Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd (R01 EY028100, EY024963 og EY031765) til JC. ZW ble støttet av en Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Boston Children's Hospital for generering av lysmikroskopi og EM-bilder (figur 3). Protokoller for in vivo-studiene kan fås fra Wang et al.24. Alle eksperimenter som involverer humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs) ble godkjent av Institutional Biosafety Committee (IBC) ved Boston Children's Hospital.
1. Tilberedning av ...

BRB spiller en viktig rolle i retinal helse og sykdom. In vitro-teknikker som vurderer vaskulær permeabilitet har vist seg å være avgjørende verktøy i studier om utvikling og funksjon av barriere (BRB/BBB). Prosedyren beskrevet her kan brukes til å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for EC-transcytose eller evaluere relaterte molekylære modulatorer som påvirker BRB-permeabilitet. In vitro EC-transcytoseanalyser har flere fordeler i forhold til in vivo-analyser eller...

Den menneskelige netthinnen er et av de høyeste energikrevende vevene i kroppen. Riktig funksjon av nevrale retina krever en effektiv tilførsel av oksygen og næringsstoffer sammen med en begrenset fluks av andre potensielt skadelige molekyler for å beskytte retinalmiljøet, som er formidlet via blod-retinal barrieren (BRB)1. I likhet med blod-hjernebarrieren (BBB) i sentralnervesystemet, virker BRB som en selektiv barriere i øyet, som regulerer bevegelsen av ioner, vann, aminosyrer og sukker inn og ut av netthinnen. BRB opprettholder også retinal homeostase og dets immunprivilegier ved å forhindre eksponering for sirkulasjonsfaktorer som immunceller, antistoffer og skadelige patogener2. BRB-dysfunksjon bidrar til patofysiologien til flere vaskulære øyesykdommer, som diabetisk retinopati, aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinopati av prematuritet (ROP), retinal veneokklusjon og uveitt, noe som resulterer i vasogent ødem og påfølgende synstap 3,4,5.
BRB består av to separate barrierer for henholdsvis to forskjellige okulære vaskulære nettverk: retinal vaskulatur og fenestrert choriocapillaris under netthinnen. Den indre BRB (iBRB) består hovedsakelig av retinale mikrovaskulære endotelceller (RMECs) som fôrer retinal mikrovaskulaturen, som nærer de indre retinale nevronlagene. På den annen side danner retinalpigmentepitelet hovedkomponenten i den ytre BRB, som ligger mellom neurosensorisk retina og choriocapillaris2. For iBRB foregår molekylær transport over RMEC gjennom både paracellulære og transcellulære ruter (figur 1). Den høye graden av substansselektivitet over iBRB er avhengig av (i) tilstedeværelsen av junctional proteinkomplekser som begrenser paracellulær transport mellom tilstøtende endotelceller (ECs), og (ii) lave ekspresjonsnivåer av caveolae mediatorer, transportører og reseptorer i endotelceller som opprettholder lave transcellulære transporthastigheter 1,6,7,8 . Krysskomplekser som regulerer paracellulær fluks består av tette kryss (claudiner, okkludiner), adherenskryss (VE-kadheriner) og gapkryss (connexins), noe som tillater passasje av vann og små vannløselige forbindelser. Mens små lipofile molekyler passivt diffunderer over det indre av RMEC, reguleres bevegelsen av større lipofile og hydrofile molekyler av ATP-drevne transendotelveier, inkludert vesikulær transport og membrantransportører 5,9.
Vesikulær transcytose kan kategoriseres som caveolinmediert caveolar transcytose, clathrin-avhengig (og reseptormediert) transcytose og clathrin-uavhengig makropinocytose (figur 2). Disse vesikulære transportprosessene involverer vesikler i forskjellige størrelser, med makropinosomer som de største (fra 200-500 nm) og caveolae som de minste (i gjennomsnitt 50-100 nm), mens clathrin-belagte vesikler varierer fra 70-150 nm10. Caveolae er kolbeformede lipidrike plasmamembraninvaginasjoner med et proteinbelegg, hovedsakelig sammensatt av caveolin-1 som binder lipidmembrankolesterol og andre strukturelle og signalproteiner via deres caveolin-stillasdomene11. Caveloliner arbeider sammen med perifert festet cavin for å fremme caveolae stabilisering ved plasmamembranen12. Caveolære membraner kan også bære reseptorer for andre molekyler som insulin, albumin og sirkulerende lipoproteiner, inkludert HDL (high density lipoprotein) og low-density lipoprotein (LDL) for å hjelpe bevegelsen over endotelceller13. Under utviklingen avhenger dannelsen av funksjonell BRB av undertrykkelsen av EC-transcytose8. Eldre retinal endotel har derfor relativt lave nivåer av caveolae-, caveolin-1- og albuminreseptorer med hensyn til andre endotelceller under fysiologiske forhold, noe som bidrar til barriereegenskapene 4,9.
Fordi iBRB-nedbrytning er et viktig kjennetegn ved mange patologiske øyeforhold, er det viktig å utvikle metoder for å vurdere retinal vaskulær permeabilitet in vivo og in vitro. Disse metodene bidrar til å gi sannsynlig innsikt i mekanismene for kompromittert BRB-integritet og vurdere effekten av potensielle terapeutiske mål. Nåværende in vivo-avbildning eller kvantitative vaskulære lekkasjeanalyser bruker vanligvis fluorescerende (natriumfluorescein og dextran), kolorimetrisk (Evans Blue dye og pepperrotperoksidase [HRP] substrat) eller radioaktive sporstoffer14 for å oppdage ekstravasering fra vaskulaturen til omkringliggende retinale vev med mikroskopavbildning eller i isolert vevslysat. En ideell tracer for kvantifisering av vaskulær integritet bør være inert og stor nok til fritt å gjennomsyre kompromitterte kar mens den er begrenset i sunne og intakte kapillærer. Metoder som benytter natriumfluorescein eller fluoresceinisotiocyanat-konjugert dekstran (FITC-dextran) i levende fundus fluorescein angiografi (FFA) eller isolerte retinal flate fester er mye brukt for kvantifisering av retinal ekstravasasjon in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har fordelen av å være tilgjengelig i forskjellige molekylvekter fra 4-70 kDa for størrelsesselektive studier15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) er et alternativt stort proteinsporstoff av biologisk relevans for vaskulære lekkasjestudier18. Evans Blue dye, injisert intrakardialt19, retro-orbitalt, eller gjennom halevenen 20, er også avhengig av bindingen med endogent albumin for å danne et stort molekyl som kan kvantifiseres ved for det meste spektrofotometrisk deteksjon eller, mindre vanlig, fluorescensmikroskopi i flate monteringer20,21. Disse kvantitative eller lette avbildningsmetodene skiller imidlertid ofte ikke paracellulær transport fra transendoteltransport. For den spesifikke analysen av transcytose med ultrastrukturell visualisering av transcytoserte vesikler, brukes spormolekyler som HRP vanligvis til å lokalisere transcytoserte vesikler i endotelceller som kan observeres under et elektronmikroskop22,23,24 (figur 3A-C).
Utviklingen og bruken av in vitro iBRB-modeller for å evaluere endotelcellepermeabiliteten kan gi robust og høy gjennomstrømningsvurdering for å utfylle in vivo-eksperimenter og hjelpe undersøkelsen av molekylære regulatorer av vaskulær lekkasje. Vanlige analyser for å vurdere paracellulær transport og integritet av tette kryss inkluderer trans-endotelial elektrisk motstand (TEER), et mål på ionisk konduktans (figur 4) 2,25, og in vitro vaskulær lekkasjeanalyse ved bruk av fluorescerende sporstoffer med liten molekylvekt26. I tillegg har transferrinbasert transcytoseanalyse modellering BBB blitt brukt til å utforske clathrin-avhengig transcytose27. Til tross for dette er analyser for å evaluere BRB og mer spesifikt retinal EC caveolar transcytose in vitro begrenset.
I denne studien beskriver vi en EC-transcytoseanalyse ved bruk av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs) som en in vitro-modell for å bestemme iBRB-permeabilitet og EC-transcytose. Denne analysen er avhengig av HRMECs evne til å transportere transferrin eller HRP via henholdsvis reseptormedierte eller caveolae-avhengige transcytoseveier (figur 2). HRMEC dyrket til full konfluens i apikalkammeret (dvs. filterinnsats) ble inkubert med fluorescerende konjugert transferrin (Cy3-Tf) eller HRP for å måle fluorescensintensiteten tilsvarende nivåene av transferrin eller HRP overført til bunnkammeret gjennom EC-transcytose alene. Sammenløp av cellemonolaget kan bekreftes ved å måle TEER, noe som indikerer den tette kryssintegriteten25. For å demonstrere TEER- og transcytoseanalyseteknikken ble kjente molekylære modulatorer av vaskulær permeabilitet og EC-transcytose brukt, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)28 og de i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a og Norrin)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

Dysfunksjon av blod-retinal barrieren (BRB) bidrar til patofysiologien til flere vaskulære øyesykdommer, noe som ofte resulterer i retinal ødem og påfølgende synstap. Den indre blod-retinale barrieren (iBRB) består hovedsakelig av retinal vaskulært endotel med lav permeabilitet under fysiologiske forhold. Denne egenskapen med lav permeabilitet er tett regulert og opprettholdt av lave paracellulære transporthastigheter mellom tilstøtende retinale mikrovaskulære endotelceller, samt transcellulær transport (transcytose) gjennom dem. Vurderingen av retinal transcellulær barrierepermeabilitet kan gi grunnleggende innsikt i iBRB-integritet i helse og sykdom. I denne studien beskriver vi en endotelcelle (EC) transcytoseanalyse, som en in vitro-modell for evaluering av iBRB-permeabilitet, ved bruk av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs). Denne analysen vurderer HRMECs evne til å transportere transferrin og pepperrotperoksidase (HRP) i henholdsvis reseptor- og caveolaemedierte transcellulære transportprosesser. Fullt konfluerte HRMEC dyrket på porøs membran ble inkubert med fluorescerende merket transferrin (clathrin-avhengig transcytose) eller HRP (caveolae-mediert transcytose) for å måle nivåene av transferrin eller HRP overført til bunnkammeret, noe som indikerer transcytosenivåer over EC-monolaget. Wnt-signalering, en kjent vei som regulerer iBRB, ble modulert for å demonstrere caveolae-mediert HRP-basert transcytoseanalysemetode. EC-transcytoseanalysen beskrevet her kan gi et nyttig verktøy for å undersøke molekylære regulatorer av EC-permeabilitet og iBRB-integritet i vaskulære patologier og for screening av legemiddelleveringssystemer.

EM-bilder av retinalt vaskulært endotel viser transcytotisk vesikulær transport og huleolære vesikler i endotelceller in vivo. EC-transcytose kan visualiseres in vivo i retinale tverrsnitt med mørkebrunt bunnfall som reflekterer HRP-holdige blodkar under et lysmikroskop (figur 3A) og som elektrontett bunnfall som indikerer HRP-holdige transcytotiske vesikler (figur 3B, C) ved hjelp av et transmisjons...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Denne protokollen illustrerer en in vitro endotelcelletranscytoseanalyse som en modell for å evaluere indre blod-retinal barrierepermeabilitet ved å måle evnen til humane retinale mikrovaskulære endotelceller til å transportere pepperrotperoksidase over celler i caveolae-medierte transcellulære transportprosesser.

Endotelcelletranscytoseanalyse som en in vitro-modell for å evaluere indre blod-retinal barrierepermeabilitet

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Denne protokollen gir en nyttig cellebasert modell for å studere funksjonen og permeabiliteten til selektive vaskulære barrierer som blod-retinal eller blod-hjernebarriere med et spesifikt fokus på endoteltranscytose. Denne analysen er enkel å sette opp og bruke og krever ingen levende dyr. Det kan brukes til å undersøke ulike molekylære regulatorer av endotelcellepermeabilitet og transcytose som påvirker integriteten til indre blod-retinal barriere.Denne analysen kan gi innsikt i vaskulær biologi og øye- og hjerneforskning, noe som gir bedre forståelse av molekylmekanismer som ligger til grunn for BRB BBB-kontroll og utforsker potensiell legemiddellevering over barrierene. For å begynne med, klargjør cellekulturfilterinnsatsene for såing av humane retinale mikrovaskulære endotelceller eller HRMEC, ved å belegge hver innsats med 200 mikroliter 0,1% gelatinoppløsning i 30 minutter under en laminær strømningshette. Forsikre deg om at løsningen dekker hele bunnflaten på filterinnsatsen.Ta en petriskål med dyrkede HRMECs inkubert ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, og aspirer vekstmediet. Skyll cellene forsiktig to ganger med 10 milliliter 1X PBS under den laminære strømningshetten for å kvitte seg med potensielle flytende eller døde celler. Dissocier cellene med 0,5 til 1 milliliter 0,25% trypsin-EDTA-løsning og plasser petriskålen i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 5 minutter.Slukk trypsinaktiviteten ved å tilsette 4, 5 til 9 ml vekstmedier og overfør cellesuspensjonen til et 15 milliliter rør ved hjelp av en 10 milliliter pipette. Spinn cellene ved 200 ganger g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten forsiktig og resuspender pelleten i 3 ml vekstmedier.Tell antall celler ved hjelp av et manuelt hemocytometer eller en automatisert celleteller og frø med en tetthet på 40.000 celler per filterinnsats. Volumet av cellesuspensjon for hver innsats er 250 mikroliter. Aspirer beleggløsningen fra brønnene som inneholder permeable innsatser og overfør 250 mikroliter av cellesuspensjonen per innsats, og tilsett deretter bare medium til en av innsatsene, som vil bli brukt som en tom kontroll for transendotelial elektrisk motstand, eller TEER, måling.Samtidig tilsettes også 750 mikroliter medium per brønn i de basolaterale kamrene. Hold 24-brønnsplaten med permeable innsatser i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 7 til 12 dager til de dyrkede cellene blir helt sammenflytende og ønsket TEER-verdi på rundt 20 ohm per kvadratcentimeter oppnås. Før TEER-målinger, plasser den celleholdige 24-brønnsplaten i den laminære strømningshetten ved romtemperatur i 15 til 20 minutter for temperaturbalansering.For å måle TEER for HRMECs, ved hjelp av et epitelvolt / ohm meter elektrisk motstandssystem, koble elektroden til måleren, og balansere elektroden ved først å suge den i 70% etanol i 15 til 20 minutter og deretter nedsenke den kort i cellekulturen EGM vekstmedium. Utfør TEER-måling ved å senke elektroden forsiktig, slik at den kortere spissen er i innsatsen og den lengre spissen berører bunnen av brønnen. Mål motstanden over den tomme kontrollen først, og mål deretter TEER i tre eksemplarer for hver innsats.Ved å nå samløp med TEER-verdier rundt 20 ohm kvadratcentimeter, serum-frata cellene i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid ved bruk av 0,5% FBS i EBM i begge kamrene før behandling med liganden. Serumredusert EBM ble brukt gjennom hele analysen. Inkuber cellene ved hjelp av det serumreduserte mediet i det apikale kammeret med fluorescerende cyanin-3-tag til transferrinligand i 60 minutter ved 37 grader Celsius.Etter å ha vasket monolaget apikalt og basolateralt 4 ganger med det serumreduserte mediet, tilsett friskt medium til filterinnsatsene som inneholder cellene og overfør innsatsene til friske brønner på 24-brønnsplaten som inneholder forvarmet serumredusert medium. Inkuber cellene i ytterligere 90 minutter i inkubatoren og samle deretter mediet fra det basolaterale kammeret. Registrer fluorescensintensiteten til løsningen fra det basolaterale kammeret ved hjelp av en fluorescensdetektor.Ved å nå samløp med TEER-verdier rundt 20 ohm kvadratcentimeter, serumfrata cellene i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid ved bruk av 0,5% FBS i EBM i begge kamrene før behandling med liganden. Serumredusert EBM ble brukt gjennom hele analysen. Deretter behandler du cellene i det apikale kammeret med de ønskede behandlingene og kjøretøykontrollene.Tilsett 5 milligram per milliliter pepperrotperoksidase, eller HRP, til cellene, og inkuber i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Tilsett ferskt serumredusert medium til apikalkammeret og overfør innsatsene til en frisk brønn som inneholder forvarmede medier. Inkuber monolaget i ytterligere 90 minutter i inkubatoren.Etter å ha samlet medium fra det basolaterale kammeret, tilsett 100 mikroliter HRP fluorogent peroksidasesubstrat til det oppsamlede medium og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Stopp reaksjonen med 100 mikroliter stoppløsning og oppdag nivåene av HRP-substratreaksjonsprodukt i mediet ved hjelp av en fluorescensplateleser. Før man demonstrerer in vitro transcytoseanalyser, vises visualisering av endotelcelletranscytose i netthinnen som bakgrunnsinformasjon.Her viser lysmikroskopbildet et HRP-fylt blodkarlumen fra en 3 måneder gammel villtype mus retinal seksjon farget med DAB. HRP ble retro-orbitalt injisert. HRP-fylte retinale kar kan ses som mørkebrunt bunnfall under lysmikroskopet.Transmisjonselektronmikroskop ultratynt snitt viser HRP-fylte transcytotiske kar med RMEC som viser EC-transcytose over den indre blod-retinale barrieren. Her reflekterer den store vesikkelen potensielt makropinosom og en rød blodcelle på luminolsiden. TeM-bilde viser HRP-fylte små transcytotiske vesikler, sannsynligvis caveola-vesikler, innenfor RMEC.Immunhistokjemifarging av CAV-1-antistoff og isolektin B4 demonstrerer lokaliseringen av CAV-1, En markør for caveola-vesikler i retinale blodkar, i den 3 måneder gamle villtype musehinnen. TeM-bilde av immungold-merket CAV-1 i retinale endotelceller er vist her med et forstørret bilde av CAV-1 positiv caveola vesikkel. For clathrin-mediert EC-transcytoseanalyse i HRMECs ved bruk av transferrin, viser her et fluorescensmikroskopbilde endocytosert Cy3-transferrin i rød farge innen HRMECs farget med DAPI i blått.For caveolae-mediert EC-transcytose ved bruk av HRP, brukes Wnt-signalering her som et eksempel for å demonstrere analysen. Wnt-signalering ble nylig funnet for å regulere caveolae-mediert EC-transcytose. Cellene ble behandlet med Wnt-baneaktivator Wnt3a-betinget medium og rekombinant Norrin, med eller uten Wnt-signalhemmer XAV939 og deres reaktive kontroller.WNT-aktivatorer reduserte nivået av HRP-basert transcytose, som ble reversert av XAV939. Korrekt TER-måling er avgjørende for å bestemme monolagsintegritet. Det påvirkes sterkt av ulike faktorer som feil håndtering, temperatursvingninger, kulturmedium, kulturvarighet, etc.Denne analysen kan modifiseres som co-kultur eller 3D organotypiske kultursystemer som etterligner in vivo-forhold.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantasjon i en In vitro Simulert ischemia / reperfusjon Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

En<em&gt; In vivo</em&gt; Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Bruke kvantitativ real-time PCR fastslår Donor Cell engraftment i en konkurransedyktig Murine benmargstransplantasjon Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Strekk i Brain mikrovaskulær endotelceller (cend) som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatic Brain Injury Modell av blod-hjerne barrieren

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Sette opp en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Rat blod-hjerne barrieren (BBB): Et fokus på BBB Ugjennomtrengelighet og Receptor-mediert transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Eksitotoksiske Stimulering av Hjerne Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glukose deprivasjon og reoksygenering som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Iskemi-reperfusjonskade modell for å studere blod-hjernebarrieren Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akutt retinal modell for evaluering Blood Netthinne Barrier på brudd og mulige narkotika for behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Fremstilling og<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av magnetisert mir-modifisert endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; I Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...