Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY028100, EY024963 en EY031765) aan JC. ZW werd ondersteund door een Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in het Boston Children's Hospital voor het genereren van lichtmicroscopie en EM-beelden (figuur 3). Protocollen voor de in vivo studies kunnen worden verkregen van Wang et al.24. Alle experimenten met menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee (IBC) in het Boston Children's Hospital.</...

BRB speelt een essentiële rol in de gezondheid en ziekte van het netvlies. In vitro technieken die de vasculaire permeabiliteit beoordelen, zijn cruciale hulpmiddelen gebleken in studies met betrekking tot de ontwikkeling en functie van barrières (BRB/BBB). De hier beschreven procedure kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan EC-transcytose of om gerelateerde moleculaire modulatoren te evalueren die de BRB-permeabiliteit beïnvloeden. In vitro EC-tra...

Het menselijk netvlies is een van de meest energie-eisende weefsels in het lichaam. Een goede werking van het neurale netvlies vereist een efficiënte toevoer van zuurstof en voedingsstoffen, samen met een beperkte flux van andere potentieel schadelijke moleculen om de retinale omgeving te beschermen, die wordt gemedieerd via de bloed-retinale barrière (BRB)1. Vergelijkbaar met de bloed-hersenbarrière (BBB) in het centrale zenuwstelsel, fungeert de BRB als een selectieve barrière in het oog en reguleert de beweging van ionen, water, aminozuren en suiker in en uit het netvlies. BRB handhaaft ook retinale homeostase en zijn immuunprivilege door blootstelling aan circulatoire factoren zoals immuuncellen, antilichamen en schadelijke pathogenen te voorkomen2. BRB-disfunctie draagt bij aan de pathofysiologie van verschillende vasculaire oogziekten, zoals diabetische retinopathie, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), retinopathie van prematuriteit (ROP), retinale ader occlusie en uveïtis, resulterend in vasogeen oedeem en daaropvolgend verlies van het gezichtsvermogen 3,4,5.
De BRB bestaat uit twee afzonderlijke barrières voor twee verschillende oculaire vasculaire netwerken, respectievelijk: de retinale vasculatuur en de fenestrated choriocapillaris onder het netvlies. De binnenste BRB (iBRB) bestaat voornamelijk uit retinale microvasculaire endotheelcellen (RMEC's) die de retinale microvasculatuur bekleden, die de binnenste retinale neuronale lagen voedt. Aan de andere kant vormt het retinale pigmentepitheel het belangrijkste onderdeel van de buitenste BRB, die tussen het neurosensorische netvlies en choriocapillaris2 ligt. Voor de iBRB vindt moleculair transport over RMEC's plaats via zowel paracellulaire als transcellulaire routes (figuur 1). De hoge mate van stofselectiviteit in de iBRB is afhankelijk van (i) de aanwezigheid van junctionele eiwitcomplexen die het paracellulaire transport tussen aangrenzende endotheelcellen (EC's) beperken, en (ii) lage expressieniveaus van caveolae-mediatoren, transporters en receptoren in de endotheelcellen die lage transcellulaire transportsnelheden handhaven 1,6,7,8 . Junctionele complexen die de paracellulaire flux reguleren, bestaan uit tight junctions (claudins, occludins), adherens junctions (VE cadherins) en gap junctions (connexinen), waardoor de doorgang van water en kleine in water oplosbare verbindingen mogelijk is. Terwijl kleine lipofiele moleculen passief diffunderen over het binnenste van RMEC's, wordt de beweging van grotere lipofiele en hydrofiele moleculen gereguleerd door ATP-aangedreven trans-endotheelroutes, waaronder vesiculaire transport- en membraantransporters 5,9.
Vesiculaire transcytose kan worden gecategoriseerd als caveolin-gemedieerde caveolaire transcytose, clathrine-afhankelijke (en receptor-gemedieerde) transcytose en clathrin-onafhankelijke macropinocytose (figuur 2). Deze vesiculaire transportprocessen omvatten blaasjes van verschillende grootte, waarbij macropinosomen de grootste zijn (variërend van 200-500 nm) en caveolae de kleinste (gemiddeld 50-100 nm), terwijl clathrin-gecoate blaasjes variëren van 70-150 nm10. Caveolae zijn kolfvormige lipiderijke plasmamembraaninvaginaties met een eiwitlaag, voornamelijk samengesteld uit caveolin-1 die lipidemembraancholesterol en andere structurele en signaaleiwitten bindt via hun caveolin-steigerdomein11. Caveolins werken samen met perifeer gehechte cavin om caveolae-stabilisatie op het plasmamembraan te bevorderen12. Caveolar membranen kunnen ook receptoren dragen voor andere moleculen zoals insuline, albumine en circulerende lipoproteïnen, waaronder high-density lipoprotein (HDL) en low-density lipoprotein (LDL) om hun beweging over endotheelcellen te ondersteunen13. Tijdens de ontwikkeling hangt de vorming van functionele BRB af van de onderdrukking van EC-transcytose8. Volwassen retinaal endotheel heeft daarom relatief lage niveaus van caveolae-, caveolin-1- en albuminereceptoren ten opzichte van andere endotheelcellen onder fysiologische omstandigheden, wat bijdraagt aan de barrière-eigenschappen 4,9.
Omdat iBRB-afbraak een belangrijk kenmerk is van veel pathologische oogaandoeningen, is het essentieel om methoden te ontwikkelen om de retinale vasculaire permeabiliteit in vivo en in vitro te beoordelen. Deze methoden helpen waarschijnlijk inzicht te geven in de mechanismen van gecompromitteerde BRB-integriteit en beoordelen de werkzaamheid van potentiële therapeutische doelen. Huidige in vivo beeldvorming of kwantitatieve vasculaire lekkagetests maken meestal gebruik van fluorescerende (natriumfluoresceïne en dextran), colorimetrisch (Evans Blue-kleurstof en mierikswortelperoxidase [HRP] substraat) of radioactieve tracers14 om extravasatie van de vasculatuur naar omliggende retinale weefsels te detecteren met microscoopbeeldvorming of in geïsoleerd weefsellysaat. Een ideale tracer voor het kwantificeren van vasculaire integriteit moet inert en groot genoeg zijn om gecompromitteerde bloedvaten vrij te doordringen terwijl ze beperkt zijn tot gezonde en intacte haarvaten. Methoden die natriumfluoresceïne of fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerde dextran (FITC-dextran) gebruiken in levende fundus fluoresceïneangiografie (FFA) of geïsoleerde retinale flat mounts worden veel gebruikt voor het kwantificeren van retinale extravasatie in vivo of ex vivo. FITC-dextran heeft het voordeel dat het beschikbaar is in verschillende molecuulgewichten, variërend van 4-70 kDa voor grootteselectieve studies 15,16,17. FITC-albumine (~68 kDa) is een alternatieve grootschalige eiwittracer van biologische relevantie voor vasculaire lekkagestudies18. Evans Blue-kleurstof, geïnjecteerd intracardiaal19, retro-orbitaal of door de staartader20, vertrouwt ook op zijn binding met endogene albumine om een groot molecuul te vormen dat kan worden gekwantificeerd door meestal spectrofotometrische detectie of, minder vaak, fluorescentiemicroscopie in platte mounts20,21. Deze kwantitatieve of lichte beeldvormingsmethoden maken echter vaak geen onderscheid tussen paracellulair transport en trans-endotheeltransport. Voor de specifieke analyse van transcytose met ultrastructurele visualisatie van getranscytoseerde blaasjes, worden tracermoleculen zoals HRP meestal gebruikt om transcytosed blaasjes te lokaliseren in endotheelcellen die kunnen worden waargenomen onder een elektronenmicroscoop 22,23,24 (figuur 3A-C).
De ontwikkeling en het gebruik van in vitro iBRB-modellen om de permeabiliteit van endotheelcellen te evalueren, zou een robuuste en hoge doorvoerbeoordeling kunnen bieden als aanvulling op in vivo experimenten en het onderzoek naar moleculaire regulatoren van vasculaire lekkage te ondersteunen. Veelgebruikte testen om het paracellulaire transport en de integriteit van tight junctions te beoordelen, zijn trans-endotheel elektrische weerstand (TEER), een maat voor ionische geleiding (figuur 4) 2,25, en in vitro vasculaire lekkagetest met behulp van fluorescerende tracers met een klein molecuulgewicht26. Bovendien zijn transferrine-gebaseerde transcytose-assays die BBB modelleren gebruikt om clathrin-afhankelijke transcytose27 te onderzoeken. Desondanks zijn de testen om BRB en, meer specifiek, retinale EC caveolaire transcytose in vitro te evalueren beperkt.
In deze studie beschrijven we een EC-transcytosetest met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) als een in vitro model om iBRB-permeabiliteit en EC-transcytose te bepalen. Deze test is gebaseerd op het vermogen van HRMECs om transferrine of HRP te transporteren via respectievelijk de receptor-gemedieerde of caveolae-afhankelijke transcytoseroutes (figuur 2). HRMECs gekweekt tot volledige confluentie in de apicale kamer (d.w.z. filterinzet) werden geïncubeerd met fluorescerend-geconjugeerd transferrine (Cy3-Tf) of HRP om de fluorescentie-intensiteit te meten die overeenkomt met de niveaus van transferrine of HRP die uitsluitend door EC-transcytose naar de onderste kamer worden overgebracht. De samenvloeiing van de celmonolaag kan worden bevestigd door TEER te meten, wat de tight junction-integriteitaangeeft 25. Om de TEER- en transcytosetesttechniek aan te tonen, werden bekende moleculaire modulatoren van vasculaire permeabiliteit en EC-transcytose gebruikt, waaronder vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF)28 en die in Wnt-signalering (Wnt-liganden: Wnt3a en Norrin)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

Disfunctie van de bloed-retinale barrière (BRB) draagt bij aan de pathofysiologie van verschillende vasculaire oogziekten, vaak resulterend in retinaal oedeem en daaropvolgend verlies van het gezichtsvermogen. De binnenste bloed-retinale barrière (iBRB) bestaat voornamelijk uit retinaal vasculair endotheel met lage permeabiliteit onder fysiologische omstandigheden. Dit kenmerk van lage permeabiliteit wordt strak gereguleerd en gehandhaafd door lage snelheden van paracellulair transport tussen aangrenzende retinale microvasculaire endotheelcellen, evenals transcellulair transport (transcytose) erdoorheen. De beoordeling van retinale transcellulaire barrièrepermeabiliteit kan fundamentele inzichten verschaffen in iBRB-integriteit in gezondheid en ziekte. In deze studie beschrijven we een endotheelcel (EC) transcytosetest, als een in vitro model voor het evalueren van iBRB-permeabiliteit, met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs). Deze test beoordeelt het vermogen van HRMECs om transferrine en mierikswortelperoxidase (HRP) te transporteren in respectievelijk receptor- en caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen. Volledig confluente HRMECs gekweekt op poreus membraan werden geïncubeerd met fluorescerend gelabeld transferrine (clathrin-afhankelijke transcytose) of HRP (caveolae-gemedieerde transcytose) om de niveaus van transferrine of HRP te meten die naar de onderste kamer werden overgebracht, wat wijst op transcytoseniveaus in de EC-monolaag. Wnt-signalering, een bekende route die iBRB reguleert, werd gemoduleerd om de caveolae-gemedieerde HRP-gebaseerde transcytose-testmethode te demonstreren. De hier beschreven EC-transcytosetest kan een nuttig hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van de moleculaire regulatoren van EC-permeabiliteit en iBRB-integriteit in vasculaire pathologieën en voor het screenen van medicijnafgiftesystemen.

EM-beelden van retinaal vasculair endotheel tonen transcytotisch vesiculair transport en caveolaire blaasjes in endotheelcellen in vivo. EC-transcytose kan in vivo worden gevisualiseerd binnen retinale doorsneden met donkerbruin neerslag dat HRP-bevattende bloedvaten reflecteert onder een lichtmicroscoop (figuur 3A) en als elektrondicht neerslag indicatief voor HRP-bevattende transcytotische blaasjes (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Dit protocol biedt een nuttig celgebaseerd model voor het bestuderen van de functie en permeabiliteit van selectieve vasculaire barrières zoals bloed-retinale of bloed-hersenbarrière met een specifieke focus op endotheeltranscytose. Deze test is eenvoudig op te zetten en te gebruiken en vereist geen levende dieren. Het kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende moleculaire regulatoren van endotheelcelpermeabiliteit en transcytose die de integriteit van de binnenste bloed-retinale barrière beïnvloeden.Deze test kan inzicht geven in vasculaire biologie en oog- en hersenonderzoek, waardoor een beter begrip ontstaat van molecuulmechanismen die ten grondslag liggen aan BRB BBB-controle en het verkennen van potentiële medicijnafgifte over de barrières heen. Bereid om te beginnen de celkweekfilterinzetstukken voor het zaaien van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen of HRMECs, door elke insert gedurende 30 minuten te coaten met 200 microliter 0,1% gelatine-oplossing onder een laminaire stromingskap. Zorg ervoor dat de oplossing het volledige bodemoppervlak van het filterelement bedekt.Neem een petrischaaltje met gekweekte HRMECs geïncubeerd bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, en adem de groeimedia op. Spoel de cellen twee keer voorzichtig af met 10 milliliter 1X PBS onder de laminaire stromingskap om de potentiële zwevende of dode cellen te verwijderen. Dissocieer de cellen met 0,5 tot 1 milliliter 0,25% trypsine-EDTA-oplossing en plaats de petrischaal in de incubator op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 5 minuten.Doof de trypsineactiviteit door 4,5 tot 9 milliliter groeimedia toe te voegen en breng de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter met behulp van een pipet van 10 milliliter. Draai de cellen op 200 keer g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant voorzichtig en resuspendeer de pellet in 3 milliliter groeimedia.Tel het aantal cellen met behulp van een handmatige hemocytometer of een geautomatiseerde celteller en zaad met een dichtheid van 40.000 cellen per filterinzetstuk. Het volume van de celsuspensie voor elke insert is 250 microliter. Aspirateer de coatingoplossing uit de putten met doorlatende inserts en breng 250 microliter van de celsuspensie per insert over en voeg vervolgens alleen medium toe aan een van de inserts, die zal worden gebruikt als een blanco controle voor transendotheliale elektrische weerstand, of TEER, meting.Voeg tegelijkertijd ook 750 microliter medium per put toe in de basolaterale kamers. Houd de 24-well plaat met doorlatende inserts in de incubator op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 7 tot 12 dagen totdat de gekweekte cellen volledig confluent worden en de gewenste TEER-waarde van ongeveer 20 ohm per vierkante centimeter is bereikt. Plaats vóór teer-metingen de celbevattende 24-wellsplaat gedurende 15 tot 20 minuten in de laminaire stromingskap bij kamertemperatuur voor temperatuurbalancering.Om de TEER voor HRMECs te meten, sluit u met behulp van een epitheliaal volt / ohm meter elektrisch weerstandssysteem de elektrode aan op de meter en balanceer de elektrode door deze eerst gedurende 15 tot 20 minuten in 70% ethanol te weken en vervolgens kort onder te dompelen in het egm-groeimedium celcultuur. Voer TEER-metingen uit door de elektrode zorgvuldig onder te dompelen, zodat de kortere punt in het inzetstuk zit en de langere punt de bodem van de put raakt. Meet eerst de weerstand over het lege besturingselement en meet vervolgens voor elke wisselplaat TEER in drievoud.Bij het bereiken van confluency met TEER-waarden rond 20 ohm vierkante centimeter, serum-ontnemen de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met behulp van 0,5% FBS in EBM in beide kamers voorafgaand aan de behandeling met het ligand. Serum-gereduceerde EBM werd gebruikt tijdens de test. Incubeer de cellen met behulp van het serum-gereduceerde medium in de apicale kamer met fluorescerende cyanine-3-tag om ligand gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius over te dragen.Nadat u de monolaag apisch en basolateraal 4 keer met het serumgecomduceerde medium hebt gewassen, voegt u vers medium toe aan de filterinzetstukken die de cellen bevatten en brengt u de inserts over naar verse putten van de 24-wellsplaat met voorgewarmd serum-gereduceerd medium. Incubeer de cellen nog eens 90 minuten in de incubator en verzamel vervolgens het medium uit de basolaterale kamer. Noteer de fluorescentie-intensiteit van de oplossing uit de basolaterale kamer met behulp van een fluorescentiedetector.Bij het bereiken van confluency met TEER-waarden rond 20 ohm vierkante centimeter, serum-ontnemen de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met behulp van 0,5% FBS in EBM in beide kamers voorafgaand aan de behandeling met het ligand. Serum-gereduceerde EBM werd gebruikt tijdens de test. Behandel vervolgens de cellen in de apicale kamer met de gewenste behandelingen en voertuigcontroles.Voeg 5 milligram per milliliter mierikswortelperoxidase, of HRP, toe aan de cellen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vers serumgecomproduceerd medium toe aan de apicale kamer en breng de inserts over naar een verse put met voorbewarmde media. Incubeer de monolaag nog eens 90 minuten in de incubator.Voeg na het verzamelen van medium uit de basolaterale kamer 100 microliter HRP fluorogeen peroxidasesubstraat toe aan het verzamelde medium en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Stop de reactie met 100 microliter stopoplossing en detecteer de niveaus van hrp-substraatreactieproduct in de media met behulp van een fluorescentieplaatlezer. Alvorens de in vitro transcytose-assays aan te tonen, wordt visualisatie van endotheelceltranscytose in het netvlies weergegeven als achtergrondinformatie.Hier toont de lichtmicroscoopafbeelding een met HRP gevuld bloedvatlumen van een 3 maanden oude wild-type muis retinale sectie gekleurd met DAB. HRP werd retro-orbitaal geïnjecteerd. Met HRP gevulde retinale vaten kunnen worden gezien als donkerbruin neerslag onder de lichtmicroscoop.Transmissie-elektronenmicroscoop ultradunne sectie toont HRP-gevulde transcytotische vaten met RMEC's die EC-transcytose over de binnenste bloed-retinale barrière weergeven. Hier reflecteert het grote blaasje mogelijk macropinosoom en een rode bloedcel aan de luminolzijde. TeM-afbeelding toont HRP-gevulde kleine transcytotische blaasjes, waarschijnlijk caveola-blaasjes, binnen het RMEC.Immunohistochemische kleuring van CAV-1-antilichaam en isolectine B4 toont de lokalisatie van CAV-1, een marker van caveola-blaasjes in retinale bloedvaten, in het 3 maanden oude wild-type muis netvlies. TeM-afbeelding van immunogoud-gelabeld CAV-1 in de retinale endotheelcellen wordt hier getoond met een vergroot beeld van CAV-1 positief caveola-blaasje. Voor clathrin-gemedieerde EC-transcytosetest in HRMECs met behulp van transferrine, hier, toont een fluorescentiemicroscoopafbeelding endocytosed Cy3-transferrine in rode kleur binnen HRMECs gekleurd met DAPI in blauw.Voor caveolae-gemedieerde EC-transcytose met behulp van HRP wordt Wnt-signalering hier als voorbeeld gebruikt om de test aan te tonen. Wnt-signalering bleek onlangs caveolae-gemedieerde EC-transcytose te reguleren. Cellen werden behandeld met Wnt-pathway activator Wnt3a-geconditioneerd medium en recombinant Norrin, met of zonder Wnt-signaleringsremmer XAV939 en hun reactieve controles.Wnt-activatoren verlaagden het niveau van de op HRP gebaseerde transcytose, die werden omgekeerd door XAV939. Correcte TEER-meting is cruciaal om de integriteit van de monolaag te bepalen. Het wordt sterk beïnvloed door verschillende factoren zoals onjuiste hantering, temperatuurschommelingen, kweekmedium, kweekduur, et cetera.Deze test kan worden gewijzigd als co-kweek- of 3D-organotypische kweeksystemen die in vivo omstandigheden nabootsen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemie-reperfusie letsel model voor de studie bloed-hersenbarrière Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Een acute retinale model voor het evalueren van Blood Retina Barrier Breach en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...