Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH (R01 EY028100, EY024963 ו- EY031765) ל- JC. ZW נתמך על ידי מענק קריירה של קרן האבירים הטמפלרים.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית החולים לילדים בבוסטון ליצירת מיקרוסקופיית אור ותמונות EM (איור 3). פרוטוקולים למחקרי in vivo ניתן לקבל מ- Wang et al.24. כל הניסויים שכללו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (...

BRB ממלא תפקיד חיוני בבריאות הרשתית ובמחלותיה. טכניקות במבחנה להערכת חדירות כלי הדם הוכיחו את עצמן ככלים חיוניים במחקרים הנוגעים להתפתחות ותפקוד של מחסומים (BRB/BBB). ההליך המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס טרנסציטוזה של EC או להעריך מודולטורים מולקולר...

הרשתית האנושית היא אחת הרקמות הדורשות אנרגיה הגבוהה ביותר בגוף. תפקוד תקין של הרשתית העצבית דורש אספקה יעילה של חמצן וחומרים מזינים יחד עם שטף מוגבל של מולקולות אחרות שעלולות להזיק כדי להגן על סביבת הרשתית, המתווכת דרך מחסום הדם-רשתית (BRB)1. בדומה למחסום הדם-מוח (BBB) במערכת העצבים המרכזית, ה-BRB פועל כמחסום סלקטיבי בעין, המווסת את תנועת היונים, המים, חומצות האמינו והסוכר אל הרשתית וממנה. BRB גם שומר על הומאוסטזיס ברשתית ועל הפריבילגיה החיסונית שלו על ידי מניעת חשיפה לגורמים במחזור הדם כגון תאי מערכת החיסון, נוגדנים ופתוגנים מזיקים2. תפקוד לקוי של BRB תורם לפתופיזיולוגיה של מספר מחלות עיניים וסקולריות, כגון רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), רטינופתיה של פגות (ROP), חסימת ורידים ברשתית ואובאיטיס, וכתוצאה מכך בצקת וזוגנית ואובדן ראייהלאחר מכן 3,4,5.
ה-BRB מורכב משני מחסומים נפרדים עבור שתי רשתות כלי דם עיניים נפרדות, בהתאמה: כלי הדם ברשתית והכוריוקפילריס הפנסטרטיבי שמתחת לרשתית. ה-BRB הפנימי (iBRB) מורכב בעיקר מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית (RMECs) המרפדים את המיקרו-ווסקולטורה של הרשתית, המזינים את השכבות העצביות הפנימיות ברשתית. מצד שני, אפיתל פיגמנט הרשתית מהווה את המרכיב העיקרי של BRB החיצוני, אשר נמצא בין הרשתית neurosensory ו choriocapillaris2. עבור ה-iBRB, ההובלה המולקולרית על פני RMECs מתבצעת דרך נתיבים על-תאיים וטרנס-תאיים כאחד (איור 1). הרמה הגבוהה של סלקטיביות החומר ב-iBRB מסתמכת על (i) נוכחותם של קומפלקסים של חלבונים צומתיים המגבילים את ההובלה העל-תאית בין תאי אנדותל סמוכים (ECs), ו-(ii) רמות ביטוי נמוכות של מתווכים, מובילים וקולטנים של caveolae בתוך תאי האנדותל השומרים על שיעורים נמוכים של הובלה טרנס-תאית 1,6,7,8 . קומפלקסים צמתים המווסתים את השטף הפארא-תאי מורכבים מצמתים הדוקים (קלודינים, occludins), צמתים דבקים (VE cadherins) וצמתי פער (connexins), המאפשרים מעבר של מים ותרכובות קטנות המסיסות במים. בעוד שמולקולות ליפופיליות קטנות מתפזרות באופן פסיבי על פני פנים ה-RMECs, התנועה של מולקולות ליפופיליות והידרופיליות גדולות יותר מווסתת על ידי מסלולים טרנס-אנדותליים מונעי ATP, כולל הובלה שלפוחיתית ומובילי ממברנות 5,9.
טרנסציטוזה שלפוחיתית עשויה להיות מסווגת כטרנסציטוזה מערות בתיווך קייבולין, טרנסציטוזה תלוית קלתרין (ובתיווך קולטן) ומקרופינוציטוזה שאינה תלויה בקלתרין (איור 2). תהליכי הובלה שלפוחיתיים אלה כוללים בועיות בגדלים שונים, כאשר המקרופינוזומים הם הגדולים ביותר (הנעים בין 200-500 ננומטר) ו-caveolae הם הקטנים ביותר (ממוצע של 50-100 ננומטר), בעוד ששלפוחיות מצופות קלתרין נעות בין 70-150 ננומטר10. Caveolae הם אינווגינציות של קרום פלזמה עשיר בשומנים בצורת בקבוקון עם ציפוי חלבון, המורכב בעיקר מ- caveolin-1 הקושר כולסטרול של קרום השומנים וחלבונים מבניים ואיתותים אחרים באמצעות תחום פיגומי המערותשלהם 11. Caveolins פועלים יחד עם cavin מחובר היקפית כדי לקדם ייצוב caveolae בקרום פלזמה12. ממברנות מערות עשויות גם לשאת קולטנים למולקולות אחרות כגון אינסולין, אלבומין וליפופרוטאינים במחזור, כולל ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) כדי לסייע לתנועתם על פני תאי האנדותל13. במהלך הפיתוח, היווצרות של BRB פונקציונלי תלוי דיכוי של EC transcytosis8. אנדותל רשתית בוגר, לפיכך, יש רמות נמוכות יחסית של קולטני caveolae, caveolin-1, ו albumin ביחס לתאי אנדותל אחרים בתנאים פיזיולוגיים, תורם תכונות המחסום שלה 4,9.
מכיוון שהתמוטטות iBRB היא סימן היכר מרכזי של מחלות עיניים פתולוגיות רבות, חיוני לפתח שיטות להערכת חדירות כלי הדם ברשתית in vivo ו- in vitro. שיטות אלה מסייעות לספק תובנות סבירות לגבי המנגנונים של שלמות BRB שנפגעה ולהעריך את היעילות של מטרות טיפוליות פוטנציאליות. הדמיית in vivo נוכחית או בדיקות דליפת כלי דם כמותיות משתמשות בדרך כלל בפלואורסצנט (נתרן פלואורסצין ודקסטרון), קולורימטרי (צבע כחול אוונס ומצע פרוקסידאז חזרת [HRP]), או עוקבים רדיואקטיביים14 כדי לזהות אקסטרווזיה מכלי הדם לרקמות הרשתית הסובבות באמצעות הדמיית מיקרוסקופ או בליזאט רקמה מבודדת. עקיבה אידיאלית לכימות שלמות כלי הדם צריכה להיות אינרטית וגדולה מספיק כדי לחדור באופן חופשי לכלי דם פגועים בעודם כלואים בתוך נימים בריאים ושלמים. שיטות המשתמשות בנתרן פלואורסצין או פלואורסצין איזותיוציאנט מצומד דקסטרן (FITC-dextran) באנגיוגרפיה חיה של פונדוס פלואורסצין (FFA) או בתושבות שטוחות רשתית מבודדות נמצאות בשימוש נרחב לכמותית של אקסטרוואסציה ברשתית in vivo או ex vivo. ל-FITC-dextran יש את היתרון בכך שהוא זמין במשקלים מולקולריים שונים הנעים בין 4-70 kDa למחקרים סלקטיביים בגודל15,16,17. FITC-אלבומין (~68 kDa) הוא מעקב חלבוני חלופי בגודל גדול בעל רלוונטיות ביולוגית למחקרי דליפת כלי דם18. הצבע הכחול של אוונס, שהוזרק באופן תוך-קרדיאלי19, רטרו-אורביטלי, או דרך וריד הזנב 20, מסתמך גם על קשירתו עם אלבומין אנדוגני כדי ליצור מולקולה גדולה שניתן לכמת על ידי זיהוי ספקטרופוטומטרי בעיקר, או, פחות נפוץ, מיקרוסקופיה פלואורסצנטיתב-20,21 תושבות שטוחות. עם זאת, מתודולוגיות הדמיה כמותיות או קלות אלה אינן מבחינות לעתים קרובות בין הובלה פארא-תאית לבין הובלה טרנס-אנדותל. לצורך ניתוח ספציפי של טרנסציטוזה עם הדמיה אולטרה-סטרוקטורלית של שלפוחיות טרנסציטוזיות, מולקולות עקיבה כגון HRP משמשות בדרך כלל לאיתור שלפוחיות טרנסציטוזה בתוך תאי אנדותל שניתן לצפות בהן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים22,23,24 (איור 3A-C).
הפיתוח והשימוש במודלים של iBRB במבחנה להערכת חדירות תאי האנדותל יכולים לספק הערכת תפוקה חזקה וגבוהה כדי להשלים ניסויי in vivo ולסייע בחקירת הרגולטורים המולקולריים של דליפת כלי דם. מבחנים נפוצים להערכת ההובלה העל-תאית והשלמות של צמתים הדוקים כוללים התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TEER), מידה של מוליכות יונית (איור 4)2,25, ובדיקת דליפת כלי דם במבחנה באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים במשקל מולקולרי קטן 26. בנוסף, מבחני טרנסציטוזה מבוססי טרנסציטוזה המבוססים על טרנספירין מודלים BBB שימשו לחקר טרנסציטוזה תלוית קלתרין27. למרות זאת, בדיקות להערכת BRB, וליתר דיוק, רשתית EC caveolar transcytosis במבחנה מוגבלים.
במחקר זה, אנו מתארים בדיקת טרנסציטוזה של EC באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) כמודל במבחנה לקביעת חדירות iBRB וטרנסציטוזה של EC. בדיקה זו מסתמכת על היכולת של HRMECs להעביר טרנספרין או HRP דרך מסלולי טרנסציטוזה בתיווך קולטן או תלויי מערות, בהתאמה (איור 2). HRMECs שגודלו בתרבית למפגש מלא בתא האפיקלי (כלומר, תוסף מסנן) דוגרו עם טרנספרין מצומד-פלואורסצנטי (Cy3-Tf) או HRP כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות המתאימה לרמות הטרנספרין או HRP שהועברו לתא התחתון באמצעות טרנסציטוזה EC בלבד. מפגש של מונולאייר התא יכול להיות מאושר על ידי מדידת TEER, המציין את שלמות הצומת הדוק25. כדי להדגים את טכניקת הבדיקה של TEER וטרנסציטוזה, נעשה שימוש במודולטורים מולקולריים ידועים של חדירות כלי דם וטרנסציטוזה של EC, כולל גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF)28 ואלה באיתות Wnt (ליגנדות Wnt: Wnt3a ונורין)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

תפקוד לקוי של מחסום הדם-רשתית (BRB) תורם לפתופיזיולוגיה של מספר מחלות עיניים וסקולריות, שלעתים קרובות גורמות לבצקת רשתית ולאובדן ראייה לאחר מכן. מחסום הדם-רשתית הפנימי (iBRB) מורכב בעיקר מאנדותל כלי דם ברשתית עם חדירות נמוכה בתנאים פיזיולוגיים. תכונה זו של חדירות נמוכה מווסתת היטב ומתוחזקת על ידי שיעורים נמוכים של הובלה פארא-תאית בין תאי אנדותל מיקרווסקולריים ברשתית סמוכים, כמו גם הובלה טרנס-תאית (טרנסציטוזה) דרכם. הערכת חדירות המחסום הטרנס-תאי ברשתית עשויה לספק תובנות בסיסיות לגבי שלמות ה-iBRB בבריאות ובמחלות. במחקר זה אנו מתארים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל (EC), כמודל חוץ גופי להערכת חדירות iBRB, תוך שימוש בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs). בדיקה זו מעריכה את יכולתם של HRMECs להעביר טרנספרין ופרוקסידאז חזרת (HRP) בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך קולטן וקאוולה, בהתאמה. HRMECs בעלי השפעה מלאה שגודלו בתרבית על ממברנה נקבובית הודגמו עם טרנספרין מתויג פלואורסצנטי (טרנסציטוזה תלוית קלתרין) או HRP (טרנסציטוזה בתיווך caveolae) כדי למדוד את רמות הטרנספרין או HRP שהועברו לתא התחתון, מה שמעיד על רמות טרנסציטוזה על פני המונולייר EC. איתות WNT, מסלול ידוע המווסת את iBRB, הונע כדי להדגים את שיטת הבדיקה הטרנסציטוזה המבוססת על HRP בתיווך caveolae. בדיקת הטרנסציטוזה של EC המתוארת כאן עשויה לספק כלי שימושי לחקר הרגולטורים המולקולריים של חדירות EC ותקינות iBRB בפאתולוגיות וסקולריות ולסינון מערכות אספקת תרופות.

תמונות EM של אנדותל כלי דם ברשתית מראות הובלה שלפוחיתית טרנסציטוטית ושלפוחיות מערות בתאי אנדותל in vivo. ניתן לדמיין טרנסציטוזה של EC in vivo בתוך חתכי רשתית עם משקע חום כהה המשקף כלי דם המכילים HRP תחת מיקרוסקופ אור (איור 3A) וכמשקע צפוף אלקטרונים המעיד על שלפו...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

פרוטוקול זה מדגים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל במבחנה כמודל להערכת חדירות מחסום הדם-רשתית הפנימית על ידי מדידת יכולתם של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית להעביר פרוקסידאז חזרת על פני תאים בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך caveolae.

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

פרוטוקול זה מספק מודל שימושי מבוסס תאים לחקר התפקוד והחדירות של מחסומי כלי דם סלקטיביים כגון מחסום דם-רשתית או דם-מוח עם התמקדות ספציפית באנדותל טרנסציטוזה. בדיקה זו קלה להתקנה ולשימוש שאינה דורשת בעלי חיים חיים. ניתן להשתמש בו לחקר רגולטורים מולקולריים שונים של חדירות תאי אנדותל וטרנסציטוזה המשפיעים על שלמות מחסום הרשתית הפנימית.בדיקה זו יכולה לספק תובנות על ביולוגיה של כלי הדם ועל חקר העיניים והמוח, ומאפשרת הבנה טובה יותר של מנגנוני המולקולה העומדים בבסיס בקרת BRB BBB ולחקור העברת תרופות פוטנציאלית מעבר למחסומים. כדי להתחיל, הכינו את תוסף מסנן תרבית התאים לזריעת תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית או HRMECs, על ידי ציפוי כל תוסף ב-200 מיקרוליטרים של תמיסת ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית. ודא שהפתרון מכסה את כל המשטח התחתון של תוספת המסנן.קחו צלחת פטרי עם HRMECs מתורבתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, ושאפו את מדיית הצמיחה. שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של 1X PBS מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית כדי להיפטר מהתאים הצפים או המתים הפוטנציאליים. לנתק את התאים עם 0.5 עד 1 מיליליטר של 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA ולהניח את צלחת פטרי באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 5 דקות.להרוות את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 4.5 עד 9 מיליליטר של מדיה גדילה ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות פיפטה 10 מיליליטר. סובבו את התאים 200 פעמים גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות את הכדור ב 3 מיליליטר של מדיה צמיחה.לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ידני או מונה תאים אוטומטי וזרע בצפיפות של 40, 000 תאים לכל מסנן להוסיף. נפח ההשעיה של התא עבור כל תוספת הוא 250 microliters. שאפו את תמיסת הציפוי מהבארות המכילות תוספות חדירות והעבירו 250 מיקרוליטרים של תרחיף התא לכל הוספה, ולאחר מכן הוסיפו רק מדיום לאחת התוספות, אשר ישמשו כבקרה ריקה להתנגדות חשמלית טרנסאנדותלית, או TEER, מדידה.בו זמנית, גם להוסיף 750 microliters של בינוני לכל באר בתאים basolateral. שמור את צלחת 24 באר עם תוספות חדירות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 7 עד 12 ימים עד תאים בתרבית להיות מפגש מלא ואת הערך TEER הרצוי של כ 20 אוהם לסנטימטר מרובע מושגת. לפני מדידות TEER, הנח את הלוח המכיל 24 בארות בתא במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות לשיווי משקל טמפרטורה.כדי למדוד את ה-TEER עבור HRMECs, באמצעות מערכת התנגדות חשמלית של וולט/אוהם האפיתל, חבר את האלקטרודה למטר, ושיווי משקל האלקטרודה על ידי השרייתה תחילה ב-70% אתנול למשך 15 עד 20 דקות ולאחר מכן טבילתה לזמן קצר במדיום הגדילה של תרבית התאים EGM. בצע מדידת TEER על ידי טבילה זהירה של האלקטרודה, כך שהקצה הקצר יותר נמצא בתוסף והקצה הארוך יותר נוגע בתחתית הבאר. מדוד תחילה את ההתנגדות על-פני הפקד הריק, ולאחר מכן עבור כל תוספת, מדוד את TEER במשולשים.עם ההגעה למפגש עם ערכי TEER סביב 20 אוהם סנטימטרים רבועים, לשלול את התאים בסרום למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באמצעות 0.5% FBS ב- EBM בשני התאים לפני הטיפול עם הליגנד. EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה. דגירה של התאים באמצעות המדיום המופחת בסרום בתא האפיקלי עם תג ציאנין-3 פלואורסצנטי לליגנד טרנספרין למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר שטיפת המונולאייר באופן אפי ובזולטרלי 4 פעמים עם המדיום מופחת הסרום, הוסיפו מדיום טרי לתוספות המסנן המכילות את התאים והעבירו את התוספות לבארות טריות של צלחת 24 הבארות המכילות מדיום מופחת סרום שחומם מראש. דגירה של התאים במשך 90 דקות נוספות באינקובטור ולאחר מכן לאסוף את המדיום מן התא basolateral. רשום את עוצמת הפלואורסצנטיות של התמיסה מתא הבזולטרלי באמצעות גלאי פלואורסצנטי.עם ההגעה למפגש עם ערכי TEER סביב 20 אוהם סנטימטר מרובע, לסרום לשלול את התאים למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באמצעות 0.5% FBS ב- EBM בשני התאים לפני הטיפול עם הליגנד. EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה. לאחר מכן, יש לטפל בתאים שבחדר האפיקלי באמצעות הטיפולים הרצויים ובקרות הרכב.מוסיפים 5 מיליגרם למיליליטר של פרוקסידאז חזרת, או HRP, לתאים, ודוגרים במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו מדיום טרי מופחת סרום לתא האפיקלי והעבירו את התוספות לבאר טרייה המכילה מדיה שחוממה מראש. לדגור את המונולייר במשך 90 דקות נוספות באינקובטור.לאחר איסוף מדיום מתא basolateral, להוסיף 100 microliters של HRP פלואורוגני peroxidase מצע למדיום שנאסף לדגרה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. עצור את התגובה עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת עצירה וזהה את הרמות של תוצר תגובת מצע HRP בתקשורת באמצעות קורא צלחות פלואורסצנטי. לפני הדגמת מבחני הטרנסציטוזה במבחנה, הדמיה של טרנסציטוזה של תאי אנדותל ברשתית מוצגת כמידע רקע.כאן, תמונת מיקרוסקופ האור מראה לומן כלי דם מלא HRP ממקטע רשתית של עכבר מסוג פרא בן 3 חודשים המוכתם ב- DAB. HRP הוזרק רטרו-מסלולי. ניתן לראות כלי רשתית מלאים ב-HRP כמשקעים חומים כהים מתחת למיקרוסקופ הבהיר.מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים דק במיוחד מראה כלי דם טרנסציטוטיים מלאים HRP עם RMECs המתארים טרנסציטוזה EC על פני מחסום הדם-רשתית הפנימי. כאן, השלפוחית הגדולה עשויה לשקף מקרופינוזום ותא דם אדום בצד הזוהר. תמונת TeM מציגה שלפוחיות טרנסציטוטיות קטנות מלאות HRP, ככל הנראה שלפוחיות קאוולה, בתוך RMEC.צביעה אימונוהיסטוכימית של נוגדן CAV-1 ואיזולקטין B4 מדגימה את לוקליזציה של CAV-1, סמן של שלפוחיות קייבולה בכלי הדם ברשתית, ברשתית עכבר מסוג בר בת 3 חודשים. תמונת TeM של CAV-1 עם תווית אימונוגולד בתוך תאי האנדותל ברשתית מוצגת כאן עם תמונה מוגדלת של שלפוחית קייבולה חיובית CAV-1. עבור בדיקת טרנסציטוזה EC בתיווך קלתרין ב- HRMECs באמצעות טרנספרין, כאן, תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה העברה אנדוציטוזית של Cy3 בצבע אדום בתוך HRMECs מוכתמים ב- DAPI בכחול.עבור טרנסציטוזה EC בתיווך מערות באמצעות HRP, איתות Wnt כאן משמש כדוגמה להדגמת הבדיקה. איתות Wnt נמצא לאחרונה כדי לווסת טרנסציטוזה EC בתיווך caveolae. התאים טופלו באמצעות מפעיל מסלול Wnt עם מדיום מותנה Wnt3a ונורין רקומביננטי, עם או בלי מעכב איתות Wnt XAV939 והבקרות הריאקטיביות שלהם.מפעילי Wnt הפחיתו את רמת הטרנסציטוזה מבוססת HRP, שהתהפכה על ידי XAV939. מדידת TEER נכונה היא חיונית כדי לקבוע את שלמות החד-שכבתי. הוא מושפע מאוד מגורמים שונים כגון טיפול לא תקין, תנודות טמפרטורה, מדיום תרבות, משך תרבות וכו '.בדיקה זו יכולה להשתנות כתרבית משותפת או כמערכות תרבית אורגנוטיפית תלת-ממדית המחקות תנאי in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...