Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (R01 EY028100, EY024963 y EY031765) a JC. ZW fue apoyado por una Beca de Iniciación de Carrera de la Fundación del Ojo de los Caballeros Templarios.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Boston Children's Hospital para la generación de microscopía óptica e imágenes EM (Figura 3). Los protocolos para los estudios in vivo pueden obtenerse de Wang et al.24. Todos los experimentos con células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC) fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) del...

BRB juega un papel esencial en la salud y la enfermedad de la retina. Las técnicas in vitro que evalúan la permeabilidad vascular han demostrado ser herramientas cruciales en los estudios relacionados con el desarrollo y la función de la barrera (BRB/BBB). El procedimiento descrito aquí podría utilizarse para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la transcitosis EC o evaluar los moduladores moleculares relacionados que afectan la permeabilidad del BRB. In vitro Los ensayos de transcitos...

La retina humana es uno de los tejidos más exigentes de energía en el cuerpo. El buen funcionamiento de la retina neural requiere un suministro eficiente de oxígeno y nutrientes junto con un flujo restringido de otras moléculas potencialmente dañinas para proteger el ambiente retiniano, que está mediado a través de la barrera hematoretiniana (BRB)1. Similar a la barrera hematoencefálica (BBB) en el sistema nervioso central, el BRB actúa como una barrera selectiva en el ojo, regulando el movimiento de iones, agua, aminoácidos y azúcar dentro y fuera de la retina. BRB también mantiene la homeostasis retiniana y su privilegio inmunológico al prevenir la exposición a factores circulatorios como células inmunes, anticuerpos y patógenos dañinos2. La disfunción BRB contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades oculares vasculares, como la retinopatía diabética, la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la retinopatía del prematuro (RP), la oclusión de la vena retiniana y la uveítis, lo que resulta en edema vasogénico y posterior pérdida de visión 3,4,5.
El BRB consiste en dos barreras separadas para dos redes vasculares oculares distintas, respectivamente: la vasculatura retiniana y el coriocapilar fenestrado debajo de la retina. El BRB interno (iBRB) está compuesto principalmente por células endoteliales microvasculares de la retina (RMEC) que recubren la microvasculatura retiniana, que nutre las capas neuronales internas de la retina. Por otro lado, el epitelio pigmentario de la retina forma el componente principal del BRB externo, que se encuentra entre la retina neurosensorial y el coriocapilar2. Para el iBRB, el transporte molecular a través de RMEC tiene lugar a través de rutas paracelulares y transcelulares (Figura 1). El alto grado de selectividad de sustancias a través del iBRB se basa en (i) la presencia de complejos de proteínas de unión que restringen el transporte paracelular entre células endoteliales adyacentes (CE), y (ii) bajos niveles de expresión de mediadores, transportadores y receptores de caveolas dentro de las células endoteliales que mantienen bajas tasas de transporte transcelular 1,6,7,8 . Los complejos de unión que regulan el flujo paracelular están compuestos por uniones estrechas (claudinas, ocludinas), uniones adherentes (cadherinas EV) y uniones gap (conexinas), que permiten el paso de agua y pequeños compuestos solubles en agua. Mientras que las moléculas lipofílicas pequeñas se difunden pasivamente a través del interior de los RMEC, el movimiento de moléculas lipofílicas e hidrófilas más grandes está regulado por vías transendoteliales impulsadas por ATP, incluyendo el transporte vesicular y los transportadores de membrana 5,9.
La transcitosis vesicular se puede clasificar como transcitosis caveolina mediada por caveolina, transcitosis dependiente de clatrina (y mediada por receptores) y macropinocitosis independiente de clatrina (Figura 2). Estos procesos de transporte vesicular involucran vesículas de diferentes tamaños, siendo los macropinosomas los más grandes (que van desde 200-500 nm) y las caveolas las más pequeñas (con un promedio de 50-100 nm), mientras que las vesículas recubiertas de clatrina varían de 70-150 nm10. Las caveolas son invaginaciones de membrana plasmática ricas en lípidos en forma de matraz con una capa de proteína, compuesta principalmente de caveolina-1 que se une al colesterol de la membrana lipídica y otras proteínas estructurales y de señalización a través de su dominio de andamiaje de caveolina11. Las caveolinas trabajan junto con cavina unida periféricamente para promover la estabilización de las caveolas en la membrana plasmática12. Las membranas caveolares también pueden transportar receptores para otras moléculas como insulina, albúmina y lipoproteínas circulantes, incluidas las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y las lipoproteínas de baja densidad (LDL) para ayudar a su movimiento a través de las células endoteliales13. Durante el desarrollo, la formación de BRB funcional depende de la supresión de la transcitosis EC8. El endotelio retiniano maduro, por lo tanto, tiene niveles relativamente bajos de caveolas, caveolina-1 y receptores de albúmina con respecto a otras células endoteliales en condiciones fisiológicas, contribuyendo a sus propiedades de barrera 4,9.
Debido a que la descomposición de iBRB es un sello distintivo importante de muchas afecciones oculares patológicas, es esencial desarrollar métodos para evaluar la permeabilidad vascular retiniana in vivo e in vitro. Estos métodos ayudan a proporcionar información probable sobre los mecanismos de la integridad del BRB comprometida y evaluar la eficacia de los posibles objetivos terapéuticos. Las imágenes in vivo actuales o los ensayos cuantitativos de fuga vascular suelen emplear fluorescentes (fluoresceína de sodio y dextrano), colorimétricos (colorante azul de Evans y sustrato de peroxidasa de rábano picante [HRP]) o trazadores radiactivos14 para detectar extravasación de la vasculatura a los tejidos retinianos circundantes con imágenes de microscopio o en lisado tisular aislado. Un trazador ideal para cuantificar la integridad vascular debe ser inerte y lo suficientemente grande como para penetrar libremente los vasos comprometidos mientras están confinados dentro de capilares sanos e intactos. Los métodos que emplean fluoresceína de sodio o dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) en angiografía con fluoresceína de fondo de ojo vivo (FFA) o montajes planos retinianos aislados se utilizan ampliamente para cuantificar la extravasación retiniana in vivo o ex vivo. FITC-dextrano tiene la ventaja de estar disponible en diferentes pesos moleculares que van desde 4-70 kDa para estudios selectivos de tamaño15,16,17. La FITC-albúmina (~68 kDa) es un trazador alternativo de proteínas de gran tamaño de relevancia biológica para estudios de fugas vasculares18. El colorante Evans Blue, inyectado intracárdicamente19, retroorbitalmente, o a través de la vena de la cola 20, también se basa en su unión con albúmina endógena para formar una molécula grande que puede cuantificarse principalmente mediante detección espectrofotométrica o, menos comúnmente, microscopía de fluorescencia en montajes planos20,21. Sin embargo, estas metodologías cuantitativas o de imágenes de luz a menudo no distinguen el transporte paracelular del transporte transendotelial. Para el análisis específico de la transcitosis con visualización ultraestructural de vesículas transcitadas, se utilizan típicamente moléculas trazadoras como HRP para localizar vesículas transcitadas dentro de las células endoteliales que se pueden observar bajo un microscopio electrónico22,23,24 (Figura 3A-C).
El desarrollo y uso de modelos iBRB in vitro para evaluar la permeabilidad de las células endoteliales podría proporcionar una evaluación robusta y de alto rendimiento para complementar los experimentos in vivo y ayudar a la investigación de reguladores moleculares de la fuga vascular. Los ensayos comúnmente utilizados para evaluar el transporte paracelular y la integridad de las uniones estrechas incluyen la resistencia eléctrica transendotelial (TEER), una medida de conductancia iónica (Figura 4)2,25, y el ensayo de fuga vascular in vitro utilizando trazadores fluorescentes de peso molecular pequeño26. Además, se han utilizado ensayos de transcitosis basados en transferrina que modelan la BHE para explorar la transcitosis dependiente de clatrina27. A pesar de esto, los ensayos para evaluar BRB y, más específicamente, la transcitosis caveolar retiniana EC in vitro son limitados.
En este estudio, describimos un ensayo de transcitosis EC utilizando células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC) como modelo in vitro para determinar la permeabilidad iBRB y la transcitosis EC. Este ensayo se basa en la capacidad de los HRMEC para transportar transferrina o HRP a través de las vías de transcitosis mediadas por receptores o dependientes de caveolas, respectivamente (Figura 2). Los HRMEC cultivados a confluencia completa en la cámara apical (es decir, inserto de filtro) se incubaron con transferrina conjugada fluorescente (Cy3-Tf) o HRP para medir la intensidad de fluorescencia correspondiente a los niveles de transferrina o HRP transferidos a la cámara inferior a través de la transcitosis EC únicamente. La confluencia de la monocapa celular puede confirmarse midiendo TEER, indicando la integridad de la unión estrecha25. Para demostrar la técnica de ensayo TEER y transcitosis, se utilizaron moduladores moleculares conocidos de la permeabilidad vascular y la transcitosis CE, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)28 y los de señalización Wnt (ligandos Wnt: Wnt3a y Norrin)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

La disfunción de la barrera hemato-retiniana (BRB) contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades oculares vasculares, lo que a menudo resulta en edema retiniano y posterior pérdida de visión. La barrera hemato-retiniana interna (BIB) está compuesta principalmente por endotelio vascular retiniano con baja permeabilidad en condiciones fisiológicas. Esta característica de baja permeabilidad está estrechamente regulada y mantenida por bajas tasas de transporte paracelular entre células endoteliales microvasculares retinianas adyacentes, así como el transporte transcelular (transcitosis) a través de ellas. La evaluación de la permeabilidad de la barrera transcelular retiniana puede proporcionar información fundamental sobre la integridad de iBRB en la salud y la enfermedad. En este estudio, describimos un ensayo de transcitosis de células endoteliales (CE), como un modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de iBRB, utilizando células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC). Este ensayo evalúa la capacidad de los HRMEC para transportar transferrina y peroxidasa de rábano picante (HRP) en procesos de transporte transcelular mediados por receptores y caveolas, respectivamente. Los HRMEC totalmente confluentes cultivados en membrana porosa se incubaron con transferrina marcada con fluorescencia (transcitosis dependiente de clatrina) o HRP (transcitosis mediada por caveolas) para medir los niveles de transferrina o HRP transferidos a la cámara inferior, indicativos de los niveles de transcitosis a través de la monocapa de CE. La señalización Wnt, una vía conocida que regula iBRB, se moduló para demostrar el método de ensayo de transcitosis basado en HRP mediado por caveolas. El ensayo de transcitosis EC descrito aquí puede proporcionar una herramienta útil para investigar los reguladores moleculares de la permeabilidad EC y la integridad de iBRB en patologías vasculares y para los sistemas de administración de fármacos.

Las imágenes EM del endotelio vascular retiniano muestran transporte vesicular transcitótico y vesículas caveolistas en células endoteliales in vivo. La transcitosis EC se puede visualizar in vivo dentro de secciones transversales retinianas con precipitado marrón oscuro que refleja vasos sanguíneos que contienen HRP bajo un microscopio óptico (Figura 3A) y como precipitado denso en electrones indicativo de vesículas transcitóticas que conti...

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Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Este protocolo ilustra un ensayo de transcitosis de células endoteliales in vitro como modelo para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina midiendo la capacidad de las células endoteliales microvasculares de la retina humana para transportar peroxidasa de rábano picante a través de las células en procesos de transporte transcelular mediados por caveolas.

Ensayo de transcitosis de células endoteliales como modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Este protocolo proporciona un modelo basado en células útil para estudiar la función y la permeabilidad de las barreras vasculares selectivas, como la barrera hematoretiniana o la barrera hematoencefálica, con un enfoque específico en la transcitosis endotelial. Este ensayo es fácil de configurar y usar y no requiere animales vivos. Se puede utilizar para investigar varios reguladores moleculares de la permeabilidad de las células endoteliales y la transcitosis que afectan la integridad de la barrera interna sangre-retina.Este ensayo puede proporcionar información sobre la biología vascular y la investigación ocular y cerebral, lo que permite una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes al control de la BB y explorar la posible administración de fármacos a través de las barreras. Para comenzar, prepare los insertos de filtro de cultivo celular para sembrar células endoteliales microvasculares de la retina humana o HRMEC, recubriendo cada inserto con 200 microlitros de solución de gelatina al 0,1% durante 30 minutos bajo una campana de flujo laminar. Asegúrese de que la solución cubra toda la superficie inferior del inserto del filtro.Tome una placa de Petri con HRMECs cultivados incubados a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, y aspire los medios de crecimiento. Enjuague suavemente las células dos veces con 10 mililitros de 1X PBS debajo de la campana de flujo laminar para deshacerse de las posibles células flotantes o muertas. Disocie las células con 0,5 a 1 mililitro de solución de tripsina-EDTA al 0,25% y coloque la placa de Petri en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 5 minutos.Apague la actividad de tripsina agregando de 4.5 a 9 mililitros de medios de crecimiento y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros usando una pipeta de 10 mililitros. Gire las celdas a 200 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 mililitros de medios de crecimiento.Cuente el número de células usando un hemocitómetro manual o un contador celular automatizado y siembre a una densidad de 40, 000 células por inserto de filtro. El volumen de suspensión celular para cada inserto es de 250 microlitros. Aspire la solución de recubrimiento de los pocillos que contienen insertos permeables y transfiera 250 microlitros de la suspensión celular por inserto, luego agregue solo medio a uno de los insertos, que se utilizará como control en blanco para la medición de la resistencia eléctrica transendotelial, o TEER.Simultáneamente, también añadir 750 microlitros de medio por pocillo en las cámaras basolaterales. Mantenga la placa de 24 pocillos con insertos permeables en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 7 a 12 días hasta que las células cultivadas se vuelvan completamente confluentes y se logre el valor TEER deseado de alrededor de 20 ohmios por centímetro cuadrado. Antes de las mediciones TEER, coloque la placa de 24 pocillos que contiene la celda en la campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos para equilibrar la temperatura.Para medir el TEER para HRMEC, utilizando un sistema de resistencia eléctrica del medidor epitelial voltio/ohmio, conecte el electrodo al medidor y equilibre el electrodo remojándolo primero en etanol al 70% durante 15 a 20 minutos y luego sumergiéndolo brevemente en el medio de crecimiento EGM de cultivo celular. Realice la medición TEER sumergiendo cuidadosamente el electrodo, de modo que la punta más corta esté en el inserto y la punta más larga toque el fondo del pozo. Mida primero la resistencia a través del control en blanco, luego para cada inserto, mida TEER por triplicado.Al alcanzar la confluencia con valores TEER de alrededor de 20 ohmios centímetros cuadrados, privar de suero a las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono utilizando 0,5% FBS en EBM en ambas cámaras antes del tratamiento con el ligando. Se utilizó MBE reducida en suero durante todo el ensayo. Incubar las células usando el medio reducido en suero en la cámara apical con cianina-3-tag fluorescente a ligando transferrina durante 60 minutos a 37 grados centígrados.Después de lavar la monocapa apical y basolateralmente 4 veces con el medio reducido en suero, agregue medio fresco a los insertos de filtro que contienen las células y transfiera los insertos a pocillos frescos de la placa de 24 pocillos que contiene medio reducido en suero precalentado. Incubar las células durante otros 90 minutos en la incubadora y luego recoger el medio de la cámara basolateral. Registre la intensidad de fluorescencia de la solución desde la cámara basolateral utilizando un detector de fluorescencia.Al alcanzar la confluencia con valores TEER de alrededor de 20 ohmios centímetro cuadrado, privar de suero a las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono utilizando 0,5% FBS en EBM en ambas cámaras antes del tratamiento con el ligando. Se utilizó MBE reducida en suero durante todo el ensayo. A continuación, trate las células en la cámara apical con los tratamientos deseados y controles del vehículo.Agregue 5 miligramos por mililitro de peroxidasa de rábano picante, o HRP, a las células e incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Agregue un medio fresco reducido en suero a la cámara apical y transfiera los insertos a un pocillo fresco que contenga medios precalentados. Incubar la monocapa durante 90 minutos adicionales en la incubadora.Después de recolectar el medio de la cámara basolateral, agregue 100 microlitros de sustrato de peroxidasa fluorogénica HRP al medio recolectado e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Detenga la reacción con 100 microlitros de solución de parada y detecte los niveles de producto de reacción de sustrato HRP en el medio utilizando un lector de placas de fluorescencia. Antes de demostrar los ensayos de transcitosis in vitro, la visualización de la transcitosis de células endoteliales en la retina se muestra como información de fondo.Aquí, la imagen del microscopio de luz muestra una luz de vaso sanguíneo llena de HRP de una sección retiniana de ratón de tipo salvaje de 3 meses de edad teñida con DAB. HRP fue inyectado retroorbitalmente. Los vasos retinianos llenos de HRP se pueden ver como precipitados de color marrón oscuro bajo el microscopio de luz.La sección ultradelgada del microscopio electrónico de transmisión muestra vasos transcitóticos llenos de HRP con RMEC que representan transcitosis EC a través de la barrera interna de la sangre y la retina. Aquí, la vesícula grande refleja potencialmente macropinosoma y un glóbulo rojo en el lado del luminol. La imagen TeM muestra pequeñas vesículas transcitóticas llenas de HRP, probablemente vesículas caveola, dentro del RMEC.La tinción inmunohistoquímica del anticuerpo CAV-1 y la isolectina B4 demuestra la localización de CAV-1, un marcador de vesículas caveola en los vasos sanguíneos de la retina, en la retina de ratón de tipo salvaje de 3 meses de edad. La imagen TeM de CAV-1 marcada con inmunooro dentro de las células endoteliales de la retina se muestra aquí con una imagen ampliada de la vesícula de caveola CAV-1 positiva. Para el ensayo de transcitosis EC mediada por clatrina en HRMEC utilizando transferrina, aquí, una imagen de microscopio de fluorescencia muestra transferrina Cy3 endocitosada en color rojo dentro de HRMEC teñidos con DAPI en azul.Para la transcitosis EC mediada por caveolas utilizando HRP, la señalización Wnt aquí se usa como ejemplo para demostrar el ensayo. Recientemente se descubrió que la señalización Wnt regula la transcitosis EC mediada por caveolas. Las células fueron tratadas con el activador de la vía Wnt Wnt3a condicionado por el medio y Norrina recombinante, con o sin inhibidor de señalización Wnt XAV939 y sus controles reactivos.Los activadores Wnt redujeron el nivel de la transcitosis basada en HRP, que fueron revertidas por XAV939. La medición correcta de TEER es crucial para determinar la integridad de la monocapa. Se ve muy afectado por diversos factores, como el manejo inadecuado, las fluctuaciones de temperatura, el medio de cultivo, la duración del cultivo, etc.Este ensayo podría modificarse como cocultivo o sistemas de cultivo organotípico 3D que imitan las condiciones in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

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Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

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Investigación

Medicina

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

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Un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

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Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

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Estirar en Brain células endoteliales microvasculares (CEND) como<em&gt; In Vitro</em&gt; Lesión cerebral traumática Modelo de la barrera hematoencefálica

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

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Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

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Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

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Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como<em&gt; In Vitro</em&gt; La isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

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Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de Magnetized miR-modificado células endoteliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

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Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como<em&gt; In Vitro</em&gt; Herramienta de detección en la investigación de la audición

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...