Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse (R01 EY028100, EY024963 und EY031765) an JC unterstützt. ZW wurde durch ein Karriere-Starter-Stipendium der Knights Templar Eye Foundation unterstützt.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Boston Children's Hospital zur Erzeugung von lichtmikroskopischen und EM-Bildern genehmigt (Abbildung 3). Protokolle für die In-vivo-Studien können von Wang et al.24 bezogen werden. Alle Experimente mit humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs) wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) am Boston Children's Hospital genehmigt.
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BRB spielt eine wesentliche Rolle bei der Gesundheit und Erkrankung der Netzhaut. In-vitro-Techniken zur Beurteilung der vaskulären Permeabilität haben sich als entscheidende Werkzeuge in Studien zur Entwicklung und Funktion von Barrieren (BRB/BBB) erwiesen. Das hier beschriebene Verfahren könnte verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der EC-Transzytose zu untersuchen oder verwandte molekulare Modulatoren zu bewerten, die die BRB-Permeabilität beeinflussen. In vitro EC-Transzytose-Assays h...

Die menschliche Netzhaut ist eines der am höchsten energieintensiven Gewebe im Körper. Das reibungslose Funktionieren der neuronalen Netzhaut erfordert eine effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen sowie einen begrenzten Fluss anderer potenziell schädlicher Moleküle zum Schutz der Netzhautumgebung, die über die Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) vermittelt wird1. Ähnlich wie die Blut-Hirn-Schranke (BBB) im zentralen Nervensystem wirkt die BRB als selektive Barriere im Auge und reguliert die Bewegung von Ionen, Wasser, Aminosäuren und Zucker in und aus der Netzhaut. BRB erhält auch die Netzhauthomöostase und ihr Immunprivileg aufrecht, indem sie die Exposition gegenüber Kreislauffaktoren wie Immunzellen, Antikörpern und schädlichen Krankheitserregern verhindert2. BRB-Dysfunktion trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, wie diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Frühgeborenenretinopathie (ROP), Netzhautvenenverschluss und Uveitis, was zu vasogenen Ödemen und anschließendem Sehverlust führt 3,4,5.
Die BRB besteht aus zwei separaten Barrieren für zwei unterschiedliche okuläre vaskuläre Netzwerke: das retinale Gefäßsystem und die fenestrierte Choriokapillare unter der Netzhaut. Die innere BRB (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (RMECs), die die retinale Mikrovaskulatur auskleiden, die die inneren retinalen neuronalen Schichten nährt. Zum anderen bildet das retinale Pigmentepithel den Hauptbestandteil des äußeren BRB, das zwischen neurosensorischer Netzhaut und Choriokapillaris2 liegt. Für den iBRB findet der molekulare Transport zwischen RMECs sowohl über parazelluläre als auch über transzelluläre Wege statt (Abbildung 1). Der hohe Grad an Substanzselektivität über den iBRB beruht auf (i) dem Vorhandensein von junctionalen Proteinkomplexen, die den parazellulären Transport zwischen benachbarten Endothelzellen (ECs) einschränken, und (ii) niedrigen Expressionsniveaus von Caveolae-Mediatoren, Transportern und Rezeptoren innerhalb der Endothelzellen, die niedrige transzelluläre Transportraten aufrechterhalten 1,6,7,8 . Junctionale Komplexe, die den parazellulären Fluss regulieren, bestehen aus Tight Junctions (Claudine, Occludine), Adherens-Junctions (VE-Cadherine) und Gap Junctions (Connexine), die den Durchgang von Wasser und kleinen wasserlöslichen Verbindungen ermöglichen. Während kleine lipophile Moleküle passiv über das Innere von RMECs diffundieren, wird die Bewegung größerer lipophiler und hydrophiler Moleküle durch ATP-getriebene transendotheliale Signalwege einschließlich vesikulärer Transport- und Membrantransporter reguliert 5,9.
Vesikuläre Transzytose kann als Caveolin-vermittelte katolare Transzytose, Clathrin-abhängige (und rezeptorvermittelte) Transzytose und Clathrin-unabhängige Makropinozytose kategorisiert werden (Abbildung 2). Diese vesikulären Transportprozesse umfassen unterschiedlich große Vesikel, wobei Makropinosomen die größten (im Bereich von 200-500 nm) und Caveolae die kleinsten (durchschnittlich 50-100 nm) sind, während Clathrin-beschichtete Vesikel von 70-150 nm10 reichen. Caveolae sind kolbenförmige lipidreiche Plasmamembraninvaginationen mit einer Proteinhülle, die hauptsächlich aus Caveolin-1 besteht, das Lipidmembrancholesterin und andere Struktur- und Signalproteine über ihre Caveolin-Gerüstdomäne11 bindet. Caveoline arbeiten mit peripher angeschlossenem Cavin zusammen, um die Stabilisierung der Caveolae an der Plasmamembran12 zu fördern. Katolarmembranen können auch Rezeptoren für andere Moleküle wie Insulin, Albumin und zirkulierende Lipoproteine einschließlich High-Density-Lipoprotein (HDL) und Low-Density-Lipoprotein (LDL) tragen, um ihre Bewegung durch Endothelzellen zu unterstützen13. Während der Entwicklung hängt die Bildung von funktionellem BRB von der Unterdrückung der EC-Transzytoseab 8. Reifes retinales Endothel weist daher relativ niedrige Konzentrationen von Caveolae-, Caveolin-1- und Albuminrezeptoren im Vergleich zu anderen Endothelzellen unter physiologischen Bedingungen auf, was zu seinen Barriereeigenschaften beiträgt 4,9.
Da der iBRB-Abbau ein wesentliches Kennzeichen vieler pathologischer Augenerkrankungen ist, ist es wichtig, Methoden zur Beurteilung der retinalen vaskulären Permeabilität in vivo und in vitro zu entwickeln. Diese Methoden helfen, wahrscheinliche Einblicke in die Mechanismen der kompromittierten BRB-Integrität zu liefern und die Wirksamkeit potenzieller therapeutischer Ziele zu bewerten. Aktuelle In-vivo-Bildgebungs- oder quantitative vaskuläre Leckage-Assays verwenden typischerweise fluoreszierende (Natriumfluorescein und Dextran), kolorimetrische (Evans-Blue-Farbstoff und Meerrettichperoxidase [HRP]-Substrat) oder radioaktive Tracer14, um eine Extravasation aus dem Gefäßsystem in das umgebende Netzhautgewebe mit mikroskopischer Bildgebung oder in isoliertem Gewebelysat nachzuweisen. Ein idealer Tracer zur Quantifizierung der vaskulären Integrität sollte inert und groß genug sein, um kompromittierte Gefäße frei zu durchdringen, während sie in gesunden und intakten Kapillaren eingeschlossen sind. Methoden, die Natriumfluorescein oder Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertes Dextran (FITC-Dextran) in lebender Fundus-Fluorescein-Angiographie (FFA) oder isolierten Netzhaut-Flachmounts verwenden, werden häufig zur Quantifizierung der Netzhautextravasation in vivo oder ex vivo verwendet. FITC-Dextran hat den Vorteil, dass es in verschiedenen Molekulargewichten von 4-70 kDa für größenselektive Studien15,16,17 verfügbar ist. FITC-Albumin (~68 kDa) ist ein alternativer großformatiger Proteintracer von biologischer Relevanz für vaskuläre Leckagestudien18. Evansblau-Farbstoff, intrakardialinjiziert 19, retroorbital oder durch die Schwanzvene 20, beruht auch auf seiner Bindung mit endogenem Albumin, um ein großes Molekül zu bilden, das durch meist spektrophotometrische Detektion oder, seltener, Fluoreszenzmikroskopie in flachen Halterungen quantifiziert werden kann20,21. Diese quantitativen oder lichtbildgebenden Methoden unterscheiden jedoch oft nicht zwischen parazellulärem Transport und transendothelialem Transport. Für die spezifische Analyse der Transzytose mit ultrastruktureller Visualisierung transzytosierter Vesikel werden typischerweise Tracermoleküle wie HRP verwendet, um transzytosierte Vesikel innerhalb von Endothelzellen zu lokalisieren, die unter einem Elektronenmikroskop 22,23,24 beobachtet werden können (Abbildung 3A-C).
Die Entwicklung und Verwendung von In-vitro-iBRB-Modellen zur Bewertung der Permeabilität von Endothelzellen könnte eine robuste Bewertung mit hohem Durchsatz ermöglichen, um In-vivo-Experimente zu ergänzen und die Untersuchung molekularer Regulatoren der vaskulären Leckage zu unterstützen. Häufig verwendete Assays zur Beurteilung des parazellulären Transports und der Integrität von Tight Junctions umfassen den transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER), ein Maß für die Ionenleitfähigkeit (Abbildung 4)2,25, und den In-vitro-Gefäßleckage-Assay unter Verwendung von fluoreszierenden Tracern mit kleinem Molekulargewicht 26. Darüber hinaus wurden Transferrin-basierte Transzytose-Assays zur Modellierung von BBB verwendet, um die Clathrin-abhängige Transzytosezu untersuchen 27. Trotzdem sind die Assays zur Bewertung der BRB und insbesondere der retinalen EC-Katolartranszytose in vitro begrenzt.
In dieser Studie beschreiben wir einen EC-Transzytose-Assay unter Verwendung humaner retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HRMECs) als in vitro-Modell zur Bestimmung der iBRB-Permeabilität und der EC-Transzytose. Dieser Assay beruht auf der Fähigkeit von HRMECs, Transferrin oder HRP über die rezeptorvermittelten bzw. caveolae-abhängigen Transzytosewege zu transportieren (Abbildung 2). HRMECs, die bis zur vollständigen Konfluenz in der apikalen Kammer (d. h. Filtereinsatz) kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzkonjugiertem Transferrin (Cy3-Tf) oder HRP inkubiert, um die Fluoreszenzintensität zu messen, die den Transferrin- oder HRP-Spiegeln entspricht, die ausschließlich durch EC-Transzytose in die untere Kammer übertragen werden. Die Konfluenz der Zellmonoschicht kann durch Messung von TEER bestätigt werden, was die Tight-Junction-Integritätanzeigt 25. Um die TEER- und Transzytose-Assay-Technik zu demonstrieren, wurden bekannte molekulare Modulatoren der vaskulären Permeabilität und EC-Transzytose verwendet, einschließlich des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF)28 und derjenigen im Wnt-Signalweg (Wnt-Liganden: Wnt3a und Norrin)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

Eine Dysfunktion der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, was häufig zu Netzhautödemen und anschließendem Sehverlust führt. Die innere Blut-Netzhaut-Barriere (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalem vaskulärem Endothel mit geringer Permeabilität unter physiologischen Bedingungen. Dieses Merkmal der geringen Permeabilität wird durch niedrige parazelluläre Transportraten zwischen benachbarten retinalen mikrovaskulären Endothelzellen sowie durch den transzellulären Transport (Transzytose) durch sie streng reguliert und aufrechterhalten. Die Bewertung der retinalen transzellulären Barrierepermeabilität kann grundlegende Einblicke in die Integrität von iBRB in Gesundheit und Krankheit liefern. In dieser Studie beschreiben wir einen Endothelzell (EC) Transzytose-Assay als in vitro Modell zur Bewertung der iBRB-Permeabilität unter Verwendung von humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs). Dieser Assay bewertet die Fähigkeit von HRMECs, Transferrin und Meerrettichperoxidase (HRP) in rezeptor- bzw. caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren. Vollständig konfluente HRMECs, die auf poröser Membran kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzmarkiertem Transferrin (Clathrin-abhängige Transzytose) oder HRP (Caveolae-vermittelte Transzytose) inkubiert, um die Transferrin- oder HRP-Spiegel zu messen, die in die Bodenkammer übertragen wurden, was auf Transzytosespiegel in der gesamten EC-Monoschicht hinweist. Der Wnt-Signalweg, ein bekannter Signalweg, der iBRB reguliert, wurde moduliert, um die Caveolae-vermittelte HRP-basierte Transzytose-Assay-Methode zu demonstrieren. Der hier beschriebene EC-Transzytose-Assay kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der molekularen Regulatoren der EC-Permeabilität und iBRB-Integrität in vaskulären Pathologien und für das Screening von Arzneimittelabgabesystemen sein.

EM-Bilder des retinalen vaskulären Endothels zeigen transzytotischen vesikulären Transport und katoolare Vesikel in Endothelzellen in vivo. Die EC-Transzytose kann in vivo innerhalb von Netzhautquerschnitten mit dunkelbraunem Niederschlag, der HRP-haltige Blutgefäße unter einem Lichtmikroskop reflektiert (Abbildung 3A) und als elektronendichter Niederschlag, der auf HRP-haltige transzytotische Vesikel hinweist (Abbildung 3B,C...

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Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Dieses Protokoll bietet ein nützliches zellbasiertes Modell zur Untersuchung der Funktion und Permeabilität selektiver Gefäßbarrieren wie der Blutretina- oder Blut-Hirn-Schranke mit besonderem Fokus auf endotheliale Transzytose. Dieser Assay ist einfach einzurichten und zu verwenden und erfordert keine lebenden Tiere. Es kann zur Untersuchung verschiedener molekularer Regulatoren der Endothelzellpermeabilität und Transzytose verwendet werden, die die innere Integrität der Blut-Netzhaut-Barriere beeinflussen.Dieser Assay kann Einblicke in die vaskuläre Biologie sowie in die Augen- und Hirnforschung geben, was ein besseres Verständnis der Molekülmechanismen ermöglicht, die der BRB-BBB-Kontrolle zugrunde liegen, und die Erforschung einer potenziellen Medikamentenabgabe über die Barrieren hinweg. Bereiten Sie zunächst die Zellkulturfiltereinsätze für die Aussaat menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen oder HRMECs vor, indem Sie jeden Einsatz 30 Minuten lang unter einer Laminar-Flow-Haube mit 200 Mikrolitern 0,1% Gelatinelösung beschichten. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die gesamte Unterseite des Filtereinsatzes bedeckt.Nehmen Sie eine Petrischale mit kultivierten HRMECs, die bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubiert wurden, und saugen Sie die Wachstumsmedien ab. Spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 10 Milliliter 1X PBS unter der Laminar-Flow-Haube, um die potenziellen schwimmenden oder toten Zellen loszuwerden. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0,5 bis 1 Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung und legen Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 5 Minuten in den Inkubator.Löschen Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von 4,5 bis 9 Milliliter Wachstumsmedien und überführen Sie die Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Drehen Sie die Zellen bei 200 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 Milliliter Wachstumsmedien.Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem manuellen Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler und säen Sie mit einer Dichte von 40.000 Zellen pro Filtereinsatz. Das Volumen der Zellsuspension für jeden Einsatz beträgt 250 Mikroliter. Die Beschichtungslösung wird aus den Vertiefungen mit durchlässigen Einsätzen abgesaugt und 250 Mikroliter der Zellsuspension pro Einsatz überführt, dann nur Medium zu einem der Einsätze hinzugefügt, das als Blindkontrolle für die Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) verwendet wird.Gleichzeitig fügen Sie auch 750 Mikroliter Medium pro Vertiefung in den basolateralen Kammern hinzu. Halten Sie die 24-Well-Platte mit durchlässigen Einsätzen im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 7 bis 12 Tage, bis die kultivierten Zellen vollständig konfluent sind und der gewünschte TEER-Wert von etwa 20 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht ist. Vor TEER-Messungen die zellhaltige 24-Well-Platte für 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur in die Laminar-Flow-Haube legen, um den Temperaturausgleich zu erreichen.Um den TEER für HRMECs mit einem elektrischen Widerstandssystem für Epithelvolt / Ohm zu messen, verbinden Sie die Elektrode mit dem Messgerät und gleichen Sie die Elektrode aus, indem Sie sie zuerst 15 bis 20 Minuten lang in 70% Ethanol einweichen und dann kurz in das EGM-Wachstumsmedium der Zellkultur eintauchen. Führen Sie die TEER-Messung durch, indem Sie die Elektrode vorsichtig eintauchen, so dass sich die kürzere Spitze im Einsatz befindet und die längere Spitze den Boden der Vertiefung berührt. Messen Sie zuerst den Widerstand über den Blank-Regler und dann für jede Einlage TEER in dreifacher Ausfertigung.Bei Erreichen des Zusammenflusses mit TEER-Werten um 20 Ohm Quadratzentimeter werden die Zellen vor der Behandlung mit dem Liganden 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit 0,5% FBS in EBM in beiden Kammern beraubt. Serumreduziertes EBM wurde während des gesamten Assays verwendet. Inkubieren Sie die Zellen mit dem serumreduzierten Medium in der apikalen Kammer mit fluoreszierendem Cyanin-3-Tag zum Transferrin-Liganden für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach dem 4-fachen Waschen der Monoschicht apikal und basolateral mit dem serumreduzierten Medium frisches Medium in die Filtereinsätze mit den Zellen geben und die Einsätze in frische Vertiefungen der 24-Well-Platte mit vorgewärmtem serumreduziertem Medium überführen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 90 Minuten im Inkubator und sammeln Sie dann das Medium aus der basolateralen Kammer. Die Fluoreszenzintensität der Lösung aus der basolateralen Kammer wird mit einem Fluoreszenzdetektor aufgezeichnet.Bei Erreichen des Zusammenflusses mit TEER-Werten um 20 Ohm Quadratzentimeter Serumentzug der Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid unter Verwendung von 0,5% FBS in EBM in beiden Kammern vor der Behandlung mit dem Liganden. Serumreduziertes EBM wurde während des gesamten Assays verwendet. Als nächstes behandeln Sie die Zellen in der apikalen Kammer mit den gewünschten Behandlungen und Vehikelkontrollen.Fügen Sie 5 Milligramm pro Milliliter Meerrettichperoxidase oder HRP zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie frisches, serumreduziertes Medium in die apikale Kammer und geben Sie die Einsätze in eine frische Vertiefung, die vorgewärmte Medien enthält. Inkubieren Sie die Monoschicht für weitere 90 Minuten im Inkubator.Nach dem Sammeln von Medium aus der basolateralen Kammer 100 Mikroliter HRP-fluorogenes Peroxidasesubstrat in das gesammelte Medium geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion mit 100 Mikrolitern Stopplösung und detektieren Sie die Konzentrationen des HRP-Substratreaktionsprodukts in den Medien mit einem Fluoreszenzplattenleser. Vor der Demonstration der in vitro Transzytose-Assays wird die Visualisierung der Endothelzelltranszytose in der Netzhaut als Hintergrundinformation gezeigt.Hier zeigt das lichtmikroskopische Bild ein HRP-gefülltes Blutgefäßlumen aus einem 3 Monate alten Wildtyp-Maus-Netzhautabschnitt, der mit DAB gefärbt ist. HRP wurde retroorbital injiziert. HRP-gefüllte Netzhautgefäße können unter dem Lichtmikroskop als dunkelbrauner Niederschlag gesehen werden.Der ultradünne Transmissionselektronenmikroskop zeigt HRP-gefüllte transzytotische Gefäße mit RMECs, die die EC-Transzytose über die innere Blut-Netzhaut-Barriere darstellen. Hier reflektiert das große Vesikel möglicherweise Makropinosom und ein rotes Blutkörperchen auf der Luminolseite. Das TeM-Bild zeigt HRP-gefüllte kleine transzytotische Vesikel, wahrscheinlich Caveola-Vesikel, innerhalb des RMEC.Die immunhistochemische Färbung von CAV-1-Antikörpern und Isolectin B4 zeigt die Lokalisation von CAV-1, einem Marker von Caveola-Vesikeln in retinalen Blutgefäßen, in der 3 Monate alten Wildtyp-Mausnetzhaut. TeM-Bild von Immunogold-markiertem CAV-1 innerhalb der retinalen Endothelzellen ist hier mit einem vergrößerten Bild von CAV-1-positivem Caveola-Vesikel gezeigt. Für Clathrin-vermittelte EC-Transzytose-Assays in HRMECs unter Verwendung von Transferrin zeigt hier ein fluoreszenzmikroskopisches Bild endozytosiertes Cy3-Transferrin in roter Farbe innerhalb von HRMECs, die mit DAPI in blau gefärbt sind.Für die Caveolae-vermittelte EC-Transzytose mittels HRP wird der Wnt-Signalweg hier als Beispiel zur Demonstration des Assays verwendet. Kürzlich wurde festgestellt, dass der Wnt-Signalweg die Caveolae-vermittelte EC-Transzytose reguliert. Die Zellen wurden mit Wnt-Signalweg-Aktivator Wnt3a-konditioniertem mittlerem und rekombinantem Norrin mit oder ohne Wnt-Signalinhibitor XAV939 und ihren reaktiven Kontrollen behandelt.Wnt-Aktivatoren reduzierten das Niveau der HRP-basierten Transzytose, die durch XAV939 umgekehrt wurden. Die korrekte TEER-Messung ist entscheidend für die Bestimmung der Monolayer-Integrität. Es wird stark von verschiedenen Faktoren wie unsachgemäßer Handhabung, Temperaturschwankungen, Kulturmedium, Kulturdauer usw. beeinflusst.Dieser Assay könnte als Kokultur oder 3D-Organotypisches Kultursystem modifiziert werden, das In-vivo-Bedingungen nachahmt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

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Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Forschung

Medizin

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

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Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

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Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

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Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatische Hirnverletzung Modell der Blut-Hirn-Schranke

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Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

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Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

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Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

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Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als<em&gt; In vitro</em&gt; Screening-Tool in der Hörforschung

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...