Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios do NIH (R01 EY028100, EY024963 e EY031765) para JC. A ZW foi apoiada por um Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Boston Children's Hospital para a geração de microscopia de luz e imagens EM (Figura 3). Os protocolos para os estudos in vivo podem ser obtidos de Wang et al.24. Todos os experimentos envolvendo células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) foram aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC) do Boston Children's Hosp...

O BRB desempenha um papel essencial na saúde e na doença da retina. Técnicas in vitro que avaliam a permeabilidade vascular têm se mostrado ferramentas cruciais em estudos sobre o desenvolvimento e a função da barreira (BRB/BBB). O procedimento aqui descrito poderia ser utilizado para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à transcitose CE ou avaliar moduladores moleculares relacionados que afetam a permeabilidade do BRB. In vitro Os ensaios de transcitose EC têm múltiplas vantagens em r...

A retina humana é um dos tecidos que mais demandam energia no corpo. O bom funcionamento da retina neural requer um suprimento eficiente de oxigênio e nutrientes, juntamente com um fluxo restrito de outras moléculas potencialmente nocivas para proteger o ambiente da retina, que é mediado pela barreira sangue-retina (BRB)1. Semelhante à barreira hematoencefálica (BBB) no sistema nervoso central, o BRB atua como uma barreira seletiva no olho, regulando o movimento de íons, água, aminoácidos e açúcar dentro e fora da retina. O BRB também mantém a homeostase da retina e seu privilégio imunológico, impedindo a exposição a fatores circulatórios, como células imunes, anticorpos e patógenos nocivos2. A disfunção do BRB contribui para a fisiopatologia de diversas doenças oculares vasculares, como retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão da veia retiniana e uveíte, resultando em edema vasogênico e subsequente perda de visão 3,4,5.
O BRB consiste em duas barreiras separadas para duas redes vasculares oculares distintas, respectivamente: a vasculatura da retina e o coriocapilar fenestrado abaixo da retina. O BRB interno (iBRB) é composto principalmente de células endoteliais microvasculares da retina (RMECs) que revestem a microvasculatura da retina, que nutre as camadas neuronais internas da retina. Por outro lado, o epitélio pigmentar da retina forma o principal componente do BRB externo, que se encontra entre a retina neurossensorial e o coriocapilar2. Para o iBRB, o transporte molecular através das RMECs ocorre por via paracelular e transcelular (Figura 1). O alto grau de seletividade de substâncias em todo o iBRB depende (i) da presença de complexos proteicos juncionais que restringem o transporte paracelular entre células endoteliais (CE) adjacentes e (ii) baixos níveis de expressão de mediadores, transportadores e receptores de cavéolas dentro das células endoteliais que mantêm baixas taxas de transporte transcelular 1,6,7,8 . Os complexos juncionais que regulam o fluxo paracelular são compostos por junções apertadas (claudinas, occludinas), junções aderentes (caderinas VE) e junções gap (conexinas), permitindo a passagem de água e pequenos compostos solúveis em água. Enquanto pequenas moléculas lipofílicas se difundem passivamente pelo interior das RMECs, o movimento de moléculas lipofílicas e hidrofílicas maiores é regulado por vias transendoteliais impulsionadas por ATP, incluindo transporte vesicular e transportadores de membrana 5,9.
A transcitose vesicular pode ser categorizada em transcitose caveolar mediada por caveolina, transcitose dependente de clatrina (e mediada por receptor) e macropinocitose independente de clatrina (Figura 2). Esses processos de transporte vesicular envolvem vesículas de tamanhos diferentes, com macropinossomos sendo os maiores (variando de 200-500 nm) e cavéolas sendo os menores (com média de 50-100 nm), enquanto as vesículas revestidas de clatrina variam de 70-150 nm10. As cavéolas são invaginações de membrana plasmática ricas em lipídios em forma de frasco com revestimento proteico, composto principalmente de caveolina-1 que se liga ao colesterol da membrana lipídica e a outras proteínas estruturais e sinalizadoras através de seu domínio cavamolíne-andaime11. As caveolinas trabalham em conjunto com a cavina periféricamente ligada para promover a estabilização das cavéolas na membrana plasmática12. As membranas caveolares também podem transportar receptores para outras moléculas, como insulina, albumina e lipoproteínas circulantes, incluindo lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína de baixa densidade (LDL), para auxiliar seu movimento através das células endoteliais13. Durante o desenvolvimento, a formação de BRB funcional depende da supressão da transcitose CE8. O endotélio retiniano maduro, portanto, apresenta níveis relativamente baixos de receptores de cavéolas, casofalina-1 e albumina em relação a outras células endoteliais em condições fisiológicas, contribuindo para suas propriedades de barreira 4,9.
Como a degradação do iBRB é uma das principais características de muitas condições oculares patológicas, é essencial desenvolver métodos para avaliar a permeabilidade vascular da retina in vivo e in vitro. Esses métodos ajudam a fornecer insights prováveis sobre os mecanismos de integridade comprometida do BRB e a avaliar a eficácia de potenciais alvos terapêuticos. Exames de imagem in vivo atuais ou ensaios quantitativos de vazamento vascular geralmente empregam fluorescentes (fluoresceína de sódio e dextrano), colorimétricos (corante Evans Blue e substrato de peroxidase de rábano [HRP]) ou marcadores radioativos14 para detectar extravasamento da vasculatura para tecidos retinianos circundantes com imagens de microscópio ou em lisado de tecido isolado. Um marcador ideal para quantificar a integridade vascular deve ser inerte e grande o suficiente para permear livremente os vasos comprometidos enquanto confinados em capilares saudáveis e intactos. Métodos que empregam fluoresceína de sódio ou dextrano conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) em angiografia de fluoresceína de fundo de olho vivo (FFA) ou montagens planas isoladas da retina são amplamente utilizados para quantificar o extravasamento da retina in vivo ou ex vivo. O FITC-dextran tem a vantagem de estar disponível em diferentes pesos moleculares variando de 4-70 kDa para estudos seletivos de tamanho15,16,17. A albumina FITC (~68 kDa) é um traçador alternativo de proteínas de grande porte de relevância biológica para estudos de extravasamento vascular18. O corante Evans Blue, injetado intracardialmente19, retro-orbitalmente ou através da veia caudal 20, também depende de sua ligação com albumina endógena para formar uma molécula grande que pode ser quantificada principalmente por detecção espectrofotométrica ou, menos comumente, microscopia de fluorescência em montagens planas20,21. Essas metodologias de imagem quantitativa ou leve, no entanto, muitas vezes não distinguem o transporte paracelular do transporte transendotelial. Para a análise específica da transcitose com visualização ultraestrutural de vesículas transcitosadas, moléculas traçadoras, como a HRP, são tipicamente utilizadas para localizar vesículas transcitosadas dentro de células endoteliais que podem ser observadas em microscópio eletrônico 22,23,24 (Figura 3A-C).
O desenvolvimento e o uso de modelos de iBRB in vitro para avaliar a permeabilidade das células endoteliais poderiam fornecer uma avaliação robusta e de alto rendimento para complementar os experimentos in vivo e auxiliar na investigação de reguladores moleculares de vazamento vascular. Ensaios comumente utilizados para avaliar o transporte paracelular e a integridade de junções apertadas incluem resistência elétrica transendotelial (TEER), uma medida de condutância iônica (Figura 4)2,25 e ensaio de vazamento vascular in vitro usando marcadores fluorescentes de pequeno peso molecular26. Além disso, ensaios de transcitose à base de transferrina modelando BBB têm sido utilizados para explorar a transcitose dependente de clatrina27. Apesar disso, os ensaios para avaliar o BRB e, mais especificamente, a transcitose caveolar da CE retiniana in vitro são limitados.
Neste estudo, descrevemos um ensaio de transcitose CE usando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) como modelo in vitro para determinar a permeabilidade do iBRB e a transcitose CE. Este ensaio baseia-se na capacidade dos HRMECs de transportar transferrina ou HRP através das vias de transcitose mediadas por receptores ou dependentes de cavéolas, respectivamente (Figura 2). Os HRMECs cultivados até a confluência total na câmara apical (ou seja, inserção de filtro) foram incubados com transferrina conjugada fluorescente (Cy3-Tf) ou HRP para medir a intensidade de fluorescência correspondente aos níveis de transferrina ou HRP transferidos para a câmara inferior apenas através da transcitose CE. A confluência da monocamada celular pode ser confirmada pela medição do TEER, indicando a integridade da junção apertada25. Para demonstrar a técnica de TEER e ensaio de transcitose, foram utilizados moduladores moleculares conhecidos de permeabilidade vascular e transcitose CE, incluindo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)28 e aqueles na sinalização Wnt (ligantes Wnt: Wnt3a e Norrin)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

A disfunção da barreira sangue-retina (BRB) contribui para a fisiopatologia de várias doenças oculares vasculares, muitas vezes resultando em edema da retina e subsequente perda de visão. A barreira hemato-retiniana interna (iBRB) é composta principalmente de endotélio vascular da retina com baixa permeabilidade em condições fisiológicas. Esta característica de baixa permeabilidade é rigidamente regulada e mantida por baixas taxas de transporte paracelular entre as células endoteliais microvasculares adjacentes da retina, bem como o transporte transcelular (transcitose) através delas. A avaliação da permeabilidade da barreira transcelular da retina pode fornecer insights fundamentais sobre a integridade do iBRB na saúde e na doença. Neste estudo, descrevemos um ensaio de transcitose de células endoteliais (CE), como um modelo in vitro para avaliar a permeabilidade do iBRB, utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs). Este ensaio avalia a capacidade dos HRMECs de transportar transferrina e peroxidase de rábano (HRP) em processos de transporte transcelular mediados por receptores e cavéolas, respectivamente. HRMECs totalmente confluentes cultivados em membrana porosa foram incubados com transferrina marcada com fluorescência (transcitose dependente de clatrina) ou HRP (transcitose mediada por cavéolas) para medir os níveis de transferrina ou HRP transferidos para a câmara inferior, indicativos de níveis de transcitose em toda a monocamada da CE. A sinalização Wnt, uma via conhecida que regula o iBRB, foi modulada para demonstrar o método de ensaio de transcitose baseado em HRP mediado por cavéolas. O ensaio de transcitose EC descrito aqui pode fornecer uma ferramenta útil para investigar os reguladores moleculares da permeabilidade CE e da integridade do iBRB em patologias vasculares e para o rastreamento de sistemas de liberação de medicamentos.

Imagens EM de endotélio vascular da retina mostram transporte vesicular transcitótico e vesículas caveolares em células endoteliais in vivo. A transcitose EC pode ser visualizada in vivo dentro de cortes transversais da retina com precipitado marrom escuro refletindo vasos sanguíneos contendo HRP sob um microscópio de luz (Figura 3A) e como precipitado denso em elétrons indicativo de vesículas transcitóticas contendo HRP (<strong class="xfig...

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Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Este protocolo ilustra um ensaio de transcitose de células endoteliais in vitro como um modelo para avaliar a permeabilidade da barreira sangue-retina interna, medindo a capacidade das células endoteliais microvasculares da retina humana de transportar peroxidase de rábano através das células em processos de transporte transcelular mediados por cavéolas.

Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Este protocolo fornece um modelo celular útil para estudar a função e a permeabilidade de barreiras vasculares seletivas, como a barreira hemato-retiniana ou hematoencefálica, com foco específico na transcitose endotelial. Este ensaio é fácil de configurar e usar, não exigindo animais vivos. Pode ser utilizado para investigar vários reguladores moleculares da permeabilidade das células endoteliais e da transcitose que afetam a integridade da barreira hemato-retiniana interna.Este ensaio pode fornecer insights sobre biologia vascular e pesquisa ocular e cerebral, permitindo uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao controle do BRB BBB e explorando a potencial entrega de medicamentos através das barreiras. Para começar, prepare as inserções de filtro de cultura celular para semear células endoteliais microvasculares da retina humana ou HRMECs, revestindo cada inserção com 200 microlitros de solução de gelatina a 0,1% por 30 minutos sob um exaustor de fluxo laminar. Certifique-se de que a solução cobre toda a superfície inferior da inserção do filtro.Pegue uma placa de Petri com HRMECs cultivados incubados a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e aspirar o meio de crescimento. Lave suavemente as células duas vezes com 10 mililitros de 1X PBS sob o exaustor de fluxo laminar para se livrar das potenciais células flutuantes ou mortas. Dissociar as células com 0,5 a 1 mililitro de solução de 0,25% tripsina-EDTA e colocar a placa de Petri na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 5 minutos.Apague a atividade da tripsina adicionando 4,5 a 9 mililitros de meios de crescimento e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros usando uma pipeta de 10 mililitros. Gire as células a 200 vezes g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mililitros de meios de crescimento.Conte o número de células usando um hemocitômetro manual ou um contador de células automatizado e sementes a uma densidade de 40.000 células por inserção de filtro. O volume de suspensão celular para cada pastilha é de 250 microlitros. Aspirar a solução de revestimento dos poços contendo inserções permeáveis e transferir 250 microlitros da suspensão celular por inserção, em seguida, adicione apenas o meio a uma das pastilhas, que será usado como um controle em branco para a medição da resistência elétrica transendotelial, ou TEER.Simultaneamente, adicione também 750 microlitros de meio por poço nas câmaras basolaterais. Mantenha a placa de 24 poços com inserções permeáveis na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 7 a 12 dias até que as células cultivadas se tornem totalmente confluentes e o valor TEER desejado de cerca de 20 ohms por centímetro quadrado seja alcançado. Antes das medições TEER, coloque a placa de 24 poços contendo células no exaustor de fluxo laminar à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos para equilíbrio da temperatura.Para medir o TEER para HRMECs, usando um sistema epitelial de resistência elétrica do medidor de volts/ohm, conecte o eletrodo ao medidor e equilibre o eletrodo primeiro mergulhando-o em etanol a 70% por 15 a 20 minutos e, em seguida, imergindo-o brevemente no meio de crescimento EGM de cultura celular. Realize a medição TEER imergindo cuidadosamente o eletrodo, de modo que a ponta mais curta esteja na inserção e a ponta mais longa toque o fundo do poço. Meça a resistência através do controle em branco primeiro e, em seguida, para cada inserção, meça o TEER em triplicados.Ao atingir a confluência com os valores de TEER em torno de 20 ohm centímetros quadrados, privar as células de soro por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono usando 0,5% de FBS em EBM em ambas as câmaras antes do tratamento com o ligante. A EBM com redução sérica foi utilizada durante todo o ensaio. Incubar as células usando o meio reduzido de soro na câmara apical com ligante fluorescente de cianina 3-tag para transferrina por 60 minutos a 37 graus Celsius.Depois de lavar a monocamada apicamente e basolateralmente 4 vezes com o meio com soro reduzido, adicione o meio fresco às inserções de filtro contendo as células e transfira as inserções para poços frescos da placa de 24 poços contendo meio pré-aquecido com soro reduzido. Incubar as células por mais 90 minutos na incubadora e, em seguida, coletar o meio da câmara basolateral. Registar a intensidade de fluorescência da solução a partir da câmara basolateral utilizando um detector de fluorescência.Ao atingir a confluência com os valores de TEER em torno de 20 ohm centímetros quadrados, privar as células de soro por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono usando 0,5% de FBS em EBM em ambas as câmaras antes do tratamento com o ligante. A EBM com redução sérica foi utilizada durante todo o ensaio. Em seguida, trate as células na câmara apical com os tratamentos desejados e controles do veículo.Adicione 5 miligramas por mililitro de peroxidase de rábano, ou HRP, às células e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Adicione o meio fresco com soro reduzido à câmara apical e transfira as inserções para um poço fresco contendo meio pré-aquecido. Incubar a monocamada por mais 90 minutos na incubadora.Após a coleta do meio da câmara basolateral, adicionar 100 microlitros de substrato de peroxidase fluorogênica HRP ao meio coletado e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Pare a reação com 100 microlitros de solução de parada e detecte os níveis do produto de reação do substrato HRP no meio usando um leitor de placa de fluorescência. Antes de demonstrar os ensaios de transcitose in vitro, a visualização da transcitose de células endoteliais na retina é mostrada como informação de base.Aqui, a imagem do microscópio de luz mostra um lúmen de vaso sanguíneo cheio de HRP de uma seção de retina de camundongo do tipo selvagem de 3 meses de idade corada com DAB. A HRP foi injetada retroorbitalmente. Os vasos da retina cheios de HRP podem ser vistos como precipitado marrom escuro sob o microscópio de luz.A seção ultrafina do microscópio eletrônico de transmissão mostra vasos transcitóticos cheios de HRP com RMECs representando transcitose CE através da barreira hemato-retiniana interna. Aqui, a grande vesícula reflete potencialmente o macropinossomo e um glóbulo vermelho no lado do luminol. A imagem TeM mostra pequenas vesículas transcitóticas cheias de HRP, provavelmente vesículas de caveola, dentro do RMEC.A coloração imuno-histoquímica do anticorpo CAV-1 e da isolectina B4 demonstra a localização do CAV-1, um marcador de vesículas de caveola nos vasos sanguíneos da retina, na retina de camundongo do tipo selvagem de 3 meses de idade. A imagem TeM de CAV-1 marcada com imunoouro dentro das células endoteliais da retina é mostrada aqui com uma imagem ampliada da vesícula de caveola positiva para CAV-1. Para o ensaio de transcitose EC mediada por clatrina em HRMECs usando transferrina, aqui, uma imagem de microscópio de fluorescência mostra a transferrina Cy3 endocitosada na cor vermelha dentro de HRMECs corados com DAPI em azul.Para transcitose EC mediada por cavéolas usando HRP, a sinalização Wnt aqui é usada como um exemplo para demonstrar o ensaio. Recentemente, descobriu-se que a sinalização Wnt regula a transcitose CE mediada por cavéolas. As células foram tratadas com o ativador da via Wnt Wnt3a-condicionado meio e Norrin recombinante, com ou sem inibidor de sinalização Wnt XAV939 e seus controles reativos.Os ativadores Wnt reduziram o nível de transcitose baseada em HRP, que foram revertidos pelo XAV939. A medição correta do TEER é crucial para determinar a integridade da monocamada. É muito afetado por vários fatores, como manuseio inadequado, flutuações de temperatura, meio de cultura, duração da cultura, etc.Este ensaio pode ser modificado como sistemas de co-cultura ou cultura organotípica 3D imitando condições in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

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Medicina

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

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Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation

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