Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
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这项工作得到了NIH对JC的资助（R01 EY028100，EY024963和EY031765）。ZW得到了圣殿骑士之眼基金会职业入门补助金的支持。

所有动物实验均由波士顿儿童医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，用于生成光学显微镜和EM图像（图3）。 体内 研究的方案可以从Wang等人那里获得24。所有涉及人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的实验均获得波士顿儿童医院机构生物安全委员会（IBC）的批准。
1. 试剂的制备
<ol><li>用于包衣组织培养皿的...

BRB在视网膜健康和疾病中起着至关重要的作用。评估血管通透性的体外技术已被证明是屏障（BRB/BBB）发育和功能研究中的关键工具。这里描述的程序可用于研究EC转吞作用的分子机制或评估影响BRB通透性的相关分子调节剂。体外EC转吞测定与体内测定或用于评估血管通透性的技术相比具有多种优势。它们以高通量快速执行，可用于分析具有遗传和药理调节的特定信号通路的许?...

人类视网膜是人体中能量需求最高的组织之一。神经视网膜的正常运作需要有效的氧气和营养物质供应以及其他潜在有害分子的限制通量来保护视网膜环境，这是通过血液 - 视网膜屏障（BRB）介导的1。与中枢神经系统中的血脑屏障（BBB）类似，BRB在眼睛中充当选择性屏障，调节离子，水，氨基酸和糖进出视网膜的运动。BRB还通过防止暴露于循环因子（如免疫细胞，抗体和有害病原体）来维持视网膜稳态及其免疫特权2。BRB 功能障碍有助于多种血管性眼病的病理生理学，例如糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性 （AMD）、早产儿视网膜病变 （ROP）、视网膜静脉阻塞和葡萄膜炎，导致血管源性水肿和随后的视力丧失3，4，5。
BRB由两个独立的屏障组成，分别用于两个不同的眼血管网络：视网膜脉管系统和视网膜下方的开窗脉络膜毛细血管。内部BRB（iBRB）主要由视网膜微血管系统衬里的视网膜微血管内皮细胞（RMEC）组成，其滋养视网膜内部神经元层。另一方面，视网膜色素上皮形成外BRB的主要成分，位于神经感觉视网膜和脉络膜毛细血管之间2。对于iBRB，跨RMEC的分子转运通过细胞旁和跨细胞途径发生（图1）。iBRB的高度物质选择性取决于（i）连接蛋白复合物的存在，这些复合物限制了相邻内皮细胞（ECs）之间的细胞旁转运，以及（ii）内皮细胞内保持低跨细胞转运速率的洞穴介质，转运蛋白和受体的低表达水平1，6，7，8.调节细胞旁通量的连接复合物由紧密连接（claudins，occludins），粘附连接（VE cadherins）和间隙连接（连接蛋白）组成，允许水和小的水溶性化合物通过。虽然小的亲脂性分子被动地扩散到RMEC的内部，但较大的亲脂性和亲水性分子的运动受到ATP驱动的跨内皮途径的调节，包括囊泡运输和膜转运蛋白5，9。
水疱转胞作用可分为洞穴蛋白介导的洞穴转胞作用、网格蛋白依赖性（和受体介导的）转胞作用和网格蛋白依赖性巨胞细胞增多症（图 2）。这些囊泡转运过程涉及不同大小的囊泡，其中巨松体最大（范围为200-500nm），洞穴最小（平均为50-100nm），而网格蛋白包被的囊泡范围为70-150nm10。洞穴是带有蛋白质外壳的烧瓶形富含脂质的质膜内陷，主要由洞穴蛋白-1组成，其通过其洞穴蛋白支架结构域结合脂质膜胆固醇和其他结构和信号蛋白11。洞穴与外周附着的洞穴一起工作，以促进质膜12处的洞穴稳定。洞穴膜还可能携带其他分子的受体，如胰岛素、白蛋白和循环脂蛋白，包括高密度脂蛋白 （HDL） 和低密度脂蛋白 （LDL），以帮助它们在内皮细胞中移动13。在发育过程中，功能性BRB的形成取决于EC转吞作用的抑制8。因此，在生理条件下，成熟的视网膜内皮相对于其他内皮细胞具有相对较低的洞穴、洞穴蛋白-1 和白蛋白受体水平，这有助于其屏障特性4，9。
由于iBRB分解是许多病理性眼病的主要标志，因此开发评估体内和体外视网膜血管通透性的方法至关重要。这些方法有助于提供对BRB完整性受损机制的可能见解，并评估潜在治疗靶点的疗效。目前的体内成像或定量血管渗漏测定通常采用荧光（荧光素钠和葡聚糖）、比色法（埃文斯蓝染料和辣根过氧化物酶[HRP]底物）或放射性示踪剂14，以通过显微镜成像或分离的组织裂解物检测从脉管系统外渗到周围视网膜组织中。用于量化血管完整性的理想示踪剂应该是惰性的，并且足够大，以便在限制在健康和完整的毛细血管内时自由渗透受损血管。在活眼底荧光素血管造影（FFA）或分离视网膜平面支架中使用荧光素钠或异硫氰酸荧光素偶联葡聚糖（FITC-葡聚糖）的方法广泛用于定量体内或离体视网膜外渗。FITC-葡聚糖的优点是具有不同的分子量范围，范围为4-70 kDa，用于大小选择性研究15，16，17。FITC白蛋白（~68 kDa）是一种替代的大尺寸蛋白质示踪剂，与血管渗漏研究具有生物学相关性18。埃文斯蓝染料，心内注射19，眶后或通过尾静脉20，也依赖于其与内源性白蛋白的结合形成一个大分子，该分子可以通过大多数分光光度法检测或不太常见的荧光显微镜在平面安装20，21中进行定量。然而，这些定量或光成像方法通常不能区分细胞旁转运和经内皮转运。对于通过转吞囊泡的超微结构可视化对转吞作用进行特异性分析，通常使用诸如HRP之类的示踪分子来定位内皮细胞内的转吞囊泡，可以在电子显微镜下观察到22，23，24（图3A-C）。
开发和使用体外iBRB模型来评估内皮细胞通透性可以提供稳健和高通量的评估，以补充体内实验，并有助于研究血管渗漏的分子调节因子。评估紧密连接的细胞旁转运和完整性的常用测定包括跨内皮电阻（TEER），离子电导的量度（图4）2，25，以及使用小分子量荧光示踪剂的体外血管渗漏测定26。此外，基于转铁蛋白的转胞作用测定建模BBB已被用于探索网格蛋白依赖性转吞27。尽管如此，体外评估BRB和更具体地说，视网膜EC洞穴转吞作用的测定是有限的。
在这项研究中，我们描述了使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）作为 体外 模型的EC转吞测定，以确定iBRB通透性和EC转吞作用。该测定依赖于HRMEC分别通过受体介导或洞穴依赖性转吞途径转运转铁蛋白或HRP的能力（图2）。将培养至在顶室（即滤芯）中完全汇合的HRMEC与荧光偶联转铁蛋白（Cy3-Tf）或HRP一起孵育，以测量对应于仅通过EC转吞作用转移到底室的转铁蛋白或HRP水平的荧光强度。通过测量TEER可以确认细胞单层的汇合度，表明紧密的连接完整性25。为了证明TEER和转胞测定技术，使用了已知的血管通透性和EC转吞作用的分子调节剂，包括血管内皮生长因子（VEGF）28 和Wnt信号传导（Wnt配体：Wnt3a和Norrin）29。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

血液 - 视网膜屏障（BRB）的功能障碍有助于几种血管性眼病的病理生理学，通常导致视网膜水肿和随后的视力丧失。内部血视网膜屏障（iBRB）主要由生理条件下通透性较低的视网膜血管内皮组成。这种低通透性的特征受到严格调节，并通过相邻视网膜微血管内皮细胞之间的低细胞旁转运速率以及通过它们的跨细胞转运（转胞作用）来维持。视网膜跨细胞屏障通透性的评估可能为iBRB在健康和疾病中的完整性提供基本见解。在这项研究中，我们描述了一种内皮细胞（EC）转吞测定，作为使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）评估iBRB通透性的 体外 模型。该测定分别评估了HRMEC在受体和洞穴介导的跨细胞运输过程中运输转铁蛋白和辣根过氧化物酶（HRP）的能力。将培养在多孔膜上的完全融合的HRMEC与荧光标记的转铁蛋白（网格蛋白依赖性转胞作用）或HRP（洞穴介导的转胞作用）一起孵育，以测量转移到底室的转铁蛋白或HRP的水平，指示EC单层的转吞水平。Wnt信号传导是一种已知的调节iBRB的途径，被调节以证明洞穴介导的基于HRP的转吞测定方法。此处描述的EC转吞测定可为研究血管病理学中EC通透性和iBRB完整性的分子调节因子以及筛选药物递送系统提供有用的工具。

视网膜血管内皮的EM图像显示体内内皮细胞中的转细胞囊泡转运和海绵囊泡。 EC转吞可以在体内视网膜横截面内可视化，深棕色沉淀物在光学显微镜下反射含HRP的血管（图3A），并使用透射电子显微镜（TEM）作为指示含HRP的跨胞细胞囊泡的电子致密沉淀物（图3B，C），从而证明EC在iBRB上?...

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Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

该协议说明了 体外 内皮细胞转吞测定作为评估内部血 - 视网膜屏障通透性的模型，通过测量人视网膜微血管内皮细胞在洞穴介导的跨细胞运输过程中跨细胞运输辣根过氧化物酶的能力。

内皮细胞转吞测定作为 体外 模型评估内部血-视网膜屏障通透性

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

该协议为研究选择性血管屏障（如血视网膜或血脑屏障）的功能和通透性提供了一个有用的基于细胞的模型，特别关注内皮转吞作用。该测定易于设置和使用，无需活体动物。它可用于研究影响内部血视网膜屏障完整性的内皮细胞通透性和转吞作用的各种分子调节剂。该测定可以为血管生物学以及眼睛和大脑研究提供见解，从而更好地了解BRB BBB控制的分子机制，并探索跨越屏障的潜在药物递送。首先，通过在层流罩下用200微升0.1%明胶溶液涂覆每个插入物30分钟，准备用于接种人视网膜微血管内皮细胞或HRMEC的细胞培养过滤器插入物。确保溶液覆盖过滤器插件的整个底面。取一个培养皿，培养的HRMEC在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育，并吸出生长培养基。在层流罩下用10毫升1X PBS轻轻冲洗细胞两次，以去除潜在的漂浮或死细胞。用0.5至1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液解离细胞，并将培养皿置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中5分钟。通过加入4.5至9毫升生长培养基来淬灭胰蛋白酶活性，并使用10毫升移液管将细胞悬液转移到15毫升管中。在室温下以200倍g离心细胞5分钟。小心地除去上清液并将沉淀重悬于3毫升生长培养基中。使用手动血细胞计数器或自动细胞计数器和接种，每个滤芯的密度为40， 000个细胞，计数细胞数量。每个插入物的细胞悬液体积为250微升。从含有渗透性插入物的孔中吸出涂层溶液，每个插入物转移250微升细胞悬液，然后仅向其中一个插入物中加入培养基，该插入物将用作跨内皮电阻或TEER测量的空白对照。同时，在基底外侧室中每孔添加750微升培养基。将带有渗透性插入物的 24 孔板在培养箱中以 37 摄氏度和 5% 二氧化碳保持 7 至 12 天，直到培养的细胞完全融合并达到所需的 TEER 值约为每平方厘米 20 欧姆。在TEER测量之前，将含有细胞的24孔板在室温下置于层流罩中15至20分钟以进行温度平衡。为了测量HRMEC的TEER，使用上皮伏特/欧姆表电阻系统，将电极连接到仪表，并通过首先将其浸泡在70%乙醇中15至20分钟，然后将其短暂浸入细胞培养EGM生长培养基中来平衡电极。通过小心地浸入电极来执行TEER测量，使较短的尖端在插入物中，而较长的尖端接触孔的底部。首先测量空白对照的电阻，然后对于每个插入件，一式三份测量TEER。在达到TEER值约20欧姆平方厘米的汇合度时，在用配体处理之前，在两个腔室的EBM中使用0.5%FBS在37摄氏度和5%二氧化碳下剥夺细胞24小时。在整个测定过程中使用血清减少的EBM。在顶端室中使用血清还原培养基将细胞与荧光花青-3-标签一起孵育至转铁蛋白配体，在37摄氏度下孵育60分钟。用血清还原培养基顶端和基底侧洗涤单层4次后，将新鲜培养基添加到含有细胞的滤芯中，并将插入物转移到含有预热的血清还原培养基的24孔板的新鲜孔中。将细胞在培养箱中再孵育90分钟，然后从基底外侧室收集培养基。使用荧光检测器记录来自基底外侧室的溶液的荧光强度。在达到TEER值约20欧姆平方厘米的汇合度时，在用配体处理之前，在两个腔室的EBM中使用0.5%FBS在37摄氏度和5%二氧化碳下剥夺细胞24小时。在整个测定过程中使用血清减少的EBM。接下来，用所需的处理和载体对照处理顶室中的细胞。向细胞中加入每毫升辣根过氧化物酶或HRP5毫克，并在37摄氏度下孵育15分钟。将新鲜的减血清培养基添加到顶室中，并将插入物转移到含有预热培养基的新鲜孔中。将单层在培养箱中再孵育90分钟。从基底外侧室收集培养基后，向收集的培养基中加入100微升HRP荧光过氧化物酶底物，并在室温下孵育10分钟。用100微升终止溶液停止反应，并使用荧光板读数器检测培养基中HRP底物反应产物的水平。在演示体外转吞测定之前，视网膜中内皮细胞转吞作用的可视化显示为背景信息。在这里，光学显微镜图像显示了来自用DAB染色的3个月大的野生型小鼠视网膜切片的HRP填充血管腔。HRP通过眶后注射。在光学显微镜下，HRP填充的视网膜血管可被视为深棕色沉淀物。透射电子显微镜超薄切片显示HRP填充的转吞血管，其中RMEC描绘了穿过内部血视网膜屏障的EC转吞作用。在这里，大囊泡可能反映巨松体和鲁米诺侧的红细胞。TeM图像显示RMEC内充满HRP的小转细胞囊泡，可能是洞穴囊泡。CAV-1抗体和异凝集素B4的免疫组织化学染色显示CAV-1（视网膜血管中洞穴囊泡的标志物）在3个月大的野生型小鼠视网膜中的定位。此处显示了视网膜内皮细胞内免疫金标记的CAV-1的TeM图像，并显示了CAV-1阳性洞穴囊泡的放大图像。对于使用转铁蛋白在HRMEC中进行网格蛋白介导的EC转吞测定，在这里，荧光显微镜图像显示HRMEC内红色的内吞Cy3转铁蛋白，用蓝色DAPI染色。对于使用HRP的洞穴介导的EC转吞作用，此处使用Wnt信号作为示例来证明该测定。最近发现Wnt信号传导调节洞穴介导的EC转吞作用。用Wnt途径激活剂Wnt3a条件培养基和重组Norrin处理细胞，有或没有Wnt信号抑制剂XAV939及其反应性对照。Wnt激活剂降低了基于HRP的转胞作用水平，XAV939逆转了转胞作用。正确的TEER测量对于确定单层完整性至关重要。它受处理不当、温度波动、培养基、培养时间等各种因素的影响很大。该测定可以修改为模拟体内条件的共培养或3D器官型培养系统。

Research

JoVE Journal

Medicine

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A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

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To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

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新生儿鼠耳蜗外科手术技术<em&gt;体外</em&gt;听力研究筛选工具

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

内皮细胞转吞测定作为 体外 模型评估内部血-视网膜屏障通透性

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