Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud (R01 EY028100, EY024963 og EY031765) til JC. ZW blev støttet af et Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Boston Children's Hospital til generering af lysmikroskopi og EM-billeder (figur 3). Protokoller for in vivo-undersøgelserne kan fås ved henvendelse til Wang et al.24. Alle eksperimenter, der involverede humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC'er), blev godkendt af Institutional Biosafety Committee (IBC) på Boston Children's Hospital.
<p class="jove_t...

BRB spiller en væsentlig rolle i retinal sundhed og sygdom. In vitro-teknikker, der vurderer vaskulær permeabilitet, har vist sig at være afgørende værktøjer i undersøgelser vedrørende barriere (BRB / BBB) udvikling og funktion. Den her beskrevne procedure kan anvendes til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for EC-transcytose eller evaluere relaterede molekylære modulatorer, der påvirker BRB-permeabiliteten. In vitro EC transcytose assays har flere fordele i forhold til...

Den menneskelige nethinde er et af de højeste energikrævende væv i kroppen. Korrekt funktion af den neurale nethinde kræver en effektiv tilførsel af ilt og næringsstoffer sammen med en begrænset flux af andre potentielt skadelige molekyler for at beskytte retinalmiljøet, som medieres via blod-retinal barrieren (BRB)1. I lighed med blod-hjerne-barrieren (BBB) i centralnervesystemet fungerer BRB som en selektiv barriere i øjet, der regulerer bevægelsen af ioner, vand, aminosyrer og sukker ind og ud af nethinden. BRB opretholder også retinal homeostase og dets immunprivilegium ved at forhindre eksponering for kredsløbsfaktorer såsom immunceller, antistoffer og skadelige patogener2. BRB-dysfunktion bidrager til patofysiologien af flere vaskulære øjenlidelser, såsom diabetisk retinopati, aldersrelateret makuladegeneration (AMD), præmatur retinopati (ROP), retinal veneokklusion og uveitis, hvilket resulterer i vasogent ødem og efterfølgende synstab 3,4,5.
BRB består af to separate barrierer for henholdsvis to forskellige okulære vaskulære netværk: retinal vaskulaturen og den fenestrerede choriocapillaris under nethinden. Den indre BRB (iBRB) består primært af retinale mikrovaskulære endotelceller (RMEC'er), der forer retinal mikrovaskulaturen, som nærer de indre retinale neuronale lag. På den anden side udgør retinal pigmentepitel hovedkomponenten i den ydre BRB, som ligger mellem den neurosensoriske nethinde og choriocapillaris2. For iBRB finder molekylær transport på tværs af RMEC'er sted gennem både paracellulære og transcellulære ruter (figur 1). Den høje grad af stofselektivitet på tværs af iBRB er afhængig af (i) tilstedeværelsen af junctionale proteinkomplekser, der begrænser paracellulær transport mellem tilstødende endotelceller (EC'er) og (ii) lave ekspressionsniveauer af caveolae-mediatorer, transportører og receptorer inden for endotelcellerne, der opretholder lave transcellulære transporthastigheder 1,6,7,8 . Junctional komplekser, der regulerer paracellulær flux, består af tætte kryds (claudiner, occludins), klæbende kryds (VE-cadheriner) og mellemrumskryds (forbindelsesforbindelser), der tillader passage af vand og små vandopløselige forbindelser. Mens små lipofile molekyler passivt diffunderer over det indre af RMEC'er, reguleres bevægelsen af større lipofile og hydrofile molekyler af ATP-drevne transendotelveje, herunder vesikulær transport og membrantransportører 5,9.
Vesikulær transcytose kan kategoriseres som caveolin-medieret caveolær transcytose, clathrinafhængig (og receptormedieret) transcytose og clathrin-uafhængig makropinocytose (figur 2). Disse vesikulære transportprocesser involverer blærer af forskellig størrelse, hvor makropinosomer er de største (fra 200-500 nm) og caveolae er den mindste (i gennemsnit 50-100 nm), mens clathrin-belagte vesikler spænder fra 70-150 nm10. Caveolae er kolbeformede lipidrige plasmamembraninvaginationer med en proteincoat, primært sammensat af caveolin-1, der binder lipidmembrankolesterol og andre strukturelle og signalproteiner via deres caveolin-stilladsdomæne11. Caveolins arbejder sammen med perifert fastgjort cavin for at fremme caveolae stabilisering ved plasmamembranen12. Caveolar membraner kan også bære receptorer for andre molekyler såsom insulin, albumin og cirkulerende lipoproteiner, herunder high-density lipoprotein (HDL) og low-density lipoprotein (LDL) for at hjælpe deres bevægelse på tværs af endotelceller13. Under udviklingen afhænger dannelsen af funktionel BRB af undertrykkelsen af EC transcytose8. Modent retinalt endotel har derfor relativt lave niveauer af caveolae-, caveolin-1- og albuminreceptorer i forhold til andre endotelceller under fysiologiske forhold, hvilket bidrager til dets barriereegenskaber 4,9.
Fordi iBRB-nedbrydning er et vigtigt kendetegn for mange patologiske øjenlidelser, er det vigtigt at udvikle metoder til vurdering af retinal vaskulær permeabilitet in vivo og in vitro. Disse metoder hjælper med at give sandsynlig indsigt i mekanismerne for kompromitteret BRB-integritet og vurdere effekten af potentielle terapeutiske mål. Nuværende in vivo-billeddannelse eller kvantitative vaskulære lækageassays anvender typisk fluorescerende (natriumfluorescein og dextran), kolorimetrisk (Evans Blue-farvestof og peberrodsperoxidase [HRP] substrat) eller radioaktive sporstoffer14 til påvisning af ekstravasation fra vaskulaturen til omgivende retinale væv med mikroskopbilleddannelse eller i isoleret vævslamsat. Et ideelt sporstof til kvantificering af vaskulær integritet bør være inert og stort nok til frit at gennemtrænge kompromitterede kar, mens det er begrænset i sunde og intakte kapillærer. Metoder, der anvender natriumfluorescein eller fluoresceinisothiocyanatkonjugeret dextran (FITC-dextran) i levende fundus fluorescein-angiografi (FFA) eller isolerede retinale flade monteringer, anvendes i vid udstrækning til kvantificering af retinal ekstravasation in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har den fordel, at den er tilgængelig i forskellige molekylvægte fra 4-70 kDa til størrelsesselektive undersøgelser15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) er et alternativt stort proteinsporstof af biologisk relevans for vaskulære lækageundersøgelser18. Evans Blue-farvestof, injiceret intrakardialt19, retro-orbitalt eller gennem halevenen 20, er også afhængig af dets binding med endogent albumin for at danne et stort molekyle, der kan kvantificeres ved for det meste spektrofotometrisk detektion eller, mindre almindeligt, fluorescensmikroskopi i flade monteringer20,21. Disse kvantitative eller lette billeddannelsesmetoder skelner imidlertid ofte ikke paracellulær transport fra trans-endoteltransport. Til specifik analyse af transcytose med ultrastrukturel visualisering af transcytosede vesikler anvendes spormolekyler såsom HRP typisk til at lokalisere transcytosede vesikler i endotelceller, der kan observeres under et elektronmikroskop22,23,24 (figur 3A-C).
Udviklingen og anvendelsen af in vitro iBRB-modeller til evaluering af endotelcellepermeabiliteten kan give en robust vurdering med høj kapacitet som supplement til in vivo-eksperimenter og støtte undersøgelsen af molekylære regulatorer af vaskulær lækage. Almindeligt anvendte assays til vurdering af paracellulær transport og integritet af tætte kryds inkluderer trans-endotel elektrisk modstand (TEER), et mål for ionisk konduktans (figur 4) 2,25 og in vitro vaskulær lækageassay ved hjælp af små molekylvægt fluorescerende sporstoffer 26. Derudover er transferrinbaserede transcytoseassays modellering af BBB blevet brugt til at udforske clathrinafhængig transcytose27. På trods af dette er assays til evaluering af BRB og mere specifikt retinal EC caveolar transcytose in vitro begrænset.
I denne undersøgelse beskriver vi et EC-transcytoseassay ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC'er) som en in vitro-model til bestemmelse af iBRB-permeabilitet og EC-transcytose. Dette assay er baseret på HRMEC'ers evne til at transportere transferrin eller HRP via henholdsvis de receptormedierede eller caveolaeafhængige transcytoseveje (figur 2). HRMEC'er dyrket til fuld konfluens i det apikale kammer (dvs. filterindsats) blev inkuberet med fluorescerende konjugeret transferrin (Cy3-Tf) eller HRP for at måle fluorescensintensiteten svarende til niveauerne af transferrin eller HRP overført til bundkammeret udelukkende gennem EC-transcytose. Sammenløbet af cellemonolaget kan bekræftes ved at måle TEER, hvilket indikerer den stramme krydsintegritet25. For at demonstrere TEER- og transcytoseassay-teknikken blev der anvendt kendte molekylære modulatorer af vaskulær permeabilitet og EC-transcytose, herunder vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF)28 og dem i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a og Norrin)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

Dysfunktion af blod-retinal barrieren (BRB) bidrager til patofysiologien af flere vaskulære øjenlidelser, hvilket ofte resulterer i retinalt ødem og efterfølgende synstab. Den indre blod-retinale barriere (iBRB) består hovedsageligt af retinal vaskulært endotel med lav permeabilitet under fysiologiske forhold. Denne funktion af lav permeabilitet er tæt reguleret og opretholdes af lave paracellulære transporthastigheder mellem tilstødende retinale mikrovaskulære endotelceller såvel som transcellulær transport (transcytose) gennem dem. Vurderingen af retinal transcellulær barrierepermeabilitet kan give grundlæggende indsigt i iBRB-integritet i sundhed og sygdom. I denne undersøgelse beskriver vi et endotelcelle (EC) transcytoseassay som en in vitro-model til evaluering af iBRB-permeabilitet ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC'er). Dette assay vurderer HRMEC'ers evne til at transportere transferrin og peberrodsperoxidase (HRP) i henholdsvis receptor- og caveolae-medierede transcellulære transportprocesser. Fuldt sammenflydende HRMEC'er dyrket på porøs membran blev inkuberet med fluorescerende mærket transferrin (clathrinafhængig transcytose) eller HRP (caveolae-medieret transcytose) for at måle niveauerne af transferrin eller HRP overført til det nederste kammer, hvilket indikerer transcytoseniveauer på tværs af EF-monolaget. Wnt-signalering, en kendt vej, der regulerer iBRB, blev moduleret for at demonstrere den caveolae-medierede HRP-baserede transcytoseanalysemetode. Det her beskrevne EC-transcytoseassay kan være et nyttigt værktøj til at undersøge de molekylære regulatorer af EC-permeabilitet og iBRB-integritet i vaskulære patologier og til screening af lægemiddelafgivelsessystemer.

EM-billeder af retinal vaskulært endotel viser transcytotisk vesikulær transport og caveolære vesikler i endotelceller in vivo. EC-transcytose kan visualiseres in vivo inden for retinale tværsnit med mørkebrunt bundfald, der afspejler HRP-holdige blodkar under et lysmikroskop (figur 3A) og som elektrontæt bundfald, der indikerer HRP-holdige transcytotiske vesikler (figur 3B, C) ved hjælp af et tra...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Denne protokol illustrerer et in vitro endotelcelletranscytoseassay som en model til evaluering af indre blod-retinal barrierepermeabilitet ved at måle evnen hos humane retinale mikrovaskulære endotelceller til at transportere peberrodsperoxidase på tværs af celler i caveolae-medierede transcellulære transportprocesser.

Endotelcelletranscytoseanalyse som en in vitro-model til evaluering af indre blod-retinal barrierepermeabilitet

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Denne protokol giver en nyttig cellebaseret model til undersøgelse af funktionen og permeabiliteten af selektive vaskulære barrierer såsom blod-retinal eller blod-hjerne-barriere med et specifikt fokus på endoteltranscytose. Denne analyse er let at oprette og bruge, hvilket ikke kræver levende dyr. Det kan bruges til at undersøge forskellige molekylære regulatorer af endotelcellepermeabilitet og transcytose, der påvirker indre blod-retinal barriereintegritet.Dette assay kan give indsigt i vaskulær biologi og øjen- og hjerneforskning, hvilket giver bedre forståelse af molekylemekanismer, der ligger til grund for BRB BBB-kontrol og udforsker potentiel lægemiddellevering på tværs af barriererne. Til at begynde med skal du forberede cellekulturfilterindsatserne til såning af humane retinale mikrovaskulære endotelceller eller HRMEC'er ved at belægge hver indsats med 200 mikroliter 0,1% gelatineopløsning i 30 minutter under en laminær strømningshætte. Sørg for, at løsningen dækker hele filterindsatsens bundflade.Tag en petriskål med dyrkede HRMEC'er inkuberet ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, og aspirer vækstmediet. Skyl forsigtigt cellerne to gange med 10 ml 1X PBS under den laminære strømningshætte for at slippe af med de potentielle flydende eller døde celler. Dissociere cellerne med 0,5 til 1 ml 0,25% trypsin-EDTA-opløsning og læg petriskålen i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 5 minutter.Sluk trypsinaktiviteten ved at tilføje 4,5 til 9 ml vækstmedier og overfør cellesuspensionen til et 15 milliliter rør ved hjælp af en 10 milliliter pipette. Drej cellerne ved 200 gange g i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten og suspender pelleten i 3 ml vækstmedier.Tæl antallet af celler ved hjælp af et manuelt hæmocytometer eller en automatiseret celletæller og frø med en tæthed på 40.000 celler pr. Filterindsats. Volumenet af cellesuspension for hver indsats er 250 mikroliter. Aspirer belægningsopløsningen fra brøndene indeholdende permeable indsatser og overfør 250 mikroliter af cellesuspensionen pr. indsats, og tilsæt derefter kun medium til en af indsatserne, som vil blive brugt som en blindkontrol til transendotelisk elektrisk modstand eller TEER-måling.Samtidig tilsættes også 750 mikroliter medium pr. Brønd i de basolaterale kamre. Hold 24-brøndspladen med permeable indsatser i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 7 til 12 dage, indtil de dyrkede celler bliver fuldt sammenflydende, og den ønskede TEER-værdi på omkring 20 ohm pr. Kvadratcentimeter opnås. Før TEER-målinger anbringes den celleholdige 24-brøndsplade i den laminære strømningshætte ved stuetemperatur i 15 til 20 minutter for temperaturækvilibrering.For at måle TEER for HRMEC'er ved hjælp af et epitelvolt / ohm meter elektrisk modstandssystem skal du forbinde elektroden til måleren og ligevægte elektroden ved først at blødgøre den i 70% ethanol i 15 til 20 minutter og derefter nedsænke den kort i cellekulturens EGM-vækstmedium. Udfør TEER-måling ved omhyggeligt at nedsænke elektroden, således at den kortere spids er i indsatsen, og den længere spids berører bunden af brønden. Mål først modstanden over den tomme kontrol, og mål derefter TEER i tre eksemplarer for hver indsats.Efter at have nået sammenløb med TEER-værdier omkring 20 ohm kvadratcentimeter, serum-fratage cellerne i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid ved hjælp af 0,5% FBS i EBM i begge kamre før behandling med liganden. Serumreduceret EBM blev anvendt under hele analysen. Inkubere cellerne ved hjælp af det serumreducerede medium i det apikale kammer med fluorescerende cyanin-3-tag til transferrinligand i 60 minutter ved 37 grader Celsius.Efter vask af monolaget apikalt og basolateralt 4 gange med det serumreducerede medium, tilsættes frisk medium til filterindsatserne, der indeholder cellerne, og indsatserne overføres til friske brønde på 24-brøndspladen indeholdende forvarmet serumreduceret medium. Inkuber cellerne i yderligere 90 minutter i inkubatoren og opsamling derefter mediet fra det basolaterale kammer. Opløsningens fluorescensintensitet registreres fra det basolaterale kammer ved hjælp af en fluorescensdetektor.Efter at have nået sammenløb med TEER-værdier omkring 20 ohm kvadratcentimeter, serum-fratage cellerne i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid ved hjælp af 0,5% FBS i EBM i begge kamre før behandling med liganden. Serumreduceret EBM blev anvendt under hele analysen. Derefter behandles cellerne i det apikale kammer med de ønskede behandlinger og køretøjskontroller.Tilsæt 5 milligram pr. milliliter peberrodperoxidase eller HRP til cellerne, og inkuber i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Tilsæt frisk serumreduceret medium til det apikale kammer, og overfør indsatserne til en frisk brønd, der indeholder forvarmede medier. Inkuber monolaget i yderligere 90 minutter i inkubatoren.Efter opsamling af medium fra basolateralkammeret tilsættes 100 mikroliter HRP fluorogen peroxidasesubstrat til det opsamlede medium og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter. Stop reaktionen med 100 mikroliter stopopløsning, og detekter niveauerne af HRP-substratreaktionsprodukt i mediet ved hjælp af en fluorescenspladelæser. Før påvisning af in vitro-transcytose-assays vises visualisering af endotelcelletranscytose i nethinden som baggrundsinformation.Her viser lysmikroskopbilledet et HRP-fyldt blodkar lumen fra en 3 måneder gammel vildtype muse retinal sektion farvet med DAB. HRP blev retro-orbitalt injiceret. HRP-fyldte retinale kar kan ses som mørkebrunt bundfald under lysmikroskopet.Transmissionselektronmikroskop ultratynd sektion viser HRP-fyldte transcytotiske kar med RMEC'er, der skildrer EC-transcytose over den indre blod-retinale barriere. Her afspejler den store vesikel potentielt makropinosomet og en rød blodlegeme på luminolsiden. TeM-billede viser HRP-fyldte små transcytotiske vesikler, sandsynligvis caveola-vesikler, inden for RMEC.Immunohistokemi farvning af CAV-1 antistof og isolectin B4 demonstrerer lokaliseringen af CAV-1, En markør for caveola vesikler i retinale blodkar, i den 3 måneder gamle vildtype muse nethinden. TeM-billede af immunogold-mærket CAV-1 i retinale endotelceller er vist her med et forstørret billede af CAV-1-positiv caveola-vesikel. For clathrin-medieret EC-transcytoseassay i HRMEC'er ved hjælp af transferrin viser et fluorescensmikroskopbillede her endocytosed Cy3 transferrin i rød farve inden for HRMEC'er farvet med DAPI i blåt.For caveolae-medieret EC-transcytose ved hjælp af HRP bruges Wnt-signalering her som et eksempel til at demonstrere analysen. Wnt-signalering blev for nylig fundet for at regulere caveolae-medieret EC-transcytose. Celler blev behandlet med Wnt-vejaktivator Wnt3a-konditioneret medium og rekombinant Norrin, med eller uden Wnt-signalhæmmer XAV939 og deres reaktive kontroller.Wnt-aktivatorer reducerede niveauet af den HRP-baserede transcytose, som blev vendt af XAV939. Korrekt TEER-måling er afgørende for at bestemme monolagsintegriteten. Det påvirkes i høj grad af forskellige faktorer såsom forkert håndtering, temperaturudsving, kulturmedium, kulturvarighed osv.Dette assay kan ændres som samkultur eller 3D organotypiske kultursystemer, der efterligner in vivo-forhold.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantation i en In vitro Simuleret Iskæmi / reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

En<em&gt; In vivo</em&gt; Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stræk i Brain mikrovaskulære endotelceller (cEND) som et<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisk Hjerneskade Model af blod-hjerne barrieren

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Etablering af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Model of Rat blod-hjerne barrieren (BBB): Fokus på BBB Uigennemtrængelighed og receptor-medieret transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoksiske Stimulering af Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ilt-Glucose afsavn og reoxygenering som en<em&gt; In vitro</em&gt; Iskæmireperfusion Skade Model for studere blod-hjerne barrieren dysfunktion

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akut Retinal Model for Evaluering Blood Retinal Barrier tilsidesættelse og potentielle lægemidler til behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool i Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...