Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 EY028100 و EY024963 و EY031765) إلى JC. تم دعم ZW من قبل مؤسسة Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في مستشفى بوسطن للأطفال لتوليد المجهر الضوئي وصور EM (الشكل 3). يمكن الحصول على بروتوكولات للدراسات في الجسم الحي من Wang et al.24. تمت الموافقة على جميع التجارب ال?...

يلعب BRB دورا أساسيا في صحة الشبكية ومرضها. أثبتت التقنيات المخبرية التي تقيم نفاذية الأوعية الدموية أنها أدوات حاسمة في الدراسات المتعلقة بتطوير الحاجز (BRB / BBB) ووظيفته. يمكن استخدام الإجراء الموصوف هنا لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء ترانسسيتوزيس EC أو تقييم المعدلات الجزيئية ذ?...

شبكية العين البشرية هي واحدة من أعلى الأنسجة التي تتطلب الطاقة في الجسم. يتطلب الأداء السليم للشبكية العصبية إمدادات فعالة من الأكسجين والمواد المغذية إلى جانب تدفق مقيد من الجزيئات الأخرى التي يحتمل أن تكون ضارة لحماية بيئة الشبكية ، والتي يتم توسطها عبر حاجز الدم والشبكية (BRB)1. على غرار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) في الجهاز العصبي المركزي ، يعمل BRB كحاجز انتقائي في العين ، حيث ينظم حركة الأيونات والماء والأحماض الأمينية والسكر داخل وخارج شبكية العين. يحافظ BRB أيضا على توازن الشبكية وامتيازه المناعي من خلال منع التعرض لعوامل الدورة الدموية مثل الخلايا المناعية والأجسام المضادة ومسببات الأمراض الضارة2. يساهم خلل BRB في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين الوعائية ، مثل اعتلال الشبكية السكري ، والتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، واعتلال الشبكية الخداجي (ROP) ، وانسداد الوريد الشبكي ، والتهاب القزحية ، مما يؤدي إلى وذمة وعائية المنشأ وفقدان البصر اللاحق3،4،5.
يتكون BRB من حاجزين منفصلين لشبكتين وعائيتين عينيتين متميزتين ، على التوالي: الأوعية الدموية الشبكية و choriocapillaris المعششة تحت شبكية العين. يتكون BRB الداخلي (iBRB) في المقام الأول من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الشبكية (RMECs) التي تبطن الأوعية الدموية الدقيقة في الشبكية ، والتي تغذي الطبقات العصبية الداخلية للشبكية. من ناحية أخرى ، تشكل ظهارة صبغة الشبكية المكون الرئيسي ل BRB الخارجي ، والذي يقع بين شبكية العين الحسية العصبية و choriocapillaris2. بالنسبة ل iBRB ، يحدث النقل الجزيئي عبر RMECs من خلال كل من الطرق شبه الخلوية وعبر الخلوية (الشكل 1). تعتمد الدرجة العالية من انتقائية المواد عبر iBRB على (i) وجود مجمعات البروتين الموصلة التي تقيد النقل شبه الخلوي بين الخلايا البطانية المجاورة (ECs) ، و (ii) مستويات التعبير المنخفضة لوسطاء الكهف والناقلات والمستقبلات داخل الخلايا البطانية التي تحافظ على معدلات منخفضة من النقل عبر الخلايا1،6،7،8 . تتكون مجمعات الوصلات التي تنظم التدفق شبه الخلوي من تقاطعات ضيقة (كلودين ، أوكلودين) ، تلتصق بالتقاطعات (كادهيرين VE) ، وتقاطعات الفجوة (connexins) ، مما يسمح بمرور الماء والمركبات الصغيرة القابلة للذوبان في الماء. في حين تنتشر الجزيئات الصغيرة المحبة للدهون بشكل سلبي عبر المناطق الداخلية من RMECs ، يتم تنظيم حركة الجزيئات الأكبر محبة للدهون والمحبة للماء من خلال مسارات عبر البطانية مدفوعة ب ATP بما في ذلك النقل الحويصلي وناقلات الغشاء 5,9.
يمكن تصنيف الترانسسيتوسيس الحويصلي على أنه ترانسكيتوسيس كهفي بوساطة الكافولين، وترانسكتوري كنزية كليبرات العين المعتمد على الكلاثرين (وبوساطة المستقبلات)، وندرة الخلايا الكبيرة المستقلة عن الكلاثرين (الشكل 2). تتضمن عمليات النقل الحويصلي هذه حويصلات مختلفة الحجم ، حيث تكون الماكروبينوسومات هي الأكبر (تتراوح من 200-500 نانومتر) وتكون الكهف هي الأصغر (بمتوسط 50-100 نانومتر) ، في حين تتراوح الحويصلات المغلفة بالكلاثرين من 70-150 نانومتر10. Caveolae هي غزوات غشاء بلازما غنية بالدهون على شكل قارورة مع معطف بروتين ، يتكون في المقام الأول من caveolin-1 الذي يربط الكوليسترول الغشائي الدهني والبروتينات الهيكلية والإشارات الأخرى عبر مجال سقالات الكهف11. تعمل الكافيولين جنبا إلى جنب مع الكافين المتصل محيطيا لتعزيز استقرار الكهف في غشاء البلازما12. قد تحمل الأغشية الكهفية أيضا مستقبلات لجزيئات أخرى مثل الأنسولين والألبومين والبروتينات الدهنية المتداولة بما في ذلك البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) والبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) للمساعدة في حركتها عبر الخلايا البطانية13. أثناء التطوير ، يعتمد تكوين BRB الوظيفي على قمع EC transcytosis8. وبالتالي ، فإن بطانة الشبكية الناضجة تحتوي على مستويات منخفضة نسبيا من مستقبلات الكافولا والكافولين-1 والألبومين فيما يتعلق بالخلايا البطانية الأخرى في ظل الظروف الفسيولوجية ، مما يساهم في خصائصها الحاجزة 4,9.
نظرا لأن انهيار iBRB هو السمة المميزة الرئيسية للعديد من حالات العين المرضية ، فمن الضروري تطوير طرق لتقييم نفاذية الأوعية الدموية في شبكية العين في الجسم الحي وفي المختبر. تساعد هذه الأساليب على توفير رؤى محتملة حول آليات سلامة BRB المعرضة للخطر وتقييم فعالية الأهداف العلاجية المحتملة. عادة ما تستخدم فحوصات التصوير الحالية في الجسم الحي أو فحوصات تسرب الأوعية الدموية الكمية الفلورسنت (فلوريسين الصوديوم والدكستان) ، أو قياس الألوان (صبغة إيفانز الزرقاء وركيزة بيروكسيديز الفجل [HRP]) ، أو المقتفيات الإشعاعية14 للكشف عن الإسراف من الأوعية الدموية إلى أنسجة الشبكية المحيطة باستخدام التصوير المجهري أو في محللات الأنسجة المعزولة. يجب أن يكون المقتفي المثالي لقياس سلامة الأوعية الدموية خاملا وكبيرا بما يكفي لتخلل الأوعية المعرضة للخطر بحرية أثناء حبسه داخل الشعيرات الدموية السليمة والسليمة. تستخدم الطرق التي تستخدم فلوريسين الصوديوم أو الفلوريسين إيزوثيوسيانات ديكستران المقترن (FITC-dextran) في تصوير الأوعية الدموية الحية للقاع (FFA) أو حوامل الشبكية المسطحة المعزولة على نطاق واسع لقياس إسراف الشبكية في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. يتميز FITC-dextran بأنه متاح في أوزان جزيئية مختلفة تتراوح من 4-70 kDa للدراسات الانتقائية للحجم15،16،17. FITC-albumin (~ 68 kDa) هو متتبع بروتين بديل كبير الحجم ذو صلة بيولوجية بدراسات تسرب الأوعية الدموية18. تعتمد صبغة إيفانز بلو ، التي يتم حقنها داخل القلب19 ، أو في المدار الرجعي ، أو من خلال الوريد الذيل 20 ، أيضا على ارتباطها بالألبومين الداخلي المنشأ لتشكيل جزيء كبير يمكن تحديده كميا عن طريق الكشف عن الطيف الضوئي في الغالب أو ، بشكل أقل شيوعا ، المجهر الفلوري في حوامل مسطحة20،21. ومع ذلك، فإن منهجيات التصوير الكمي أو الضوئي هذه غالبا ما لا تميز النقل شبه الخلوي عن النقل عبر البطانة. بالنسبة للتحليل المحدد لانتقال الخلايا مع التصور فوق الهيكلي للحويصلات المتحولة عبر الخلايا ، تستخدم جزيئات التتبع مثل HRP عادة لتحديد موقع الحويصلات المتحولة داخل الخلايا البطانية التي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الإلكتروني 22،23،24 (الشكل 3A-C).
يمكن أن يوفر تطوير واستخدام نماذج iBRB في المختبر لتقييم نفاذية الخلايا البطانية تقييما قويا وعالي الإنتاجية لاستكمال التجارب في الجسم الحي والمساعدة في التحقيق في المنظمين الجزيئيين لتسرب الأوعية الدموية. تشمل المقايسات الشائعة الاستخدام لتقييم النقل شبه الخلوي وسلامة التقاطعات الضيقة المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) ، وهو مقياس للتوصيل الأيوني (الشكل 4) 2,25 ، واختبار تسرب الأوعية الدموية في المختبر باستخدام مقتفيات الفلورسنت الصغيرة ذات الوزن الجزيئي26. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام اختبارات transcytosis القائمة على الترانسفيرين نمذجة BBB لاستكشاف transcytosis المعتمد على clathrin27. على الرغم من ذلك ، فإن الفحوصات لتقييم BRB ، وبشكل أكثر تحديدا ، transcytosis الكهفية EC شبكية العين في المختبر محدودة.
في هذه الدراسة ، نصف فحص EC transcytosis باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMECs) كنموذج في المختبر لتحديد نفاذية iBRB و EC transcytosis. يعتمد هذا الفحص على قدرة HRMECs على نقل الترانسفيرين أو HRP عبر مسارات transcytosis التي تتوسط فيها المستقبلات أو المعتمدة على الكهف ، على التوالي (الشكل 2). تم احتضان HRMECs المستزرعة إلى الالتقاء الكامل في الغرفة القمية (أي إدراج المرشح) مع الترانسفيرين المترافق مع الفلورسنت (Cy3-Tf) أو HRP لقياس شدة التألق المقابلة لمستويات الترانسفيرين أو HRP المنقولة إلى الغرفة السفلية من خلال EC transcytosis فقط. يمكن تأكيد التقاء الطبقة الأحادية للخلية عن طريق قياس TEER ، مما يشير إلى سلامة التقاطع الضيق25. لإثبات تقنية اختبار TEER و transcytosis ، تم استخدام المعدلات الجزيئية المعروفة لنفاذية الأوعية الدموية و transcytosis EC ، بما في ذلك عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)28 وتلك الموجودة في إشارات Wnt (روابط Wnt: Wnt3a و Norrin)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

يساهم خلل الحاجز الدموي الشبكي (BRB) في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين الوعائية ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى وذمة شبكية العين وفقدان البصر اللاحق. يتكون الحاجز الدموي الداخلي للشبكية (iBRB) بشكل أساسي من بطانة وعائية شبكية العين ذات نفاذية منخفضة في ظل الظروف الفسيولوجية. يتم تنظيم هذه الميزة من النفاذية المنخفضة بإحكام والحفاظ عليها من خلال معدلات منخفضة من النقل شبه الخلوي بين الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المجاورة للشبكية ، وكذلك النقل عبر الخلايا (transcytosis) من خلالها. قد يوفر تقييم نفاذية الحاجز عبر الخلوي في الشبكية رؤى أساسية حول سلامة iBRB في الصحة والمرض. في هذه الدراسة ، نصف فحص الخلايا البطانية (EC) ، كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية iBRB ، باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية (HRMECs). يقيم هذا الفحص قدرة HRMECs على نقل الترانسفيرين وبيروكسيديز الفجل (HRP) في عمليات النقل عبر الخلايا بوساطة المستقبلات والكهف ، على التوالي. تم احتضان مركبات HRMECs المتقاربة بالكامل المستزرعة على غشاء مسامي مع ترانسفيرين موسوم بالفلورسنت (transcytosis المعتمد على clathrin) أو HRP (transcytosis بوساطة الكهف) لقياس مستويات الترانسفيرين أو HRP المنقولة إلى الغرفة السفلية ، مما يدل على مستويات transcytosis عبر الطبقة الأحادية EC. تم تعديل إشارات Wnt ، وهي مسار معروف ينظم iBRB ، لإظهار طريقة فحص transcytosis القائمة على HRP بوساطة الكهف. قد يوفر فحص EC transcytosis الموصوف هنا أداة مفيدة للتحقيق في المنظمين الجزيئيين لنفاذية EC وسلامة iBRB في أمراض الأوعية الدموية ولفحص أنظمة توصيل الأدوية.

تظهر صور EM للبطانة الوعائية الشبكية النقل الحويصلي عبر الخلوي والحويصلات الكهفية في الخلايا البطانية في الجسم الحي. يمكن تصور ترانسسيتوسيس EC في الجسم الحي داخل المقاطع العرضية للشبكية مع راسب بني داكن يعكس الأوعية الدموية المحتوية على HRP تحت المجهر...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

يوضح هذا البروتوكول مقايسة عبر الخلايا البطانية في المختبر كنموذج لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الداخلي للشبكية عن طريق قياس قدرة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية على نقل بيروكسيديز الفجل عبر الخلايا في عمليات النقل عبر الخلايا بوساطة الكهف.

فحص نقل الخلايا البطانية كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الشبكي الداخلي

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

يوفر هذا البروتوكول نموذجا مفيدا قائما على الخلايا لدراسة وظيفة ونفاذية الحواجز الوعائية الانتقائية مثل الحاجز الدموي الشبكي أو الحاجز الدموي الدماغي مع التركيز بشكل خاص على ترانسكيتوسيس البطانة. هذا الفحص سهل الإعداد والاستخدام لا يتطلب حية. يمكن استخدامه للتحقيق في مختلف المنظمين الجزيئيين لنفاذية الخلايا البطانية و transcytosis التي تؤثر على سلامة الحاجز الدموي الداخلي للشبكية.يمكن أن يوفر هذا الفحص نظرة ثاقبة على بيولوجيا الأوعية الدموية وأبحاث العين والدماغ ، مما يسمح بفهم أفضل لآليات الجزيئات الكامنة وراء التحكم في BRB BBB واستكشاف توصيل الدواء المحتمل عبر الحواجز. للبدء ، قم بإعداد إدخالات مرشح زراعة الخلايا لبذر الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية أو HRMECs ، عن طريق طلاء كل إدراج ب 200 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ لمدة 30 دقيقة تحت غطاء التدفق الرقائقي. تأكد من أن المحلول يغطي السطح السفلي بالكامل لإدراج الفلتر.خذ طبق بتري مع HRMECs المستزرعة المحتضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، واستنشق وسائط النمو. شطف الخلايا بلطف مرتين مع 10 ملليلتر من 1X PBS تحت غطاء التدفق الرقائقي للتخلص من الخلايا العائمة أو الميتة المحتملة. افصل الخلايا بمحلول 0.5 إلى 1 ملليلتر من محلول 0.25٪ من التربسين-EDTA وضع طبق بتري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 دقائق.قم بإخماد نشاط التربسين عن طريق إضافة 4.5 إلى 9 ملليلتر من وسائط النمو ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر باستخدام ماصة 10 ملليلتر. تدور الخلايا في 200 مرة غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة supernatant بعناية وأعد تعليق الكريات في 3 ملليلتر من وسائط النمو.احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم اليدوي أو عداد الخلايا الآلي والبذور بكثافة 40،000 خلية لكل إدراج مرشح. حجم تعليق الخلية لكل إدراج هو 250 ميكرولتر. قم بشفط محلول الطلاء من الآبار التي تحتوي على إدخالات نفاذة ونقل 250 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل إدراج ، ثم أضف متوسطا فقط إلى أحد الإدخالات ، والذي سيتم استخدامه كعنصر تحكم فارغ للمقاومة الكهربائية عبر البطانية ، أو TEER ، القياس.في الوقت نفسه ، أضف أيضا 750 ميكرولتر من الوسط لكل بئر في الغرف القاعدية. احتفظ بالصفيحة المكونة من 24 بئرا مع إدخالات نفاذة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 7 إلى 12 يوما حتى تصبح الخلايا المستزرعة ملتقية تماما ويتم تحقيق قيمة TEER المطلوبة البالغة حوالي 20 أوم لكل سنتيمتر مربع. قبل قياسات TER، ضع الصفيحة المحتوية على 24 بئرا تحتوي على خلية في غطاء التدفق الرقائقي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة لتحقيق توازن درجة الحرارة.لقياس TEER ل HRMECs ، باستخدام نظام مقاومة كهربائية ظهاري فولت / أوم متر ، قم بتوصيل القطب بالعداد ، وقم بموازنة القطب الكهربائي عن طريق نقعه أولا في 70٪ من الإيثانول لمدة 15 إلى 20 دقيقة ثم غمره لفترة وجيزة في وسط نمو EGM لزراعة الخلايا. قم بإجراء قياس TEER عن طريق غمر القطب الكهربائي بعناية ، بحيث يكون الطرف الأقصر في الإدراج ويلامس الطرف الأطول قاع البئر. قم بقياس المقاومة عبر عنصر التحكم الفارغ أولا ، ثم لكل إدراج ، قم بقياس TEER في ثلاثة أضعاف.عند الوصول إلى الالتقاء مع قيم TEER حوالي 20 أوم سنتيمتر مربع ، يحرم المصل الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون باستخدام 0.5٪ FBS في EBM في كلتا الغرفتين قبل العلاج بالليكاند. تم استخدام EBM المخفض في المصل طوال فترة الفحص. احتضن الخلايا باستخدام الوسط المختزل بالمصل في الغرفة القمية باستخدام علامة السيانين الفلورسنت 3-tag لنقل الليجند لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.بعد غسل الطبقة الأحادية بشكل قمي وباسولي 4 مرات باستخدام الوسط المختزل بالمصل ، أضف وسطا طازجا إلى إدخالات المرشح التي تحتوي على الخلايا وانقل الإدخالات إلى آبار جديدة من صفيحة 24 بئرا تحتوي على وسط مختزل بالمصل تم تسخينه مسبقا. احتضن الخلايا لمدة 90 دقيقة أخرى في الحاضنة ثم جمع الوسط من الغرفة القاعدية. سجل شدة التألق للمحلول من الغرفة القاعدية باستخدام كاشف التألق.عند الوصول إلى الالتقاء مع قيم TEER حوالي 20 أوم سنتيمتر مربع ، يحرم المصل الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون باستخدام 0.5٪ FBS في EBM في كلتا الغرفتين قبل العلاج باستخدام الليكاند. تم استخدام EBM المخفض في المصل طوال فترة الفحص. بعد ذلك ، عالج الخلايا في الغرفة القمية بالعلاجات المطلوبة وضوابط السيارة.أضف 5 ملليغرام لكل ملليلتر من بيروكسيديز الفجل ، أو HRP ، إلى الخلايا ، واحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف وسطا جديدا مخفضا للأمصال إلى الغرفة القمية وانقل الإدخالات إلى بئر طازجة تحتوي على وسائط مسبقة الاحترار. احتضن الطبقة الأحادية لمدة 90 دقيقة إضافية في الحاضنة.بعد جمع الوسط من الغرفة القاعدية ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة البيروكسيديز الفلوروجينية HRP إلى الوسط الذي تم جمعه واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أوقف التفاعل باستخدام 100 ميكرولتر من محلول التوقف واكتشف مستويات منتج تفاعل الركيزة HRP في الوسائط باستخدام قارئ لوحة التألق. قبل إظهار اختبارات transcytosis في المختبر ، يتم عرض تصور transcytosis الخلايا البطانية في شبكية العين كمعلومات أساسية.هنا ، تظهر صورة المجهر الضوئي تجويف الأوعية الدموية المملوء ب HRP من قسم شبكية العين للفأر من النوع البري البالغ من العمر 3 أشهر والملطخ ب DAB. تم حقن HRP بأثر رجعي في المدار. يمكن رؤية الأوعية الشبكية المملوءة ب HRP على أنها تترسب باللون البني الداكن تحت المجهر الضوئي.يظهر قسم المجهر الإلكتروني الناقل الرقيق للغاية الأوعية العابرة للخلايا المملوءة ب HRP مع RMECs التي تصور ترانسسيتوزيس EC عبر حاجز الدم والشبكية الداخلي. هنا ، من المحتمل أن تعكس الحويصلة الكبيرة macropinosome وخلية دم حمراء على جانب اللومينول. تظهر صورة TeM حويصلات صغيرة عبر الخلايا مملوءة ب HRP ، من المحتمل أن تكون حويصلات كهفية ، داخل RMEC.يوضح تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية للأجسام المضادة CAV-1 و isolectin B4 توطين CAV-1 ، وهي علامة على حويصلات الكهف في الأوعية الدموية الشبكية ، في شبكية العين من النوع البري من النوع البريدي البالغة من العمر 3 أشهر. تظهر صورة TeM ل CAV-1 المسمى بالذهب المناعي داخل الخلايا البطانية للشبكية هنا مع صورة مكبرة لحويصلة الكهف الإيجابية CAV-1. بالنسبة لفحص ترانسكسيتوسيس EC بوساطة الكلاثرين في HRMECs باستخدام transferrin، هنا، تظهر صورة المجهر الفلوري ترانسفيرين Cy3 المتكامل بلون أحمر داخل HRMECs ملطخة ب DAPI باللون الأزرق.بالنسبة لانتقال الخلايا EC بوساطة الكهف باستخدام HRP ، يتم استخدام إشارات Wnt هنا كمثال لإثبات الفحص. تم العثور على إشارات Wnt مؤخرا لتنظيم ترانسكيتوسيس EC بوساطة الكهف. تمت معالجة الخلايا باستخدام منشط مسار Wnt Wnt3a المشروط المتوسط والمؤتلف Norrin، مع أو بدون مثبط إشارات Wnt XAV939 وضوابطها التفاعلية.خفضت منشطات Wnt مستوى ترانسكيتوسيس القائم على HRP ، والتي تم عكسها بواسطة XAV939. يعد قياس TEER الصحيح أمرا بالغ الأهمية لتحديد سلامة الطبقة الأحادية. يتأثر بشكل كبير بعوامل مختلفة مثل التعامل غير السليم ، وتقلبات درجات الحرارة ، ووسط الثقافة ، ومدة الثقافة ، وما إلى ذلك.يمكن تعديل هذا الفحص كثقافة مشتركة أو أنظمة ثقافة عضوية 3D تحاكي في ظروف الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

على<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; الفحص لفحص الدم نفاذية سفينة

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه<em&gt; في المختبر</em&gt; صدمة إصابات الدماغ نموذج من حاجز الدم في الدماغ

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

وضع ما يصل إلى<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الفئران حاجز الدم في الدماغ (BBB): التركيز على BBB عدم النفاذ والنقل مستقبلات بوساطة

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

الأوكسجين الجلوكوز الحرمان وعودة التأكسج باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; الإسكيمية-ضخه من الإصابات نموذج لدراسة الدم في الدماغ الحاجز الجنسي لدى الرجال

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

نموذج الحاد الشبكية لتقييم الدم الشبكية الحاجز خرق والمحتملة أدوية لعلاج

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

حديثي الولادة الفئران كوكلار تقنية إكسبلانت باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; أداة الفحص في أبحاث السمع

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...