li>Blanda epoxiharts och härdarlösningar 1:1 (eller enligt tillverkarens anvisningar) i en liten vägbåt.</li>
	<li>Använd en P1000-spets för att placera en droppe blandad epoxi mellan tejpremsorna i slutet av varje bildkammarspår (röd pil; Figur 1A). Placera kammartejp/epoxisidan uppåt på en ren yta.</li>
	<li>Ta bort ett belagt täckglas från inkubatorn vid 70 °C. Skölj belagda och obelagda ytor på täckglas medddH2Osex gånger, torka med filtrerad kvävgas och fäst sedan på bildkammaren med täckglasbeläggningssidan mot tejpen.</li>
	<li>Använd en P200- eller P1000-pipettspets för att applicera tryck på tejpglasgränssnittet för att säkerställa en bra tätning mellan tejpen och täckglaset. OBS: Med en ordentlig tätning blir dubbelsidig tejp genomskinlig. Bildkammare som saknar tillräckliga bandkammarkontakter läcker ut.</li>
	<li>Inkubera monterade kamrar vid rumstemperatur i minst 5-10 min för att epoxin ska kunna täta kammarbrunnarna helt före användning. Perfusionskamrarna löper ut inom 12-18 timmar efter montering. OBS: Beroende på tejpplacering och tjockleken på dubbelsidig tejp som används, kommer den monterade kammaren att ha en slutlig volym på 20-50 μL.</li>
</ol>4. Konditionering av perfusionskamrar
<ol><li>Använd en perfusionspump (hastighet inställd på 500 μl/min) för att sekventiellt byta ut konditioneringslösningar i perfusionskammaren enligt följande:<ol>
<li>Flöde 50 μL av 1% BSA för att primera bildkammaren. Ta bort överflödig buffert från Luer låsmonteringsbehållare.</li>
		<li>Flöde 50 μl av 0,005 mg / ml streptavidin. Inkubera i 1-2 min vid rumstemperatur. Ta bort överskottsbufferten från behållaren.</li>
		<li>Flöde 50 μl 1% BSA för att blockera ospecifik bindning. Inkubera i 10-30 s. Ta bort överskottsbufferten från behållaren.</li>
		<li>Flöde 50 μL varm (37 °C) 1x TIRF-buffert (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glukos, 0,25% (v/v) metylcellulosa (4 000 cp)). OBS: Ta inte bort överflödig buffert från behållaren. Detta förhindrar att kammaren torkar ut, vilket kan införa luftbubblor i systemet.</li>
		<li>Valfritt: Flöde 50 μL stabiliserade29 och 50% biotinylerade mikrotubulifrön utspädda i 1x TIRF-buffert. OBS: Den korrekta utspädningen måste bestämmas empiriskt och innehålla variabilitet från sats till sats. Protokoll från 27,29 rekommenderas som utgångspunkter. En utspädning som ger 10-30 frön per synfält fungerar bra med denna inställning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Förberedelse av mikroskop
OBS: Biokemiska reaktioner som innehåller dynamiska aktinfilament och mikrotubuli visualiseras / utförs med hjälp av ett inverterat TIRF-mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence) utrustat med 120-150 mW solid state-lasrar, ett temperaturkorrigerat 63x TIRF-mål för oljedämpning och en EMCCD-kamera. Proteiner i detta exempel visualiseras vid följande våglängder: 488 nm (mikrotubuli) och 647 nm (aktin).
<ol><li>Ställ in steg-/målvärmaren så att den håller 35–37 °C minst 30 minuter före avbildning av den första biokemiska reaktionen.</li>
	<li>Ställ in bildförvärvsparametrarna enligt följande:<ol>
<li>Ställ in förvärvsintervallet till var 5: e s i 15-20 min.</li>
		<li>Ställ in 488 och 647 laserexponeringar på 50-100 ms vid 5% -10% effekt. Ställ in lämplig TIRF-vinkel för mikroskop. OBS: Oavsett mikroskopinställning är det enklaste sättet att ställa in lasereffekt, exponering och TIRF-vinkel att göra justeringar på bilder av endera polymeren ensam (se 5.2.2.1 och 5.2.2.2 nedan). Användare uppmanas starkt att använda de lägsta lasereffekt- och exponeringsinställningarna som fortfarande tillåter detektering.<ol>
<li>Justera polymerisationsreaktionen (figur 1C) för att initiera aktinfilamentmontering och få bilder vid 647 nm. Gör lämpliga justeringar.</li>
			<li>Justera polymerisationsreaktionen i en andra konditionerad perfusionsbrunn för att initiera mikrotubulimontering (figur 1C) och visualisera vid 488 nm. Gör lämpliga justeringar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Framställning av proteinreaktionsblandningar
<ol><li>Förbered stamlösning av fluorescerande märkt tubulin.<ol>
<li>Bestäm koncentrationen av hemlagad omärkt tubulin via spektrofotometri vid Abs280, enligt följande:<ol>
<li>Tom spektrofotometer med 1xBRB80 som saknar GTP.</li>
			<li>Beräkna koncentrationen av tubulin med hjälp av den bestämda extinktionskoefficienten på 115 000 M-1 cm-1 och följande formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq01.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Resuspend kommersiellt tillverkade lyofiliserade lysin-märkta 488-tubulin till 10 μM (1 mg / ml; 100% etikett) med 20 μL av 1x BRB80 saknar GTP.</li>
		<li>Tina en 7,2 μl alikvot på 100 μM omärkt återvunnet tubulin29 på is. OBS: Återvunnet tubulin är avgörande för framgångsrik mikrotubulimontering in vitro eftersom det tar bort polymerisationsinkompetenta dimerer som bildas i frysta proteinlager29,30.</li>
		<li>Kombinera 3 μL 10 μM 488-tubulin med 7,2 μL alikvot på 100 μM omärkt tubulin, högst 15 min före användning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered stamlösningen av fluorescerande märkt aktin.<ol>
<li>För hemlagade proteiner, bestäm koncentrationen och procentetiketten av aktin via spektrofotometri Abs290 och Abs650, enligt följande:<ol>
<li>Tom spektrofotometer med G-buffert.</li>
			<li>Beräkna koncentrationen av omärkt aktin med hjälp av den bestämda extineringskoefficienten på 25 974 M-1 cm-1 och följande formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
			<li>Beräkna koncentrationen av lysin märkt Alexa-647-aktin med hjälp av utrotningskoefficienten för omärkt aktin, fluorkorrigeringsfaktorn på 0,03 och följande formel: [Alexa-647 aktin], μM = (Abs290 - <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq03.jpg" style="opacity: 0.9; margin: auto;">
</li>
			<li>Beräkna procentetiketten för Alexa-647-aktin med hjälp av den bestämda ε för Alexa-647 på 239 000 M-1 cm-1, enligt följande: % etikett av Alexa-647-aktin = (Abs290 - (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq04.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tina en 2 μL alikvot av 3 μM 100% märkt biotin-aktin (märkt på lysinrester). Späd 10 gånger genom att tillsätta 18 μl G-buffert.</li>
		<li>Kombinera 3 μL utspätt biotinylerat aktin, lämpliga volymer omärkt och märkt aktin (ovan) så att den slutliga blandningen blir 12,5 μM totalt aktin med 10%-30% fluorescerande etikett. OBS: Mer än 30% procent fluorescerande aktinmonomerer (slutlig) kan äventyra bildupplösningen eftersom filament blir svåra att urskilja från bakgrunden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered reaktionsblandningar (figur 1C).<ol>
<li>Förbered cytoskelettblandningen (rör A) genom att kombinera 2 μl av 12,5 μM aktinblandningsstocken (6.2.3) med tubulinstockblandningen (6.1.4), högst 15 minuter före avbildning. Förvara på is tills den används.</li>
		<li>Förbered proteinreaktionsblandning (rör B) genom att kombinera alla andra experimentella komponenter och proteiner, inklusive: 2x TIRF-buffert, antiblekmedel, nukleotider, buffertar och tillbehörsproteiner. Ett exempel visas i figur 1C. OBS: Den slutliga utspädningen resulterar i en 1x TIRF-buffert som innehåller ATP, GTP och jonstyrka inom det uppskattade fysiologiska intervallet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubera rör A och rör B separat vid 37 °C i 30-60 s. För att initiera reaktion, blanda och tillsätt innehållet i rör B till rör A (nedan).</li>
</ol>7. Bildaktin och mikrotubulidynamik
<ol><li>Tillstånd perfusion väl (figur 1B; steg 4 ovan).</li>
	<li>Initiera aktin- och mikrotubulimontering samtidigt genom att tillsätta innehållet i rör B (reaktionsblandning) till rör A (cytoskelettblandning) (figur 1C).</li>
	<li>Reaktionsflöde 50 μl innehållande 1x TIRF-buffert kompletterad med 15 μM fritt tubulin, 1 mM GTP och 0,5 μM aktinmonomerer och lämpliga volymer buffertkontroller.</li>
	<li>Spela in time-lapse-film med hjälp av mikroskopprogramvara för att förvärva var 5: e s i 15-20 min. OBS: Initiering av aktin- och mikrotubulidynamik sker inom 2-5 minuter (figur 2). Längre fördröjningar indikerar problem med temperaturkontroll eller koncentrationsrelaterade problem med proteiner i reaktionsblandningen.</li>
	<li>Konditionera en ny perfusionsbrunn (steg 4) och ersätt buffertvolymen med reglerande protein(n) av intresse (dvs. Tau) och buffertkontroller (figur 1C). Förvärva enligt beskrivningen i steg 7 (ovan) för att bedöma regulatoriska proteiner för framväxande aktin-mikrotubulifunktioner.</li>
</ol>8. Bearbeta och analysera bilder med FIJI-programvara31
<ol><li>Öppna sparade TIRF-filmer och visa som en sammansatt.</li>
	<li>Analysera mikrotubulidynamik (figur 3A), enligt följande:<ol>
<li>Generera en tidsbaserad maximal Z-projektion från menyn för bildstaplar.</li>
		<li>Synkronisera Z-projektionsfönstret med den ursprungliga TIRF-filmen från menyn Analysera> verktyg> Synkronisera Windows .</li>
		<li>Rita en linje med hjälp av det raka linjeverktyget längs en mikrotubuli av intresse på den tidsprojicerade bilden.<ol>
<li>Öppna ROI-hanteraren (Region of Interest) från analysmenyn (Analysera> Verktyg> ROI Manager).</li>
			<li>Spara enskilda mikrotubuliplatser genom att trycka på "t". Upprepa för alla mikrotubuli av intresse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rita kymografer över valda linjer med "/" eller kör multi-kymo-makrot som genererar en video och kymograf för varje mikrotubuli i ROI-hanteraren31.<ol>
<li>Lägg till skalfälten för både längd (μm) och tid (min) i kymografier på menyn Analysera> Verktyg> Skala staplar .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mät mikrotubulitillväxthastigheter från kymografsluttningar (figur 3A, 1-2; lutning av svarta linjer).</li>
		<li>Räkna dynamiska mikrotubulihändelser (katastrof eller återväxt) från den genererade kymografen eller med hjälp av tillgängliga analysmakron 5,8,18,25. Röda prickade linjer i figur 3A, 1-2 representerar katastrof/snabba demonteringshändelser.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysera aktindynamik (figur 3B), enligt följande:<ol>
<li>Mät aktinnukleation enligt följande:<ol>
<li>Räkna antalet aktinfilament som finns i synfältet 100 s efter initieringen av reaktionen och uttrycka av området (filament per μm2).</li>
			<li>Registrera och spara data i ROI-hanteraren, som i steg 8.2.3.1 ovan.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mät aktinfilamentets töjningshastigheter (figur 3B) enligt följande:<ol>
<li>Rita en linje längs ett aktinfilament av intresse med hjälp av segmenterat linjeverktyg.</li>
			<li>Lägg till rad i ROI-hanteraren enligt steg 8.2.3.1 ovan.</li>
			<li>Upprepa att följa raden (lägga till varje mått i ROI-hanteraren) för minst fyra filmbildrutor. OBS: Mätning av sju till åtta på varandra följande ramar rekommenderas, men vissa förhållanden saktar aktinpolymerisationen under den detekterbara gränsen som kan lösas med objektiva / mikroskopinställningar. I ett sådant fall kan mätningar göras med jämna mellanrum över icke-på varandra följande ramar (t.ex. var femte bildruta).</li>
			<li>Plotta uppmätta längdvärden över förfluten tid. Lutningen på den genererade linjen är aktinförlängningshastigheten i mikron /s.</li>
			<li>Överför slutliga beräknade hastigheter som underenheter s-1 μM-1 med hjälp av en korrigeringsfaktor på 370 underenheter för att ta hänsyn till antalet aktinmonomerer i en mikron av filament32.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Utför korrelativ analys för regioner med parallell aktin-mikrotubuliassociation (figur 3C), enligt följande:<ol>
<li>Rita en linje längs en mikrotubuli av intresse vid en viss tidpunkt (dvs 300 s efter reaktionsinitiering) med hjälp av det linjära verktyget.<ol>
<li>Lägg till rad i ROI-hanteraren enligt steg 8.2.3.1 ovan.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plotta fluorescensintensiteten längs linjen i varje kanal.<ol>
<li>Välj varje kanal med bildreglaget och rita intensiteterna längs linjen med "kommando k".</li>
			<li>Spara eller exportera värden genom att klicka på "lista" -knappen i utdatafönstret.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uttryck aktin-mikrotubulikopplingshändelser som ett förhållande (aktin överlappande med mikrotubuli) från enskilda händelser eller som ett antal händelser i ett givet synfält vid en konsekvent tidpunkt (figur 3C).</li>
		<li>Alternativ: Använd programvara för att bestämma den procentuella överlappningen av båda kanalerna 5,12.</li>
	</ol></li>
</ol>

Det finns inga intressekonflikter att avslöja.

Användningen av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi till visualiserade renade proteiner har varit ett fruktbart och övertygande tillvägagångssätt för att dissekera unika mekanismer för cytoskelettreglering 5,23,24,25,26,27,35. Jämfört med traditionella biokemiska analyser kräver TIRF-reaktioner mycket små volymer (50-100 μL), och kvantitativa mätningar av cytoskelettdynamik kan hämtas från en individuell analys. De flesta studier av cytoskelettdynamik fokuserar på ett enda polymersystem (dvs. aktinfilament eller mikrotubuli), så detaljerade mätningar av överhörning eller framväxande beteenden mellan aktinfilament och mikrotubuli som vanligtvis ses i celler har förblivit svårfångade och svåra att rekapitulera i provröret. För att lösa detta problem beskriver detta protokoll ett TIRF-mikroskopisystem med en filament som möjliggör direkt visualisering av dynamiska aktin- och mikrotubulipolymerer i samma biokemiska reaktion. Således går denna metod utöver traditionella analyser som rekapitulerar det dynamiska beteendet hos aktinfilament eller mikrotubuli ensam. Denna teknik utfördes också med Tau som ett exempel på hur flera dynamiska egenskaper förändras i närvaro av en cytoskelettkopplingsfaktor. Detta protokoll kan användas med ytterligare proteiner som är kända eller misstänks för att samordna aktin- eller mikrotubulidynamik, inklusive (men inte begränsat till) MACF, GAS, forminer och mer. Slutligen kan exempelanalyser användas som en guide för att kvantifiera data som förvärvats med detta protokoll.
"Att se är att tro" är en tvingande anledning att utföra mikroskopibaserade analyser. Försiktighet krävs dock vid utförande och tolkning av TIRF-mikroskopiexperiment. En stor utmaning med cytoskelettsammonteringsanalyser är att många vanliga avbildningsförhållanden inte är kompatibla med varje polymer. Mikrotubuli och aktin har vanligtvis olika buffert-, temperatur-, salt-, nukleotid- och koncentrationskrav för polymerisation. Aktin, tubulin, reglerande proteiner av intresse och de buffertar som används i detta protokoll är känsliga för frys-tina cykler. Därför är noggrann hantering av proteiner och buffertar nödvändig för att framgångsrikt kunna utföra detta protokoll. För att lindra många av dessa problem rekommenderas starkt att använda nyåtervunnet tubulin (fryst i <6 veckor) och förröjning av frysta / återsuspenderade aktiner via ultracentrifugering. Dessa överväganden gäller också för den myriad av reglerande proteiner som ska bedömas med detta förfarande, som kan vara känsliga för frys-tina cykler eller koncentrationen av buffertsalter 5,11,36.
Tyvärr finns det ingen buffert som passar alla utan experimentella kompromisser. För att lämplig mer volym för proteiner med lägre koncentration kan ATP och GTP inkluderas i 2x TIRF-buffertlösningen (figur 1C). Men eftersom dessa nukleotider är extremt känsliga för frys-tina cykler rekommenderas det inte. De syrerengörande föreningarna som används här (dvs. katalas och glukosoxidas) är nödvändiga för att visualisera proteiner under långa tidsperioder (minuter till timmar), men är kända för att begränsa mikrotubulipolymerisation vid höga koncentrationer5. Relaterat till dessa buffertöverväganden är en begränsning av detta protokoll att vissa kanoniska mikrotubuliassocierade reglerande proteiner kan kräva mer eller mindre salt för att rekapitulera funktioner som finns i celler eller analyser med hjälp av enbart mikrotubuli (utan aktin). Att ändra saltets natur eller koncentration för att ta itu med dessa problem kommer sannolikt att påverka graden av aktinfilamentpolymerisation och / eller parametrar för mikrotubulidynamik. Mätningar av flera beskrivande parametrar (minimalt, kärnbildning, töjningshastigheter och stabilitet) (figur 3) krävs för att bekräfta protokollframgång eller för att uttryckligen dokumentera effekterna av specifika buffertar eller reglerande proteiner. Till exempel kan för mycket aktinfilamentpolymerisation dölja aktin-mikrotubulikopplingshändelser inom några sekunder. Följaktligen kommer finjustering av experimentella förhållanden genom att sänka den totala koncentrationen av aktin eller inkludera ytterligare proteiner för att undertrycka aktinkärnbildning (dvs. profilin) att förlänga den totala perioden som samordnade aktin-mikrotubuliaktiviteter kan ses tydligt. Kontroller som hanterar dessa krav och tekniska replikat (bortom flera synfält) är viktiga för att användarna ska kunna generera tillförlitliga och reproducerbara resultat.
Cellbaserade studier ger begränsad möjlighet att observera direkta protein-proteinrelationer eller verkan av regulatoriska komplex. Däremot återspeglar några av de mekanismer som hämtas från in vitro-analyser inte alltid de exakta beteendena hos proteiner som ses i celler. Detta klassiska biokemistiska dilemma kan behandlas i framtida tillämpningar av denna teknik med specifika modifieringar. Till exempel, tillsats av funktionella fluorescerande märkta kopplingsproteiner utvidgar denna metod från enfilamentstudier till enmolekylära studier. Analyser kan modifieras ytterligare för att använda cellextrakt som kan lägga till de "saknade" okända nyckelfaktorer som krävs för att rekapitulera cellliknande fenomen. Till exempel har TIRF-baserade analyser som använder jäst- eller Xenopus-extrakt rekonstituerat kontraktila aktomyosinringar37, mitotiska spindlar26,38, komponenter i aktin eller mikrotubulienhet39,40 och jämn dynamik vid centrosomen och kinetokorerna 36,41,42,43 . Dessutom kan sådana system bana väg för artificiella cellsystem som har lipider eller signalfaktorer närvarande 44,45,46.

Historiskt sett har aktin och mikrotubuli setts som separata enheter, var och en med sin egen uppsättning reglerande proteiner, dynamikbeteenden och distinkta cellulära platser. Rikliga bevis visar nu att aktin- och mikrotubulipolymerer engagerar sig i funktionella överhörningsmekanismer som är väsentliga för att utföra många cellprocesser inklusive migration, mitotisk spindelpositionering, intracellulär transport och cellmorfologi 1,2,3,4. De olika samordnade beteenden som ligger till grund för dessa exempel är beroende av en invecklad balans mellan kopplingsfaktorer, signaler och fysikaliska egenskaper. De molekylära detaljerna som ligger till grund för dessa mekanismer är dock fortfarande till stor del okända eftersom de flesta studier fokuserar på en enda cytoskelettpolymer i taget 1,2,5.
Aktin och mikrotubuli interagerar inte direkt 6,7,8. Den samordnade dynamiken hos aktin och mikrotubuli som ses i celler förmedlas av ytterligare faktorer. Många proteiner som tros reglera aktin-mikrotubuli överhörning har identifierats och deras aktiviteter är väl karakteriserade med avseende på antingen cytoskelettpolymer ensam 1,2. Växande bevis tyder på att denna enda polymermetod har dolt de dubbla funktionerna hos några av de proteiner / komplex som möjliggör aktin-mikrotubulikopplingshändelser 7,8,9,10,11,12,13. Experiment där båda polymererna är närvarande är sällsynta och definierar ofta mekanismer med en enda dynamisk polymer och statisk stabiliserad version av de andra 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Således behövs metoder för att undersöka de framväxande egenskaperna hos aktin-mikrotubuli-koordinerande proteiner som endast kan förstås fullt ut i experimentella system som använder båda dynamiska polymererna.
Kombinationen av direkta proteinmärkningsmetoder, genetiskt kodade affinitetstaggar och total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi har tillämpats med stor framgång i biomimetiska rekonstitueringssystem 19,20,21,22,23. Många bottom-up-system innehåller inte alla faktorer som reglerar proteiner i celler. Tekniken "biokemi på ett täckglas" har emellertid förfinat många mekanismer för aktin- och mikrotubulidynamik vid höga rumsliga och tidsmässiga skalor, inklusive de komponenter som krävs för polymermontering eller demontering och motorproteinrörelse 5,12,23,24,25,26,27 . Här beskrivs en minimal komponent med enfilament för att undersöka aktin-mikrotubulikoppling in vitro. Detta protokoll kan användas med kommersiellt tillgängliga eller mycket rena renade proteiner, fluorescerande märkta proteiner, perfusionskammare och utvidgas till mer komplicerade scheman som innehåller cellextrakt eller syntetiska system. Här används kommersiellt tillgängligt Tau-protein för att demonstrera hur cytoskelettdynamiken förändras i närvaro av ett aktin-mikrotubulikopplingsprotein, men kan ersättas med andra förmodade aktin-mikrotubuli-samordnande faktorer. Den största fördelen med detta system jämfört med andra tillvägagångssätt är förmågan att samtidigt övervaka dynamiken hos flera cytoskelettpolymerer i en reaktion. Detta protokoll ger också användarna exempel och enkla verktyg för att kvantifiera förändringar i cytoskelettpolymerer. Således kommer protokollanvändare att producera tillförlitliga, kvantitativa upplösningsdata med en filament för att beskriva mekanismer som ligger till grund för hur olika reglerande proteiner samordnar aktin-mikrotubulidynamik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Traditionellt har aktin- och mikrotubulicytoskeletonerna studerats som separata enheter, begränsade till specifika cellulära regioner eller processer och reglerade av olika sviter av bindande proteiner som är unika för varje polymer. Många studier visar nu att dynamiken hos båda cytoskelettpolymererna är sammanflätade och att denna överhörning krävs för de flesta cellulära beteenden. Ett antal proteiner som är involverade i aktin-mikrotubuliinteraktioner har redan identifierats (dvs Tau, MACF, GAS, forminer och mer) och är väl karakteriserade med avseende på antingen aktin eller mikrotubuli ensam. Relativt få studier visade emellertid analyser av aktin-mikrotubuli-koordination med dynamiska versioner av båda polymererna. Detta kan täppa till framväxande länkningsmekanismer mellan aktin och mikrotubuli. Här möjliggör en total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopibaserad in vitro-rekonstitueringsteknik visualisering av både aktin- och mikrotubulidynamik från den biokemiska reaktionen. Denna teknik bevarar polymerisationsdynamiken hos antingen aktinfilament eller mikrotubuli individuellt eller i närvaro av den andra polymeren. Kommersiellt tillgängligt Tau-protein används för att visa hur aktin-mikrotubulibeteenden förändras i närvaro av ett klassiskt cytoskelett tvärbindande protein. Denna metod kan ge tillförlitliga funktionella och mekanistiska insikter i hur enskilda reglerande proteiner koordinerar aktin-mikrotubulidynamik vid en upplösning av enstaka filament eller högre ordningskomplex.

Med de förhållanden som beskrivs ovan (figur 1) bör aktin- och mikrotubulipolymerer vara synliga (och dynamiska) inom 2 minuter efter bildinsamling (figur 2). Som med alla biokemibaserade protokoll kan optimering krävas för olika reglerande proteiner eller satser av protein. Av dessa skäl ställs TIRF-vinkeln och bildexponeringarna först med reaktioner som innehåller varje enskild polymer. Detta bekräftar att lagrade proteiner är funktionella och att tillräckligt med märkt protein finns för detektion. Även om det inte alltid är nödvändigt (och inte utförs här), kan efterbehandling av filmer (dvs. bakgrunds subtraktion, medelvärde eller Fourier-transformationer) användas för att förbättra bildkontrasten (särskilt av mikrotubuli)5,25,33. Den direkta visualiseringen av enstaka aktinfilament och mikrotubuli som tillhandahålls av denna analys stöder kvantitativ bestämning av flera dynamiska åtgärder för antingen cytoskelettkomponenten ensam eller tillsammans, inklusive polymerisationsparametrar (dvs. kärnbildning eller töjningshastighet), demonteringsparametrar (dvs. krympningshastigheter eller katastrofhändelser) och polymerkolignering / överlappning (figur 3 ). Vidare kan dessa åtgärder användas som utgångspunkt för att dechiffrera bindningen eller påverkan av reglerande ligander som Tau (Figur 3). Många mätningar av enstaka aktinfilament eller mikrotubuli kan göras från en TIRF-film. På grund av variationer i täckglasbeläggning, pipettering och andra faktorer bör tillförlitliga mätningar också inkludera flera tekniska replikatreaktioner/filmer.
Många aspekter av mikrotubulidynamik kan bestämmas från exempel kymografer inklusive graden av mikrotubuliförlängning, liksom frekvensen av katastrof- och räddningshändelser (figur 3A). Att använda kymografer för att mäta aktindynamik i detta system är inte lika enkelt eftersom aktinfilament är mer invecklade än mikrotubuli. Som en konsekvens mäts parametrar för aktinfilamentdynamik för hand, vilket är tidskrävande och arbetsintensivt. Antalet kärnbildningar mäts som antalet aktinfilament som finns vid en konsekvent tidpunkt för alla förhållanden. Dessa räkningar varierar mycket mellan TIRF-bildfält, men kan användas med många replikat eller för att komplettera observationer från andra polymerisationsanalyser. Kärnämnesräkningar kan också användas för mikrotubuli om försöksförhållandena saknar stabiliserade mikrotubulifrön. Aktinfilamentets förlängningshastigheter mäts som glödtrådens längd över tid från minst fyra filmramar. Hastighetsvärden överförs per mikromolärt aktin med en korrektionsfaktor på 370 underenheter för att ta hänsyn till antalet aktinmonomerer i ett mikron filament (figur 3B)32. Mätningar för att definiera de samordnade beteendena mellan aktin och mikrotubuli är mindre väldefinierade. Korrelativa analyser har dock tillämpats för att mäta sammanträffandet av båda polymererna inklusive linjeskanningar (figur 3C) eller överlappningsprogramvara 5,11,34.
Data tillgänglighet: Alla datauppsättningar som är associerade med detta arbete har deponerats i Zenodo och är tillgängliga med rimlig begäran på: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> Figur 1. Experimentella scheman: flödeskammarmontering till bildförvärv. (A) Bildbehandlingskammarens sammansättning. Uppifrån och ner: IBIDI-bildkammare tejpas längs perfusionsbrunnar (betecknas med pil); det andra (vita) lagret av tejpunderlag (vänster på i bilden som visas för att bättre orientera användare) tas bort och Epoxi appliceras vid kanten av perfusionskammaren (pil). Obs: För att lättare orientera användare var epoxin ska placeras lämnades den vita baksidan kvar i den här bilden. Det rengjorda och belagda täckglaset är fäst vid bildkammaren med beläggningssidan vänd mot insidan av perfusionsbrunnen. (B) Flödesschema som illustrerar stegen för konditionering av bildkammare för biotin-streptavidinbindningar. (C) Exempel på reaktioner som används för att erhålla TIRF-filmer av dynamiska mikrotubuli och aktinfilament. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> Figur 2. Bildsekvenser av växande aktinfilament och mikrotubuli i frånvaro eller närvaro av Tau. Time-lapse bildmontage från TIRF-analyser som innehåller 0,5 μM aktin (10% Alexa-647-aktin och 0,09% biotin-aktin märkt) och 15 μM fritt tubulin (4% HiLyte-488 märkt) i frånvaro (A) eller närvaro (B) av 250 nM Tau. Tid som förflutit från reaktionsinitiering (blandning av rör A och rör B) visas. Skalstreck, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> Figur 3. Exempelmätningar av mikrotubuli och aktinfilamentdynamik. (A) Genomsnittlig tidsprojektion av tubulinkanalen visualiserar effektivt totala mikrotubulilängder för de linjeskanningar som används för att generera kymografdiagram. Svarta prickade linjer motsvarar de två exempel kymograferna av dynamiska mikrotubuli som visas till höger. Tillväxtfaserna (solida svarta linjer) och demonteringsfaserna (prickade rosa linjer; två betecknade med rosa pilar) av mikrotubuli visas på varje kymograf. Tidsskalefält, 3 min. Längd skalstång, 10 μm. Reaktionen innehåller 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) och 15 μM fritt tubulin (4% 488-HiLyte-etikett). Endast tubulinkanalen visas. (B) Två exempel på time-lapse-bildmontage som visar enaktinfilament som aktivt polymeriserar. Förlängningshastigheter beräknas som lutningen på tomter av längden på aktinfilament över tid per mikromolärt aktin. Således måste en korrigeringsfaktor på två tillämpas på 0,5 μM aktinreaktioner för jämförelse för hastigheter som vanligtvis bestäms vid 1 μM aktinkoncentration. Exempel från fem filament visas till höger. Skalstänger, 10 μm. Reaktionen innehåller 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) och 15 μM fritt tubulin (4% 488-HiLyte-etikett). Endast aktinkanalen visas. (C) TIRF-bilder av dynamiska mikrotubuli (MT) (grön) och aktinfilament (lila) polymeriserande i frånvaro (vänster) eller närvaro av 250 nM Tau (mitten). Blå prickade linjer och pilar markerar var en linje ritades för linjeskanningsdiagrammen som motsvarar varje villkor (under varje bild). Överlappning mellan mikrotubuli och aktinregioner (visas som svart) kan poängsättas vid en viss tidpunkt per område (höger). Skalstänger, 25 μm. Reaktionerna innehåller 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) och 15 μM fritt tubulin (4% 488-HiLyte-etikett) med eller utan 250 nM Tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Detta protokoll är en guide för visualisering av dynamiskt aktin och mikrotubuli med hjälp av en in vitro-total intern fluorescensanalys (TIRF).

Visualisering av aktin- och mikrotubulikopplingsdynamik in vitro genom total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Trots många exempel på samordning undersöker de flesta studier aktin- eller mikrotubuliproteinerna individuellt. Denna metod möjliggör visualisering av båda dynamiska polymererna i en enda reaktion. Denna teknik gör det möjligt för användaren att bedöma olika reglerande proteiner för framväxande egenskaper som endast kunde ses med dynamiska versioner av aktin och mikrotubuli.Denna teknik kan utökas till att omfatta lipider eller extrakt för att komma närmare att bygga en syntetisk cell. Börja med att tina alikvoter av PEG-Silane- och Biotin-PEG-Silane-pulver och lösa upp PEG-pulverna i 80% etanol för att generera beläggningslagerlösningarna på 10 milligram per milliliter mPEG-Silane och två till fyra milligram per milliliter Biotin-PEG-Silane. Ta bort den rena täckglidningen från etanolförvaringen med pincett.Torka med kvävgas och förvara i en ren petriskål. Täck täckslipsarna med 100 mikroliter beläggningslösning och inkubera dem vid 70 grader Celsius i minst 18 timmar eller tills de används. Skär 12 remsor dubbelsidig tejp med dubbla ryggar till en längd av 24 millimeter.Ta bort ena sidan av tejpens baksida och fixera tejpbitar intill de sex spåren som finns på en ren bildkammare. Ta bort den andra tejpbiten för att exponera tejpens klibbiga sida längs varje kammarspår och placera kammartejpen uppåt på en ren yta. Blanda epoxiharts och härdarlösningar en-till-en i en liten vägbåt och använd en P1000-spets för att placera en droppe blandad epoxi mellan tejpremsorna i slutet av varje bildkammarspår.Placera sedan kammaren, tejpen eller epoxisidan uppåt på en ren yta. Ta bort en belagd täckglidning från 70 grader Celsius inkubator och skölj de belagda och obelagda ytorna på täckslipsarna med dubbeldestillerat vatten sex gånger. Torka med filtrerad kvävgas och fäst sedan på bildkammaren med täckbeläggningssidan mot tejpen.Använd en P200- eller P1000-pipettspets för att applicera tryck på det tejpade glasgränssnittet för att säkerställa en bra tätning mellan tejpen och locket. Inkubera de monterade kamrarna vid rumstemperatur i minst fem till 10 minuter så att epoxin kan täta kammarbrunnarna helt före användning. Perfusionskamrarna löper ut inom 12 till 18 timmar efter montering.Använd en perfusionspump och byt ut konditioneringslösningar sekventiellt i perfusionskammaren genom att flöda 50 mikroliter på 1% BSA för att primera bildkammaren. Ta bort överskottsbufferten från lockets låsmontagebehållare. Flöda sedan 50 mikroliter på 0,005 milligram per milliliter streptavidin och inkubera i en till två minuter vid rumstemperatur.Ta bort överskottsbufferten från behållaren. Flöde 50 mikroliter på 1% BSA för att blockera den ospecifika bindningen och inkubera i 10 till 30 sekunder. Ta bort överskottsbufferten från behållaren.Därefter flöda 50 mikroliter varm 1x TIRF-buffert och sedan 50 mikroliter stabiliserade och 50% biotinylerade mikrotubulifrön utspädda i 1x TIRF-buffert. Ställ in scenen eller objektivvärmaren för att bibehålla 35 till 37 grader Celsius temperatur i 30 minuter innan du avbildar den första biokemiska reaktionen. Ställ sedan in förvärvsintervallet till var femte sekund i 15 till 20 minuter.Ställ sedan in 488 och 647 laserexponeringar till 50 till 100 millisekunder vid 5% till 10% effekt genom att först justera polymerisationsreaktionen för att initiera aktinfilamentenheten. Skaffa bilderna på 647 nanometer och gör lämpliga justeringar. Justera sedan polymerisationsreaktionen i en andra konditionerad perfusionsbrunn för att initiera mikrotubulienheten.Visualisera vid 488 nanometer och gör lämpliga justeringar. Kombinera tre mikroliter av 10 mikromolärt 488 tubulin med 7,2 mikroliter alikvot av 100 mikromolar fluorescerande omärkt tubulin högst 15 minuter före användning. Kombinera sedan tre mikroliter av utspätt biotinrelaterat aktin i lämpliga volymer fluorescerande omärkt och märkt aktin så att den slutliga blandningen blir 12,5 mikromolärt totalt aktin med 10% till 30% fluorescerande etikett.Förbered cytoskelettblandningen genom att kombinera två mikroliter av 12,5 mikromolär aktinblandningsstock med tubulinberedningen högst 15 minuter före avbildning. Förvara på is tills den används. Förbered proteinreaktionsblandningen genom att kombinera alla andra experimentella komponenter och proteiner, inklusive 2x TIRF-buffert, antiblekmedel, nukleotider, buffertar och tillbehörsproteiner.Inkubera cytoskelettblandningen och proteinreaktionsblandningen separat vid 37 grader Celsius i 30 till 60 sekunder. För att initiera reaktionen tillsätt innehållet i proteinreaktionsblandningen till cytoskelettblandningen och blanda den. Flöde 50 mikroliter av reaktionsblandningen innehållande 1x TIRF-buffert kompletterad med 15 mikromolfria tubulin, en millimolär GTP, 0,5 mikromolär aktinmonomer och lämpliga volymer buffertkontroller till perfusionskammaren.Spela in en time lapse-film med hjälp av mikroskopprogramvara för att förvärva var femte sekund i 15 till 20 minuter. Konditionera en ny perfusionsbrunn och ersätt buffertvolymen med det reglerande proteinet av intresse och buffertkontroller. Förvärva för att bedöma de reglerande proteinerna för framväxande aktinmikrotubulifunktioner.Exempelmätningar av mikrotubuli och aktinfilamentdynamik visas i dessa bilder. Den genomsnittliga tidsprognosen för tubulinkanalen visualiserar effektivt de totala mikrotubulilängderna för linjeskanningarna som används för att generera kymografdiagrammen. Svart prickade linjer motsvarar de två exempel kymograferna för de dynamiska mikrotubuli.Tillväxt- och demonteringsfaserna för mikrotubuli visas på varje kymograf. Två exempel på tidsfördröjningsbildmontage som visar enstaka aktinfilament som aktivt polymeriserar visas här. Töjningshastigheter beräknas som lutningen på diagrammen för längden på aktinfilament över tiden per mikromolärt aktin.Således måste en korrigeringsfaktor på två tillämpas på 0,5 mikromolära aktinreaktioner för att jämföra de hastigheter som vanligtvis bestäms vid den ena mikromolära aktinkoncentrationen. Exempel från fem filament visas här. Total intern reflektionsfluorescens eller TIRF-bilder av de dynamiska mikrotubuli i aktinfilament som polymeriserar i frånvaro eller närvaro av 250 nanomolar Tau visas här.Blå prickade linjer och pilar markerar bär en linje ritades för linjeskanningsdiagrammen som motsvarar varje villkor. Överlappning mellan mikrotubuli i aktinregionerna kan poängsättas vid en viss tidpunkt per område. Cytoskelettproteiner, särskilt aktin, mikrotubuli och deras regulatorer är mycket känsliga för frys- / upptiningscykler.För konsistens och framgång, använd mycket rena och korrekt lagrade proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Mätning av proteinbindning till F-aktin genom sam-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerisation av F-aktin på tidig Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vävnader färgas med självlysande konjugerade Oligothiophenes av Hyperspektrala Confocal Microscopy och fluorescens livstid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Hög genomströmning total intern reflektions fluorescens och direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi med ett Fotoniskt chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisera diffusionell dynamik av guldnanroder på cellmembran med hjälp av en nanopartikel Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Avbildning av podocytiska proteiner Nephrin, Actin och Podocin med expansionsmikroskopi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosinspecifika anpassningar av in vitro-fluorescensmikroskopibaserade motilitetsanalyser

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...