Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-bidrag (R01 EY028100, EY024963 och EY031765) till JC. ZW stöddes av ett Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Boston Children's Hospital för generering av ljusmikroskopi och EM-bilder (figur 3). Protokoll för in vivo-studierna kan erhållas från Wang et al.24. Alla experiment med humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) godkändes av Institutional Biosafety Committee (IBC) vid Boston Children's Hospital.
1. Beredning av reagenser<...

BRB spelar en viktig roll i retinal hälsa och sjukdom. In vitro-tekniker som bedömer vaskulär permeabilitet har visat sig vara avgörande verktyg i studier om barriärutveckling (BRB/BBB) och funktion. Förfarandet som beskrivs här kan användas för att studera de molekylära mekanismerna som ligger till grund för EC-transcytos eller utvärdera relaterade molekylära modulatorer som påverkar BRB-permeabiliteten. In vitro EC-transcytosanalyser har flera fördelar jämfört med in vivo-analyser...

Den mänskliga näthinnan är en av de högsta energikrävande vävnaderna i kroppen. Korrekt funktion av den neurala näthinnan kräver en effektiv tillförsel av syre och näringsämnen tillsammans med ett begränsat flöde av andra potentiellt skadliga molekyler för att skydda näthinnemiljön, som förmedlas via blod-retinal barriären (BRB)1. I likhet med blod-hjärnbarriären (BBB) i centrala nervsystemet fungerar BRB som en selektiv barriär i ögat och reglerar rörelsen av joner, vatten, aminosyror och socker in och ut ur näthinnan. BRB upprätthåller också retinal homeostas och dess immunprivilegium genom att förhindra exponering för cirkulationsfaktorer såsom immunceller, antikroppar och skadliga patogener2. BRB-dysfunktion bidrar till patofysiologin hos flera vaskulära ögonsjukdomar, såsom diabetisk retinopati, åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinopati av prematuritet (ROP), retinal venocklusion och uveit, vilket resulterar i vasogent ödem och efterföljande synförlust 3,4,5.
BRB består av två separata barriärer för två distinkta okulära vaskulära nätverk: retinal vaskulatur och fenestrated choriocapillaris under näthinnan. Den inre BRB (iBRB) består huvudsakligen av retinala mikrovaskulära endotelceller (RMEC) som kantar retinal mikrovaskulatur, som ger näring åt de inre retinala neuronala skikten. Å andra sidan utgör retinalpigmentepitelet huvudkomponenten i den yttre BRB, som ligger mellan den neurosensoriska näthinnan och choriocapillaris2. För iBRB sker molekylär transport över RMEC genom både paracellulära och transcellulära vägar (figur 1). Den höga graden av substansselektivitet över iBRB är beroende av (i) närvaron av korsningsproteinkomplex som begränsar paracellulär transport mellan intilliggande endotelceller (ECs) och (ii) låga uttrycksnivåer av caveolae-mediatorer, transportörer och receptorer inom endotelcellerna som upprätthåller låga hastigheter av transcellulär transport 1,6,7,8 . Korsningskomplex som reglerar paracellulärt flöde består av täta korsningar (claudiner, ockludiner), vidhäftande korsningar (VE-kadheriner) och gapkorsningar (connexiner), vilket möjliggör passage av vatten och små vattenlösliga föreningar. Medan små lipofila molekyler passivt diffunderar över det inre av RMEC, regleras rörelsen av större lipofila och hydrofila molekyler av ATP-drivna transendoteliala vägar inklusive vesikulär transport och membrantransportörer 5,9.
Vesikulär transcytos kan kategoriseras som caveolinmedierad caveolär transcytos, clathrinberoende (och receptormedierad) transcytos och clathrinoberoende makropinocytos (Figur 2). Dessa vesikulära transportprocesser involverar vesiklar av olika storlek, där makropinosomer är de största (från 200-500 nm) och caveolae är de minsta (i genomsnitt 50-100 nm), medan clathrinbelagda vesiklar sträcker sig från 70-150 nm10. Caveolae är kolvformade lipidrika plasmamembraninvaginationer med en proteinbeläggning, främst bestående av caveolin-1 som binder lipidmembrankolesterol och andra strukturella och signalerande proteiner via deras caveolin-byggnadsställningsdomän11. Caveoliner arbetar tillsammans med perifert fäst cavin för att främja caveolae-stabilisering vid plasmamembranet12. Caveolar membran kan också bära receptorer för andra molekyler såsom insulin, albumin, och cirkulerande lipoproteiner inklusive high-density lipoprotein (HDL) och low-density lipoprotein (LDL) för att hjälpa deras rörelse över endotelceller13. Under utvecklingen beror bildandet av funktionell BRB på undertryckandet av EC-transcytos8. Äldre retinalt endotel har därför relativt låga nivåer av caveolae-, caveolin-1- och albuminreceptorer med avseende på andra endotelceller under fysiologiska förhållanden, vilket bidrar till dess barriäregenskaper 4,9.
Eftersom iBRB-nedbrytning är ett viktigt kännetecken för många patologiska ögonsjukdomar är det viktigt att utveckla metoder för att bedöma retinal vaskulär permeabilitet in vivo och in vitro. Dessa metoder hjälper till att ge sannolika insikter i mekanismerna för komprometterad BRB-integritet och bedöma effekten av potentiella terapeutiska mål. Nuvarande in vivo-avbildning eller kvantitativa vaskulära läckageanalyser använder vanligtvis fluorescerande (natriumfluorescein och dextran), kolorimetriskt (Evans Blue-färgämne och pepparrotsperoxidas [HRP] substrat) eller radioaktiva spårämnen14 för att detektera extravasering från vaskulaturen till omgivande näthinnevävnader med mikroskopavbildning eller i isolerat vävnadslysat. Ett idealiskt spårämne för kvantifiering av vaskulär integritet bör vara inert och tillräckligt stort för att fritt tränga igenom komprometterade kärl medan det är inneslutet i friska och intakta kapillärer. Metoder som använder natriumfluorescein eller fluoresceinisotiocyanatkonjugerad dextran (FITC-dextran) i levande fundus fluoresceinangiografi (FFA) eller isolerade retinala platta fästen används ofta för kvantifiering av retinal extravasation in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har fördelen att det finns i olika molekylvikter från 4-70 kDa för storlekselektiva studier15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) är ett alternativt storskaligt proteinspårare av biologisk relevans för kärlläckagestudier18. Evans Blue-färgämne, injicerat intrakardiellt19, retro-orbitalt eller genom svansvenen 20, förlitar sig också på dess bindning med endogent albumin för att bilda en stor molekyl som kan kvantifieras genom mestadels spektrofotometrisk detektion eller, mindre vanligt, fluorescensmikroskopi i platta fästen20,21. Dessa kvantitativa eller lätta avbildningsmetoder skiljer emellertid ofta inte paracellulär transport från transendoteltransport. För den specifika analysen av transcytos med ultrastrukturell visualisering av transcytoserade vesiklar används spårmolekyler såsom HRP vanligtvis för att lokalisera transcytoserade vesiklar i endotelceller som kan observeras under ett elektronmikroskop22,23,24 (Figur 3A-C).
Utvecklingen och användningen av in vitro iBRB-modeller för att utvärdera endotelcellpermeabiliteten kan ge robust och hög genomströmningsbedömning för att komplettera in vivo-experiment och hjälpa till att undersöka molekylära regulatorer för vaskulärt läckage. Vanliga analyser för att bedöma paracellulär transport och integritet hos täta korsningar inkluderar transendotelial elektrisk resistans (TEER), ett mått på jonisk konduktans (figur 4)2,25 och in vitro-vaskulär läckageanalys med hjälp av fluorescerande spårämnenmed liten molekylvikt 26. Dessutom har transferrinbaserade transcytosanalyser som modellerar BBB använts för att utforska clathrinberoende transcytos27. Trots detta är analyser för att utvärdera BRB och, mer specifikt, retinal EC caveolar transcytos in vitro begränsade.
I denna studie beskriver vi en EC-transcytosanalys med humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) som en in vitro-modell för att bestämma iBRB-permeabilitet och EC-transcytos. Denna analys är beroende av HRMECs förmåga att transportera transferrin eller HRP via de receptormedierade respektive caveolae-beroende transcytosvägarna (figur 2). HRMECs odlade till full sammanflöde i den apikala kammaren (dvs. filterinsats) inkuberades med fluorescerande konjugerat transferrin (Cy3-Tf) eller HRP för att mäta fluorescensintensiteten som motsvarar nivåerna av transferrin eller HRP som överfördes till bottenkammaren genom enbart EC-transcytos. Sammanflödet av cellmonolagret kan bekräftas genom att mäta TEER, vilket indikerar den snäva korsningsintegriteten25. För att demonstrera TEER- och transcytosanalystekniken användes kända molekylära modulatorer av vaskulär permeabilitet och EC-transcytos, inklusive vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)28 och de i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a och Norrin)29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

Dysfunktion i blod-retinal barriären (BRB) bidrar till patofysiologin hos flera vaskulära ögonsjukdomar, vilket ofta resulterar i retinalt ödem och efterföljande synförlust. Den inre blod-retinala barriären (iBRB) består huvudsakligen av retinalt vaskulärt endotel med låg permeabilitet under fysiologiska förhållanden. Denna egenskap av låg permeabilitet regleras tätt och upprätthålls av låga hastigheter av paracellulär transport mellan intilliggande retinala mikrovaskulära endotelceller, såväl som transcellulär transport (transcytos) genom dem. Bedömningen av retinal transcellulär barriärpermeabilitet kan ge grundläggande insikter om iBRB-integritet i hälsa och sjukdom. I denna studie beskriver vi en endotelcell (EC) transcytosanalys, som en in vitro-modell för utvärdering av iBRB-permeabilitet, med hjälp av humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs). Denna analys bedömer HRMECs förmåga att transportera transferrin och pepparrotsperoxidas (HRP) i receptor- respektive caveolae-medierade transcellulära transportprocesser. Helt sammanflytande HRMECs odlade på poröst membran inkuberades med fluorescerande märkt transferrin (clathrinberoende transcytos) eller HRP (caveolae-medierad transcytos) för att mäta nivåerna av transferrin eller HRP som överfördes till den nedre kammaren, vilket indikerar transcytosnivåer över EC-monoskiktet. Wnt-signalering, en känd väg som reglerar iBRB, modulerades för att demonstrera den caveolae-medierade HRP-baserade transcytosanalysmetoden. EC-transcytosanalysen som beskrivs här kan ge ett användbart verktyg för att undersöka de molekylära regulatorerna för EC-permeabilitet och iBRB-integritet i vaskulära patologier och för screening av läkemedelsleveranssystem.

EM-bilder av retinalt vaskulärt endotel visar transcytotisk vesikulär transport och caveolära vesiklar i endotelceller in vivo. EC-transcytos kan visualiseras in vivo i näthinnans tvärsnitt med mörkbrun fällning som reflekterar HRP-innehållande blodkärl under ett ljusmikroskop (figur 3A) och som elektrontät fällning som indikerar HRP-innehållande transcytotiska vesiklar (figur 3B,C) med hjälp av ett transmis...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Detta protokoll illustrerar en in vitro-endotelcellstranscytosanalys som en modell för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet genom att mäta förmågan hos humana retinala mikrovaskulära endotelceller att transportera pepparrotsperoxidas över celler i caveolae-medierade transcellulära transportprocesser.

Endotelcellstranscytosanalys som en in vitro-modell för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Detta protokoll ger en användbar cellbaserad modell för att studera funktionen och permeabiliteten hos selektiva vaskulära barriärer såsom blod-retinal eller blod-hjärnbarriär med ett specifikt fokus på endoteltranscytos. Denna analys är lätt att installera och använda och kräver inga levande djur. Det kan användas för att undersöka olika molekylära regulatorer av endotelcellspermeabilitet och transcytos som påverkar inre blod-retinal barriär integritet.Denna analys kan ge insikter i vaskulär biologi och ögon- och hjärnforskning, vilket möjliggör bättre förståelse av molekylmekanismer som ligger till grund för BRB BBB-kontroll och utforskar potentiell läkemedelsleverans över barriärerna. För att börja, förbered cellodlingsfilterinsatserna för sådd av mänskliga retinala mikrovaskulära endotelceller eller HRMECs, genom att belägga varje insats med 200 mikroliter 0,1% gelatinlösning i 30 minuter under en laminär flödeshuv. Se till att lösningen täcker hela filterinsatsens bottenyta.Ta en petriskål med odlade HRMECs inkuberade vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid och aspirera tillväxtmediet. Skölj försiktigt cellerna två gånger med 10 ml 1X PBS under den laminära flödeshuven för att bli av med de potentiella flytande eller döda cellerna. Dissociera cellerna med 0,5 till 1 ml 0,25% trypsin-EDTA-lösning och placera petriskålen i inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 5 minuter.Släck trypsinaktiviteten genom att tillsätta 4,5 till 9 ml tillväxtmedium och överför cellsuspensionen till ett 15-milliliterrör med en 10-milliliters pipett. Snurra cellerna vid 200 gånger g i 5 minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml tillväxtmedia.Räkna antalet celler med hjälp av en manuell hemocytometer eller en automatiserad cellräknare och frö med en densitet av 40 000 celler per filterinsats. Volymen cellsuspension för varje insats är 250 mikroliter. Aspirera beläggningslösningen från brunnarna som innehåller permeabla skär och överför 250 mikroliter av cellsuspensionen per insats, tillsätt sedan endast medium till en av insatserna, som kommer att användas som en blank kontroll för transendotelial elektrisk resistans, eller TEER, mätning.Samtidigt tillsätt också 750 mikroliter medium per brunn i de basolaterala kamrarna. Håll 24-brunnsplattan med permeabla insatser i inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 7 till 12 dagar tills de odlade cellerna blir helt sammanflytande och det önskade TEER-värdet på cirka 20 ohm per kvadratcentimeter uppnås. Före TEER-mätningar, placera den cellinnehållande 24-brunnsplattan i den laminära flödeshuven vid rumstemperatur i 15 till 20 minuter för temperaturjämvikt.För att mäta TEER för HRMECs, med hjälp av ett epitelial volt / ohm meter elektriskt motståndssystem, anslut elektroden till mätaren och balansera elektroden genom att först blötlägga den i 70% etanol i 15 till 20 minuter och sedan nedsänka den kort i cellodlingens EGM-tillväxtmedium. Utför TEER-mätning genom att försiktigt nedsänka elektroden, så att den kortare spetsen är i insatsen och den längre spetsen vidrör brunnens botten. Mät motståndet över blankkontrollen först och mät sedan TEER i tre exemplar för varje skär.Efter att ha nått sammanflöde med TEER-värden runt 20 ohm kvadratcentimeter, serum-beröva cellerna i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid med 0,5% FBS i EBM i båda kamrarna före behandling med liganden. Serumreducerad EBM användes under hela analysen. Inkubera cellerna med hjälp av det serumreducerade mediet i den apikala kammaren med fluorescerande cyanin-3-tagg till transferrinliganden i 60 minuter vid 37 grader Celsius.Efter tvättning av monoskiktet apikalt och basolateralt 4 gånger med det serumreducerade mediet, tillsätt färskt medium till filterinsatserna som innehåller cellerna och överför insatserna till färska brunnar i 24-brunnsplattan innehållande förvärmt serumreducerat medium. Inkubera cellerna i ytterligare 90 minuter i inkubatorn och samla sedan mediet från den basolaterala kammaren. Registrera fluorescensintensiteten hos lösningen från den basolaterala kammaren med hjälp av en fluorescensdetektor.Efter att ha nått sammanflöde med TEER-värden runt 20 ohm kvadratcentimeter, serum-beröva cellerna i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid med 0,5% FBS i EBM i båda kamrarna före behandling med liganden. Serumreducerad EBM användes under hela analysen. Därefter behandla cellerna i den apikala kammaren med önskade behandlingar och vehikelkontroller.Tillsätt 5 milligram per milliliter pepparrotsperoxidas, eller HRP, till cellerna och inkubera i 15 minuter vid 37 grader Celsius. Tillsätt färskt serumreducerat medium till den apikala kammaren och överför insatserna till en ny brunn som innehåller förvärmda medier. Inkubera monolagret i ytterligare 90 minuter i inkubatorn.Efter uppsamlingsmedium från den basolaterala kammaren, tillsätt 100 mikroliter HRP-fluorogent peroxidassubstrat till det uppsamlade mediet och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter. Stoppa reaktionen med 100 mikroliter stopplösning och detektera nivåerna av HRP-substratreaktionsprodukt i media med hjälp av en fluorescensplattläsare. Innan du demonstrerar in vitro-transcytosanalyserna visas visualisering av endotelcellstranscytos i näthinnan som bakgrundsinformation.Här visar ljusmikroskopbilden en HRP-fylld blodkärlslumen från en 3 månader gammal vild typ musretinalsektion färgad med DAB. HRP injicerades retro-orbitalt. HRP-fyllda retinala kärl kan ses som mörkbrun fällning under ljusmikroskopet.Transmissionselektronmikroskop ultratunn sektion visar HRP-fyllda transcytotiska kärl med RMEC som visar EC-transcytos över den inre blod-retinala barriären. Här reflekterar den stora vesikeln potentiellt makropinosom och en röd blodkropp på luminolsidan. TeM-bilden visar HRP-fyllda små transcytotiska vesiklar, sannolikt caveola vesiklar, inom RMEC.Immunohistokemifärgning av CAV-1-antikropp och isolektin B4 visar lokaliseringen av CAV-1, En markör för caveola-vesiklar i retinala blodkärl, i den 3 månader gamla vildmusens näthinna. TeM-bild av immunogold-märkt CAV-1 i retinala endotelceller visas här med en förstorad bild av CAV-1 positiv caveola vesikel. För clathrinmedierad EC-transcytosanalys i HRMECs med transferrin, här visar en fluorescensmikroskopbild endocytoserat Cy3-transferrin i röd färg inom HRMECs färgade med DAPI i blått.För caveolae-medierad EC-transcytos med HRP används Wnt-signalering här som ett exempel för att demonstrera analysen. Wnt-signalering visade sig nyligen reglera caveolae-medierad EC-transcytos. Cellerna behandlades med Wnt-vägaktivator Wnt3a-konditionerat medium och rekombinant Norrin, med eller utan Wnt-signalhämmare XAV939 och deras reaktiva kontroller.Wnt-aktivatorer minskade nivån av den HRP-baserade transcytosen, som vändes av XAV939. Korrekt TEER-mätning är avgörande för att bestämma monolagerintegritet. Det påverkas starkt av olika faktorer som felaktig hantering, temperaturfluktuationer, odlingsmedium, odlingslängd, et cetera.Denna analys kan modifieras som samkultur eller 3D-organotypiska odlingssystem som efterliknar in vivo-förhållanden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcellstransplantation i en In vitro Simulerad ischemi / Reperfusion Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

En<em&gt; In vivo</em&gt; Analys för att testa Permeabilitet blodkärl

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Använda kvantitativ realtids-PCR för att avgöra Engraftment donatorcellen i en konkurrenskraftig Murine Bone Marrow Transplantation Modell

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch i Brain mikrovaskulära endotelceller (cEND) som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisk hjärnskada Modell av blodhjärnbarriären

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Ställa upp en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Rat blod-hjärnbarriären (BBB): Fokus på BBB Impermeabilitet och Receptor-medierad transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxisk Stimulering av Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Syre Glukos Deprivation och ny syresättning som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemi-reperfusion skada modell för att studera blodhjärnbarriären dysfunktion

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akut retinal modell för utvärdering Blood Retinal Barrier överträdelse och potentiella läkemedel för behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

framställning och<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av Magnetized miR-modifierade endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...