Name: endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Bu çalışma, JC'ye NIH hibeleri (R01 EY028100, EY024963 ve EY031765) ile desteklenmiştir. ZW, Knights Templar Eye Foundation Kariyer Başlangıç Bursu tarafından desteklendi.

Tüm hayvan deneyleri, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ışık mikroskobu ve EM görüntülerinin oluşturulması için onaylanmıştır (Şekil 3). İn vivo çalışmalar için protokoller Wang ve ark.24'ten elde edilebilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) içeren tüm deneyler, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanm...

BRB, retina sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar. Vasküler geçirgenliği değerlendiren in vitro tekniklerin, bariyer (BRB/BBB) gelişimi ve fonksiyonu ile ilgili çalışmalarda çok önemli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Burada açıklanan prosedür, EC transsitozunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek veya BRB geçirgenliğini etkileyen ilgili moleküler modülatörleri değerlendirmek için kullanılabilir. İn vitro EC transsitoz tahlilleri, in vivo testl...

İnsan retinası, vücuttaki en yüksek enerji gerektiren dokulardan biridir. Nöral retinanın düzgün çalışması, retinal çevreyi korumak için kan-retinal bariyer (BRB) aracılığıyla aracılık edilen diğer potansiyel olarak zararlı moleküllerin sınırlı bir akışı ile birlikte verimli bir oksijen ve besin kaynağı gerektirir1. Merkezi sinir sistemindeki kan-beyin bariyerine (BBB) benzer şekilde, BRB gözde seçici bir bariyer görevi görür ve iyonların, suyun, amino asitlerin ve şekerin retinanın içindeki ve dışındaki hareketini düzenler. BRB ayrıca bağışıklık hücreleri, antikorlar ve zararlı patojenler gibi dolaşım faktörlerine maruz kalmayı önleyerek retinal homeostazı ve bağışıklık ayrıcalığını korur2. BRB disfonksiyonu, diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), prematüre retinopatisi (ROP), retinal ven tıkanıklığı ve üveit gibi çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur ve vazojenik ödem ve ardından görme kaybına neden olur 3,4,5.
BRB, sırasıyla iki ayrı oküler vasküler ağ için iki ayrı bariyerden oluşur: retina vaskülatürü ve retinanın altındaki federe koryokapillaris. İç BRB (iBRB) esas olarak retinal nöronal tabakaları besleyen retinal mikrovasküler endotel hücrelerinden (RMEC'ler) oluşur. Öte yandan, retinal pigment epiteli, nörosensoriyel retina ve koryokapillaris2 arasında yer alan dış BRB'nin ana bileşenini oluşturur. iBRB için, RMEC'ler arasında moleküler taşıma hem parasellüler hem de hücreler arası yollardan gerçekleşir (Şekil 1). iBRB boyunca yüksek derecede madde seçiciliği, (i) bitişik endotel hücreleri (ECs) arasındaki parasellüler taşımayı kısıtlayan bileşke protein komplekslerinin varlığına ve (ii) endotel hücreleri içindeki düşük transsellüler arası taşıma oranlarını koruyan kaveola mediatörlerinin, taşıyıcılarının ve reseptörlerinin düşük ekspresyon seviyelerine dayanır 1,6,7,8 . Parasellüler akıyı düzenleyen kavşak kompleksleri, suyun ve küçük suda çözünür bileşiklerin geçişine izin veren sıkı kavşaklardan (klodinler, oklüdinler), ader kavşaklardan (VE kadherinler) ve boşluk kavşaklarından (konneksinler) oluşur. Küçük lipofilik moleküller RMEC'lerin iç kısmına pasif olarak yayılırken, daha büyük lipofilik ve hidrofilik moleküllerin hareketi, veziküler transport ve membran taşıyıcıları dahil olmak üzere ATP güdümlü trans-endotel yolları tarafından düzenlenir 5,9.
Veziküler transsitoz, kaveolin aracılı kavooler transsitoz, klatrin bağımlı (ve reseptör aracılı) transsitoz ve klatrin bağımsız makropinositoz olarak sınıflandırılabilir (Şekil 2). Bu veziküler taşıma işlemleri, makropinozomlar en büyük (200-500 nm arasında değişen) ve kaveoller en küçüğü (ortalama 50-100 nm) olan farklı büyüklükteki vezikülleri içerirken, klatrin kaplı veziküller 70-150 nm10 arasında değişmektedir. Kaveolalar, esas olarak lipit membran kolesterolünü ve diğer yapısal ve sinyal proteinlerini kaveolin-iskele alanları 11 aracılığıyla bağlayan kaveolin-1'den oluşan bir protein kaplaması ile şişe şeklinde lipit bakımından zengin plazma membran invaginasyonlarıdır11. Kaveolinler, plazma zarı12'de kaveola stabilizasyonunu teşvik etmek için periferik olarak bağlı kavain ile birlikte çalışır. Kaveoler membranlar ayrıca endotel hücreleri arasındaki hareketlerine yardımcı olmak için insülin, albümin ve yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) dahil olmak üzere dolaşımdaki lipoproteinler gibi diğer moleküller için reseptörler taşıyabilir13. Gelişim sırasında, fonksiyonel BRB oluşumu EC transsitoz8'in baskılanmasına bağlıdır. Bu nedenle, olgun retinal endotel, fizyolojik koşullar altında diğer endotel hücrelerine göre nispeten düşük seviyelerde kaveola, kaveolin-1 ve albümin reseptörlerine sahiptir ve bariyer özelliklerine katkıda bulunur 4,9.
iBRB parçalanması birçok patolojik göz rahatsızlığının önemli bir özelliği olduğundan, retinal vasküler geçirgenliği in vivo ve in vitro olarak değerlendirmek için yöntemler geliştirmek esastır. Bu yöntemler, tehlikeye atılmış BRB bütünlüğünün mekanizmaları hakkında olası bilgiler sağlamaya ve potansiyel terapötik hedeflerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur. Mevcut in vivo görüntüleme veya kantitatif vasküler kaçak tahlilleri tipik olarak floresan (sodyum floresein ve dekstran), kolorimetrik (Evans Blue boya ve yaban turpu peroksidaz [HRP] substratı) veya radyoaktif izleyiciler14 kullanarak vaskülatürden mikroskop görüntüleme ile veya izole doku lizatında çevredeki retinal dokulara ekstravazasyonu tespit eder. Vasküler bütünlüğü ölçmek için ideal bir izleyici, sağlıklı ve sağlam kılcal damarlarla sınırlıyken tehlikeye girmiş damarlara serbestçe nüfuz edecek kadar inert ve büyük olmalıdır. Canlı fundus floresein anjiyografide (FFA) sodyum floresein veya floresein izotiyosiyanat-konjuge dekstran (FITC-dextran) veya izole retinal düz montajlarda kullanılan yöntemler, retinal ekstravazasyonun in vivo veya ex vivo olarak ölçülmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. FITC-dextran, boyut seçici çalışmalar için 4-70 kDa arasında değişen farklı moleküler ağırlıklarda bulunma avantajına sahiptir15,16,17. FITC-albümin (~ 68 kDa), vasküler sızıntı çalışmaları için biyolojik açıdan uygun alternatif bir büyük boyutlu protein izleyicisidir18. İntrakardiyalolarak 19, retro-orbital veya kuyruk damarı 20 yoluyla enjekte edilen Evans Blue boyası, çoğunlukla spektrofotometrik tespit veya daha az yaygın olarak, düz montajlarda floresan mikroskobu ile ölçülebilen büyük bir molekül oluşturmak için endojen albümin ile bağlanmasına da dayanır20,21. Bununla birlikte, bu kantitatif veya hafif görüntüleme metodolojileri genellikle parasellüler transportu trans-endotelyal transporttan ayırmaz. Transsitozlu veziküllerin ultrastrüktürel görselleştirmesi ile transsitozun spesifik analizi için, HRP gibi izleyici moleküller tipik olarak bir elektron mikroskobu22,23,24 altında gözlemlenebilen endotel hücreleri içindeki transsitozlu vezikülleri bulmak için kullanılır (Şekil 3A-C).
Endotel hücre geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro iBRB modellerinin geliştirilmesi ve kullanılması, in vivo deneyleri tamamlamak ve vasküler sızıntının moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasına yardımcı olmak için sağlam ve yüksek verimli bir değerlendirme sağlayabilir. Sıkı kavşakların parasellüler transportunu ve bütünlüğünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan testler arasında trans-endotelyal elektriksel direnç (TEER), iyonik iletkenlik ölçüsü (Şekil 4) 2,25 ve küçük moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler kullanılarak in vitro vasküler sızıntı testi26 bulunmaktadır. Ek olarak, klatrin bağımlı transsitoz27'yi araştırmak için BBB'yi modelleyen transferrin bazlı transsitoz tahlilleri kullanılmıştır. Buna rağmen, BRB'yi ve daha spesifik olarak retinal EC kaveoler transsitozunu in vitro olarak değerlendirmek için yapılan testler sınırlıdır.
Bu çalışmada, iBRB geçirgenliğini ve EC transsitozunu belirlemek için in vitro model olarak insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin (HRMEC'ler) kullanıldığı bir EC transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör aracılı veya kaveola bağımlı transsitoz yolları aracılığıyla transferrin veya HRP'yi taşıma yeteneğine dayanır (Şekil 2). Apikal odada (yani filtre ekinde) tam akıcılığa kadar kültürlenmiş HRMEC'ler, sadece EC transsitozu yoluyla alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerine karşılık gelen floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan konjuge transferrin (Cy3-Tf) veya HRP ile inkübe edildi. Hücre tek katmanının akıcılığı, sıkı bağlantı bütünlüğünü gösteren TEER ölçülerek doğrulanabilir25. TEER ve transsitoz testi tekniğini göstermek için, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)28 ve Wnt sinyallemesindekiler (Wnt ligandları: Wnt3a ve Norrin)29 dahil olmak üzere vasküler geçirgenlik ve EC transsitozunun bilinen moleküler modülatörleri kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petridish&#160;</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-human Transferrin&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>AB_2337082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>CC-4102B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (2-chip)</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>DHC-N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>ACBRI 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L cells (for Control-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>EnSight, PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Norrin (rhNorrin)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3014-NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 &#181;m pore polyester membrane insert)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51221060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939 (Wnt/&#946;-catenin Inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1180</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell transcytosis assay as an in vitro model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability

Kan-retina bariyerinin (BRB) işlev bozukluğu, sıklıkla retinal ödem ve ardından görme kaybına neden olan çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur. İç kan-retina bariyeri (iBRB) esas olarak fizyolojik koşullar altında düşük geçirgenliğe sahip retinal vasküler endotelden oluşur. Düşük geçirgenliğin bu özelliği, bitişik retinal mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki düşük parasellüler taşıma oranları ve ayrıca bunlar aracılığıyla transsellüler transport (transsitoz) ile sıkı bir şekilde düzenlenir ve korunur. Retinal transsellüler bariyer geçirgenliğinin değerlendirilmesi, sağlık ve hastalıkta iBRB bütünlüğü hakkında temel bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) kullanarak iBRB geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro bir model olarak endotel hücresi (EC) transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör ve kaveola aracılı transsellüler transport süreçlerinde transferrin ve yaban turpu peroksidazını (HRP) taşıma yeteneğini değerlendirir. Gözenekli membran üzerinde kültürlenen tam akışkan HRMEC'ler, EC monokatmanındaki transsitoz seviyelerinin göstergesi olarak, alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerini ölçmek için floresan etiketli transferrin (klatrin bağımlı transsitoz) veya HRP (kaveola aracılı transsitoz) ile inkübe edildi. iBRB'yi düzenleyen bilinen bir yol olan Wnt sinyali, kaveola aracılı HRP bazlı transsitoz testi yöntemini göstermek için modüle edildi. Burada açıklanan EC transsitoz testi, vasküler patolojilerde EC geçirgenliğinin ve iBRB bütünlüğünün moleküler düzenleyicilerini araştırmak ve ilaç dağıtım sistemlerini taramak için yararlı bir araç sağlayabilir.

Retinal vasküler endotelin EM görüntülerinde transsitotik veziküler transportu ve endotel hücrelerinde kavoler veziküller in vivo olarak görülmektedir. EC transsitoz, retinal kesitler içinde, HRP içeren kan damarlarını yansıtan koyu kahverengi çökelti ile ışık mikroskobu altında (Şekil 3A) ve HRP içeren transsitotik veziküllerin göstergesi olan elektron yoğun çökelti olarak (Şekil 3B, C) transmisyon el...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability at JoVE.com

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Bu protokol, endotel transsitozuna özel bir odaklanma ile kan-retinal veya kan-beyin bariyeri gibi seçici vasküler bariyerlerin işlevini ve geçirgenliğini incelemek için yararlı bir hücre bazlı model sağlar. Bu tahlilin kurulumu ve kullanımı canlı hayvan gerektirmeden kolaydır. Endotel hücre geçirgenliğinin ve iç kan-retinal bariyer bütünlüğünü etkileyen transsitozun çeşitli moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasında kullanılabilir.Bu tahlil, vasküler biyoloji ve göz ve beyin araştırmaları hakkında fikir verebilir, BRB BBB kontrolünün altında yatan molekül mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını ve bariyerler boyunca potansiyel ilaç dağıtımının araştırılmasını sağlar. Başlamak için, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini veya HRMEC'leri tohumlamak için hücre kültürü filtre eklerini hazırlayın, her bir eki laminer bir akış başlığı altında 30 dakika boyunca 200 mikrolitre% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Çözeltinin filtre ekinin tüm alt yüzeyini kapladığından emin olun.37 santigrat derecede inkübe edilmiş kültürlü HRMEC'ler ve% 5 karbondioksit içeren bir Petri kabı alın ve büyüme ortamını aspire edin. Potansiyel yüzen veya ölü hücrelerden kurtulmak için hücreleri laminer akış başlığının altında 10 mililitre 1X PBS ile iki kez nazikçe durulayın. Hücreleri 0.5 ila 1 mililitre% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve Petri kabını inkübatöre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 5 dakika boyunca yerleştirin.4,5 ila 9 mililitre büyüme ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini söndürün ve hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir pipet kullanarak 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 kez g'de döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve peleti 3 mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın.Manuel bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve filtre eki başına 40.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Her bir kesici uç için hücre süspansiyonunun hacmi 250 mikrolitredir. Kaplama çözeltisini geçirgen kesici uçlar içeren kuyucuklardan aspire edin ve kesici uç başına 250 mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın, ardından kesici uçlardan birine sadece orta ekleyin, bu da transendotelyal elektrik direnci veya TEER ölçümü için boş bir kontrol olarak kullanılacaktır.Aynı zamanda, bazolateral odalarda kuyu başına 750 mikrolitre ortam ekleyin. Kültürlenmiş hücreler tamamen kaynaşana ve santimetre kare başına yaklaşık 20 ohm istenen TEER değerine ulaşılana kadar inkübatörde geçirgen uçlu 24 delikli plakayı 7 ila 12 gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte tutun. TEER ölçümlerinden önce, hücre içeren 24 delikli plakayı, sıcaklık dengesi için oda sıcaklığında laminer akış başlığına 15 ila 20 dakika boyunca yerleştirin.HRMEC'ler için TEER'yi ölçmek için, bir epitel volt / ohm metre elektrik direnci sistemi kullanarak, elektrodu metreye bağlayın ve elektrodu önce 15 ila 20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra hücre kültürü EGM büyüme ortamına kısaca batırarak dengeleyin. Elektrotu dikkatlice daldırarak TEER ölçümü yapın, böylece kısa uç kesici uçta olur ve uzun uç kuyucuğun dibine temas eder. Önce boş kontrol boyunca direnci ölçün, ardından her kesici uç için TEER'yi üçlü olarak ölçün.20 ohm santimetrekare civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, ligand ile tedaviden önce her iki odada EBM'de% 0.5 FBS kullanarak, hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat ve% 5 karbondioksit kullanarak% 5 karbondioksitten mahrum bırakın. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı. Apikal odadaki serum indirgenmiş ortamı kullanarak hücreleri, floresan siyanin-3 etiketli olarak, 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca transferrin ligandına kadar inkübe edin.Tek katmanı apikal ve bazolateral olarak serum indirgenmiş ortam ile 4 kez yıkadıktan sonra, hücreleri içeren filtre uçlarına taze ortam ekleyin ve ekleri önceden ısıtılmış serum indirgenmiş ortam içeren 24 delikli plakanın taze kuyucuklarına aktarın. Hücreleri inkübatörde 90 dakika daha inkübe edin ve daha sonra ortamı bazolateral odadan toplayın. Bir floresan dedektörü kullanarak çözeltinin floresan yoğunluğunu bazolateral odadan kaydedin.20 ohm santimetrekare civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, ligand ile tedaviden önce her iki odadaki EBM'de% 0.5 FBS kullanarak, hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat ve% 5 karbondioksit kullanarak% 5 karbondioksitten mahrum bırakın. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı. Daha sonra, apikal odadaki hücreleri istenen tedaviler ve araç kontrolleri ile tedavi edin.Hücrelere mililitre yaban turpu peroksidaz veya HRP başına 5 miligram ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Apikal hazneye taze serum azaltılmış ortam ekleyin ve kesici uçları önceden ısıtılmış ortam içeren taze bir kuyuya aktarın. Tek katmanı inkübatörde 90 dakika daha inkübe edin.Bazolateral odadan ortam topladıktan sonra, toplanan ortama 100 mikrolitre HRP florojenik peroksidaz substratı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ile reaksiyonu durdurun ve bir floresan plaka okuyucu kullanarak ortamdaki HRP substrat reaksiyon ürününün seviyelerini tespit edin. İn vitro transsitoz tahlilleri gösterilmeden önce, retinadaki endotel hücre transsitozunun görüntülenmesi arka plan bilgisi olarak gösterilir.Burada, ışık mikroskobu görüntüsü, DAB ile boyanmış 3 aylık vahşi tip bir fare retina bölümünden HRP dolu bir kan damarı lümenini göstermektedir. HRP retro-orbital olarak enjekte edildi. HRP dolgulu retinal damarlar, ışık mikroskobu altında koyu kahverengi çökelti olarak görülebilir.Transmisyon elektron mikroskobu ultra ince kesit, iç kan-retinal bariyer boyunca EC transsitozunu gösteren RMEC'li HRP dolgulu transsitotik damarları gösterir. Burada, büyük vezikül potansiyel olarak makropinozomu ve luminol tarafındaki kırmızı kan hücresini yansıtır. TeM görüntüsü, RMEK içinde HRP dolu küçük transsitotik vezikülleri, muhtemelen caveola veziküllerini göstermektedir.CAV-1 antikoru ve izolektin B4'ün immünohistokimya boyaması, 3 aylık vahşi tip fare retinasında, retinal kan damarlarında caveola veziküllerinin bir belirteci olan CAV-1'in lokalizasyonunu göstermektedir. Retinal endotel hücreleri içindeki immünoaltın etiketli CAV-1'in TeM görüntüsü, CAV-1 pozitif caveola vezikülünün büyütülmüş bir görüntüsü ile burada gösterilmiştir. Transferrin kullanan HRMEC'lerde klatrin aracılı EC transsitoz testi için, burada, bir floresan mikroskobu görüntüsü, mavi renkte DAPI ile boyanmış HRMEC'ler içinde kırmızı renkte endositozlu Cy3 transferrini göstermektedir.HRP kullanan kaveola aracılı EC transsitozu için, buradaki Wnt sinyalizasyonu testi göstermek için örnek olarak kullanılmıştır. Wnt sinyalizasyonunun son zamanlarda kaveola aracılı EC transsitozunu düzenlediği bulunmuştur. Hücreler, Wnt sinyal inhibitörü XAV939 ve reaktif kontrolleri olan veya olmayan Wnt yol aktivatörü Wnt3a şartlı ortam ve rekombinant Norrin ile tedavi edildi.Wnt aktivatörleri, XAV939 tarafından tersine çevrilen HRP bazlı transsitoz seviyesini düşürdü. Tek katmanlı bütünlüğü belirlemek için doğru TEER ölçümü çok önemlidir. Yanlış kullanım, sıcaklık dalgalanmaları, kültür ortamı, kültür süresi vb. gibi çeşitli faktörlerden büyük ölçüde etkilenir.Bu test, in vivo koşulları taklit eden ko-kültür veya 3D organotipik kültür sistemleri olarak değiştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An<em&gt; In vivo</emKan Gemi Geçirgenlik Test&gt; Test

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em&gt; In Vitro</em&gt; İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...