Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

이 작업은 JC에 대한 NIH 보조금(R01 EY028100, EY024963 및 EY031765)의 지원을 받았습니다. ZW는 Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant의 지원을 받았습니다.

모든 동물 실험은 광학 현미경 및 EM 이미지 생성을 위해 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(그림 3). 생체내 연구를 위한 프로토콜은 Wang et al.24로부터 얻을 수 있다. 인간 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMECs)와 관련된 모든 실험은 보스턴 아동 병원의 기관 생물 안전위원회 (IBC)의 승인을 받았습니다.
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BRB는 망막 건강과 질병에 필수적인 역할을 합니다. 혈관 투과성을 평가하는 시험관 내 기술은 장벽 (BRB / BBB) 발달 및 기능에 관한 연구에서 중요한 도구로 입증되었습니다. 여기에 설명 된 절차는 EC transcytosis의 기초가되는 분자 메커니즘을 연구하거나 BRB 투과성에 영향을 미치는 관련 분자 조절제를 평가하는 데 활용 될 수 있습니다. 시험관 내 EC 트랜스사이토시스 분석은 생체 ?...

인간의 망막은 신체에서 가장 높은 에너지를 요구하는 조직 중 하나입니다. 신경 망막의 적절한 기능을 위해서는 망막 환경을 보호하기 위해 잠재적으로 유해한 다른 분자의 제한된 흐름과 함께 산소와 영양소의 효율적인 공급이 필요하며, 이는 망막 장벽(BRB)1을 통해 매개됩니다. 중추 신경계의 혈액-뇌 장벽(BBB)과 유사하게 BRB는 눈의 선택적 장벽 역할을 하여 망막 안팎으로 이온, 물, 아미노산 및 당의 이동을 조절합니다. BRB는 또한 면역 세포, 항체 및 유해한 병원체와 같은 순환 인자에 대한 노출을 방지함으로써 망막 항상성과 면역 특권을 유지합니다2. BRB 기능 장애는 당뇨병성 망막증, 연령 관련 황반변성(AMD), 미숙아 망막병증(ROP), 망막 정맥 폐색 및 포도막염과 같은 여러 혈관 안 질환의 병태생리학에 기여하여 혈관성 부종 및 후속 시력 상실을 초래합니다 3,4,5.
BRB는 각각 두 개의 별개의 안구 혈관 네트워크에 대한 두 개의 개별 장벽으로 구성됩니다 : 망막 혈관 구조와 망막 아래의 창공 된 융모 모세 혈관. 내부 BRB(iBRB)는 주로 망막 미세혈관을 감싸는 망막 미세혈관 내피 세포(RMEC)로 구성되어 있으며, 이는 내부 망막 신경층에 영양을 공급합니다. 한편, 망막 색소 상피는 신경 감각 망막과 융모막 모세 혈관 2 사이에있는 외부 BRB의 주요 구성 요소를형성합니다. iBRB의 경우 RMEC를 통한 분자 수송은 세포 간 경로와 세포 간 경로를 통해 발생합니다(그림 1). iBRB에 걸친 높은 수준의 물질 선택성은 (i) 인접한 내피 세포(EC) 사이의 세포내 수송을 제한하는 접합 단백질 복합체의 존재 및 (ii) 낮은 세포 간 수송 속도를 유지하는 내피 세포 내의 카베올라 매개체, 수송체 및 수용체의 낮은 발현 수준에 의존합니다.1,6,7,8 . paracellular 플럭스를 조절하는 접합 복합체는 단단한 접합 (클로딘, 오클루 딘), 부착 접합 (VE cadherins) 및 갭 접합 (connexins)으로 구성되어있어 물과 작은 수용성 화합물의 통과를 허용합니다. 작은 친유성 분자가 RMEC의 내부를 가로질러 수동적으로 확산되는 반면, 더 큰 친유성 및 친수성 분자의 이동은 소포 수송 및 막 수송체(5,9)를 포함하는 ATP 구동 내피 횡단 경로에 의해 조절됩니다.
수포 트랜스사이토시스는 카베올린 매개 카베올라 트랜스사이토시스, 클라트린 의존성(및 수용체 매개) 트랜스사이토시스 및 클라트린 비의존성 마크로피노사이토시스로 분류할 수 있습니다(그림 2). 이러한 소포 수송 과정은 다양한 크기의 소포를 포함하며, 마크로 피노솜이 가장 크고 (200-500 nm 범위) 카베 올라는 가장 작으며 (평균 50-100 nm), 클라 트린 코팅 소포는 70-150 nm 범위입니다10. Caveolae는 단백질 코트가있는 플라스크 모양의 지질이 풍부한 원형질막 침범으로, 주로 카베 올린 -1로 구성되어 지질막 콜레스테롤 및 기타 구조 및 신호 전달 단백질을 카베 올린-11 도메인을 통해 결합합니다. 카베올린은 원형질막(12)에서 카베올라 안정화를 촉진하기 위해 말초로 부착된 카빈과 함께 작용한다. Caveolar 막은 또한 인슐린, 알부민, 및 고밀도 지단백질 (HDL) 및 저밀도 지단백질 (LDL)을 포함하는 순환 지단백질과 같은 다른 분자에 대한 수용체를 운반하여 내피 세포13을 통한 이동을 지원할 수 있습니다. 발달 중에, 기능성 BRB의 형성은 EC transcytosis8의 억제에 달려있다. 따라서 성숙한 망막 내피는 생리적 조건 하에서 다른 내피 세포에 비해 상대적으로 낮은 수준의 카베올라, 카베올린-1 및 알부민 수용체를 가지며장벽 특성에 기여합니다4,9.
iBRB 파괴는 많은 병리학적 눈 상태의 주요 특징이기 때문에 생체 내 및 체외에서 망막 혈관 투과성을 평가하는 방법을 개발하는 것이 필수적입니다. 이러한 방법은 손상된 BRB 무결성의 메커니즘에 대한 가능한 통찰력을 제공하고 잠재적 치료 표적의 효능을 평가하는 데 도움이 됩니다. 현재의 생체내 이미징 또는 정량적 혈관 누출 분석은 전형적으로 형광(나트륨 플루오레세인 및 덱스트란), 비색(에반스 블루 염료 및 호스래디쉬 퍼옥시다제[HRP] 기질) 또는 방사성 추적자(14)를 사용하여 현미경 이미징 또는 분리된 조직 용해물에서 혈관구조로부터 주변 망막 조직으로의 혈관 외유출을 검출한다. 혈관 무결성을 정량화하기 위한 이상적인 추적자는 불활성이어야 하며 건강하고 온전한 모세혈관 내에 갇혀 있는 동안 손상된 혈관을 자유롭게 투과할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 살아있는 안저 플루오레세인 혈관 조영술(FFA) 또는 분리된 망막 플랫 마운트에서 나트륨 플루오레세인 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트 컨쥬게이트 덱스트란(FITC-덱스트란)을 사용하는 방법은 생체 내 또는 생체 외 망막 혈관 외 유출을 정량하는 데 널리 사용됩니다. FITC-덱스트란은 크기 선택적 연구15,16,17을 위해 4-70kDa 범위의 다양한 분자량으로 이용 가능하다는 장점이 있습니다. FITC- 알부민 (~ 68 kDa)은 혈관 누출 연구18에 대한 생물학적 관련성의 대체 대형 단백질 추적자입니다. 심장 내 (19), 역궤도 또는 꼬리 정맥 (20)을 통해 주입 된 에반스 블루 염료는 또한 내인성 알부민과의 결합에 의존하여 대부분 분광 광도계 검출 또는 덜 일반적으로 플랫 마운트(20,21)에서 형광 현미경에 의해 정량화 될 수있는 큰 분자를 형성한다. 그러나 이러한 정량적 또는 광 이미징 방법론은 종종 세포 내 내 수송과 내피 간 수송을 구별하지 못합니다. 트랜스사이토시스 소포의 초구조적 시각화를 통한 트랜스사이토시스의 특이적 분석을 위해, HRP와 같은 추적 분자는 전형적으로 전자 현미경22,23,24 하에서 관찰될 수 있는 내피 세포 내의 트랜스사이토시스 소포를 찾는 데 사용된다(도 3A-C).
내피 세포 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 iBRB 모델의 개발 및 사용은 생체 내 실험을 보완하고 혈관 누출의 분자 조절자 조사를 지원하기 위해 강력하고 높은 처리량 평가를 제공할 수 있습니다. 초세포 수송 및 단단한 접합의 무결성을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석에는 경내피 전기 저항(TEER), 이온 전도도 측정(그림 4)2,25 및 소분자량 형광 추적자(26)를 사용한 시험관 내 혈관 누출 분석이 포함됩니다. 또한, BBB를 모델링하는 트랜스페린 기반 트랜스사이토시스 분석은 클라트린-의존성 트랜스사이토시스27을 탐구하기 위해 활용되었다. 그럼에도 불구하고, BRB 및 보다 구체적으로, 시험관 내에서 망막 EC 카베올라 트랜스사이토시스를 평가하기 위한 분석은 제한적이다.
이 연구에서는 iBRB 투과성 및 EC 트랜스사이토시스를 결정하기 위한 시험관 내 모델로 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC)를 사용하는 EC 트랜스사이토시스 분석을 설명합니다. 이 분석은 각각 수용체 매개 또는 카베올라 의존성 트랜스사이토시스 경로를 통해 트랜스페린 또는 HRP를 수송하는 HRMEC의 능력에 의존합니다(그림 2). 정점 챔버 (즉, 필터 삽입)에서 완전히 응축 된 HRMEC를 형광 공액 트랜스페린 (Cy3-Tf) 또는 HRP와 함께 배양하여 EC 트랜스사이토 시스를 통해 바닥 챔버로 전달 된 트랜스페린 또는 HRP의 수준에 해당하는 형광 강도를 측정했습니다. 세포 단층의 컨플루언스는 TEER을 측정함으로써 확인할 수 있으며, 이는 타이트한 접합 완전성을 나타낸다(25). TEER 및 트랜스사이토시스 분석 기술을 입증하기 위해, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)28 및 Wnt 신호전달(Wnt 리간드: Wnt3a 및 Norrin)29을 포함하여 혈관 투과성 및 EC 트랜스사이토시스의 공지된 분자 조절제가 사용되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

혈액 망막 장벽 (BRB)의 기능 장애는 여러 혈관 안 질환의 병태 생리학에 기여하여 종종 망막 부종 및 후속 시력 상실을 초래합니다. 내부 혈액-망막 장벽(iBRB)은 주로 생리적 조건에서 투과성이 낮은 망막 혈관 내피로 구성됩니다. 낮은 투과성의이 특징은 인접한 망막 미세 혈관 내피 세포 사이의 낮은 세포 간 수송 속도뿐만 아니라이를 통한 세포 간 수송 (transcytosis)에 의해 엄격하게 조절되고 유지됩니다. 망막 세포 횡단 장벽 투과성의 평가는 건강 및 질병에서 iBRB 무결성에 대한 근본적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 연구에서는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMECs)를 사용하여 iBRB 투과성을 평가하기위한 시험관 내 모델로서 내피 세포 (EC) transcytosis 분석을 설명합니다. 이 분석은 수용체 및 카베올라 매개 세포 간 수송 과정에서 각각 트랜스페린 및 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)를 수송하는 HRMEC의 능력을 평가합니다. 다공성 막에서 배양 된 완전히 합류 된 HRMEC를 형광 태그 트랜스페린 (클라 트린 의존성 트랜스 사이토 시스) 또는 HRP (카베 올라 매개 트랜스 사이토 시스)와 함께 배양하여 EC 단층 전체의 트랜스사이토 시스 수준을 나타내는 바닥 챔버로 전달 된 트랜스페린 또는 HRP의 수준을 측정했습니다. iBRB를 조절하는 알려진 경로인 Wnt 신호전달은 카베올라 매개 HRP 기반 트랜스사이토시스 분석 방법을 입증하기 위해 조절되었습니다. 여기에 설명된 EC 트랜스사이토시스 분석은 혈관 병리학에서 EC 투과성 및 iBRB 무결성의 분자 조절자를 조사하고 약물 전달 시스템을 스크리닝하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.

망막 혈관 내피의 EM 이미지는 생체 내 내피 세포에서 경세포 소포 수송 및 동굴 소포를 보여줍니다. EC 트랜스사이토시스는 광학 현미경(그림 3A)에서 HRP 함유 혈관을 반사하는 짙은 갈색 침전물이 있는 망막 단면 내에서 생체 내에서 시각화할 수 있으며, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 HRP 함유 트랜스사이토시클(그림 3B,C</stro...

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Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

이 프로토콜은 카베올라 매개 세포 횡단 수송 과정에서 세포를 가로질러 양 고추냉이 과산화 효소를 운반하는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포의 능력을 측정하여 내부 혈액 망막 장벽 투과성을 평가하는 모델로서 시험관 내 내피 세포 트랜스사이토시스 분석을 보여줍니다.

내피 세포 트랜스사이토시스 분석법(Endothelial Cell Transcytosis assay)은 내부 혈액-망막 장벽 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 모델로서 분석합니다.

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

이 프로토콜은 내피 트랜스사이토시스에 특별히 초점을 맞춘 혈액-망막 또는 혈액-뇌 장벽과 같은 선택적 혈관 장벽의 기능 및 투과성을 연구하는 데 유용한 세포 기반 모델을 제공합니다. 이 분석은 살아있는 동물이 필요 없이 설정 및 사용이 쉽습니다. 내피 세포 투과성 및 내부 혈액 망막 장벽 무결성에 영향을 미치는 전이 세포증의 다양한 분자 조절자를 조사하는 데 활용할 수 있습니다.이 분석은 혈관 생물학과 눈 및 뇌 연구에 대한 통찰력을 제공하여 BRB BBB 제어의 기초가되는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하고 장벽을 넘어 잠재적 인 약물 전달을 탐색 할 수 있습니다. 시작하려면 층류 후드 아래에서 30분 동안 각 삽입물을 200마이크로리터의 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅하여 인간 망막 미세혈관 내피 세포 또는 HRMEC를 파종하기 위한 세포 배양 필터 삽입물을 준비합니다. 용액이 필터 인서트의 전체 바닥 표면을 덮는지 확인하십시오.배양 된 HRMEC가 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양 된 페트리 접시를 가져 와서 성장 배지를 흡인합니다. 층류 후드 아래에 10 밀리리터의 1X PBS로 세포를 두 번 부드럽게 헹구어 잠재적 인 부유 세포 또는 죽은 세포를 제거하십시오. 세포를 0.5-1 밀리리터의 0.25 % 트립신 -EDTA 용액으로 해리시키고 페트리 접시를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소의 인큐베이터에 5 분 동안 놓습니다.4.5 내지 9 밀리리터의 성장 배지를 첨가하여 트립신 활성을 퀀칭하고 10 밀리리터 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 실온에서 5 분 동안 세포를 200 회 g으로 회전시킨다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 3ml의 성장 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.수동 혈구계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 계산하고 필터 삽입 당 40, 000 세포의 밀도로 시드합니다. 각 삽입물에 대한 세포 현탁액의 부피는 250 마이크로리터입니다. 투과성 삽입물이 들어 있는 웰에서 코팅 용액을 흡입하고 삽입물당 250마이크로리터의 세포 현탁액을 옮긴 다음 삽입물 중 하나에 매체만 추가하면 경내피 전기 저항 또는 TEER 측정을 위한 블랭크 컨트롤로 사용됩니다.동시에, 기저 측 챔버에 우물 당 750 마이크로 리터의 배지를 추가하십시오. 배양된 세포가 완전히 합류하고 평방 센티미터당 약 20옴의 원하는 TEER 값이 달성될 때까지 7-12일 동안 배양기에 투과성 삽입물이 있는 24웰 플레이트를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소로 보관하십시오. TEER 측정 전에, 온도 평형화를 위해 실온에서 15 내지 20분 동안 층류 후드에 셀 함유 24웰 플레이트를 배치한다.HRMEC에 대한 TEER을 측정하려면 상피 볼트/옴 미터 전기 저항 시스템을 사용하여 전극을 미터에 연결하고 먼저 70% 에탄올에 15-20분 동안 담근 다음 세포 배양 EGM 성장 배지에 잠시 담가 전극을 평형화합니다. 짧은 팁이 인서트에 있고 긴 팁이 웰 바닥에 닿도록 전극을 조심스럽게 담그고 TEER 측정을 수행합니다. 먼저 블랭크 컨트롤의 저항을 측정한 다음 각 인서트에 대해 TEER을 3배로 측정합니다.약 20옴 제곱센티미터의 TEER 값과 합류점에 도달하면 리간드로 처리하기 전에 두 챔버에서 EBM에서 0.5%FBS를 사용하여 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 24시간 동안 세포를 혈청 박탈합니다. 혈청-감소된 EBM을 분석 전반에 걸쳐 사용하였다. 세포를 형광 시아닌-3-태그와 함께 정점 챔버에서 혈청 환원 배지를 사용하여 섭씨 37도에서 60분 동안 트랜스페린 리간드로 인큐베이션한다.단분자층을 혈청 감소 배지로 정점 및 기저측으로 4회 세척한 후, 세포를 포함하는 필터 삽입물에 새로운 배지를 추가하고 삽입물을 예열된 혈청 감소 배지를 포함하는 24웰 플레이트의 신선한 웰로 옮깁니다. 인큐베이터에서 세포를 90 분 더 배양 한 다음 기저 측 챔버에서 배지를 수집합니다. 형광 검출기를 사용하여 기저측 챔버로부터의 용액의 형광 강도를 기록한다.약 20옴 제곱센티미터의 TEER 값으로 합류하면 리간드로 처리하기 전에 두 챔버 모두에서 EBM에서 0.5% FBS를 사용하여 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 24시간 동안 세포를 혈청 박탈합니다. 혈청-감소된 EBM을 분석 전반에 걸쳐 사용하였다. 다음으로, 정점 챔버의 세포를 원하는 치료 및 비히클 제어로 처리하십시오.양 고추 냉이 과산화 효소 (HRP) 밀리리터 당 5 밀리그램을 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양합니다. 새로운 혈청 환원 배지를 정점 챔버에 추가하고 삽입물을 예열 된 배지가 들어있는 신선한 우물로 옮깁니다. 인큐베이터에서 추가로 90 분 동안 단층을 배양하십시오.기저측 챔버로부터 배지를 수집 한 후, 수집 된 배지에 100 마이크로 리터의 HRP 플루오로 제닉 퍼 옥시 다제 기질을 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. 100 마이크로리터의 정지 용액으로 반응을 중지하고 형광 플레이트 판독기를 사용하여 배지에서 HRP 기질 반응 생성물의 수준을 검출합니다. 시험관 내 트랜스사이토시스 분석을 시연하기 전에, 망막에서 내피 세포 트랜스사이토시스의 시각화가 배경 정보로 표시됩니다.여기서, 광학 현미경 이미지는 DAB로 염색된 3개월 된 야생형 마우스 망막 절편으로부터의 HRP 충진 혈관 내강을 나타낸다. HRP는 역궤도 주입되었다. HRP로 채워진 망막 혈관은 광학 현미경으로 짙은 갈색 침전물로 볼 수 있습니다.투과 전자 현미경 초박형 섹션은 내부 혈액 망막 장벽을 가로 지르는 EC 트랜스 사이토 시스를 묘사하는 RMEC가있는 HRP로 채워진 트랜스 사이토 틱 혈관을 보여줍니다. 여기서 큰 소포는 잠재적으로 루미놀 쪽의 마크로피노솜과 적혈구를 반사합니다. TeM 이미지는 RMEC 내에서 HRP로 채워진 작은 트랜스사이토시스 소포, 아마도 카베올라 소포를 보여줍니다.CAV-1 항체와 이소렉틴 B4의 면역조직화학 염색은 3개월 된 야생형 마우스 망막에서 망막 혈관의 카베올라 소포 마커인 CAV-1의 국소화를 보여줍니다. 망막 내피 세포 내 면역금 표지된 CAV-1의 TeM 이미지는 CAV-1 양성 카베올라 소포의 확대 이미지와 함께 여기에 도시되어 있다. 트랜스페린을 사용하는 HRMEC에서 클라 트린 매개 EC 트랜스 사이토 시스 분석의 경우, 형광 현미경 이미지는 파란색의 DAPI로 염색 된 HRMEC 내에서 붉은 색으로 세포 내 이입 된 Cy3 트랜스페린을 보여줍니다.HRP를 사용하는 카베올라 매개 EC 트랜스사이토시스의 경우, 여기에서 Wnt 신호전달이 분석을 입증하기 위한 예로서 사용된다. Wnt 신호 전달은 최근 카베올라 매개 EC 트랜스사이토시스를 조절하는 것으로 밝혀졌습니다. 세포를 Wnt 경로 활성화제 Wnt3a-조절 배지 및 Wnt 신호전달 억제제 XAV939 및 이들의 반응성 대조군의 유무에 관계없이 재조합 노린으로 처리하였다.Wnt 활성화 제는 XAV939에 의해 역전 된 HRP 기반 트랜스 사이토 시스의 수준을 감소 시켰습니다. 올바른 TEER 측정은 단층 무결성을 결정하는 데 중요합니다. 부적절한 취급, 온도 변동, 배양 배지, 배양 기간 등과 같은 다양한 요인의 영향을 크게 받습니다.이 분석은 생체 내 조건을 모방한 공동 배양 또는 3D 유기형 배양 시스템으로 변형될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

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에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

연구

의학

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개<em&gt; 체외</em혈액 뇌 장벽의&gt; 외상성 뇌 손상 모델

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...