Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

نشكر الدكتور ستيفن شوينبيرجر على توفير خلايا B16-Flt3L وموظفي مرافق قياس الحيوان والتدفق الخلوي LJI للحصول على دعم ممتاز.

تم الحفاظ على جميع الفئران المستخدمة في الدراسة وإيوائها في حظيرة معهد لا جولا لعلم المناعة (LJI) في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة. تم إجراء تجارب على الحيوانات مع إناث الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-14 أسبوعا وفقا للإرشادات والبروتوكولات المعتمدة ...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

يعتمد البروتوكول الموصوف هنا على الدراسة التي أجرتها مجموعة أليسون. لقد أظهروا أن الجمع بين لقاح B16-Flt3L مع حصار CTLA-4 أظهر تأثيرا تآزريا على معدل البقاء على قيد الحياة ونمو الورم ، في حين لم يلاحظ أي انخفاض في نمو الورم في الفئران التي تتلقى لقاح B16-Flt3L أو علاج الأجسام المضادة ل CTLA-4 وحده<sup class="xr...

تم التعرف على العلاج المناعي للسرطان كاستراتيجية علاجية واعدة بناء على آثاره الجانبية الأقل سمية والاستجابات الأكثر ديمومة. تم تطوير عدة أنواع من العلاجات المناعية ، بما في ذلك علاجات فيروس الأورام ، ولقاحات السرطان ، وعلاجات السيتوكين ، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، ونقل الخلايا بالتبني (خلايا CAR-T أو CAR-NK) ، وحصار نقطة التفتيش المناعية1.
بالنسبة للقاحات السرطان ، هناك أشكال مختلفة من اللقاحات العلاجية ، مثل اللقاحات القائمة على الخلايا الكاملة ، ولقاحات البروتين أو الببتيد ، ولقاحات الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي. يعتمد التطعيم على قدرة الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) على معالجة مستضدات الورم ، بما في ذلك المستضدات الخاصة بالورم ، وتقديمها في شكل مناعي للخلايا التائية. من المعروف أن الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى APCs ويعتقد أنها تلعب دورا مهما في المناعة المضادة للأورام 2,3. تمتص هذه الخلايا مستضدات الورم وتعالجها ، ثم تهاجر إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة (dLN) لتجهيز وتنشيط خلايا المستجيب التائية الخاصة بالورم (Teff) من خلال إشراك مستقبلات الخلايا التائية (TCR) والجزيئات المكلفة. ينتج عن هذا تمايز وتوسع الخلايا التائية السامة للورم (CTL) ، والتي تتسلل إلى الورم وتقتل الخلايا السرطانية4. وبالتالي ، فإن تنشيط ونضج DCs يمثلان استراتيجيات جذابة لتحفيز المناعة ضد مستضدات الورم.
من المعروف أن Flt3L يعزز نضوج وتوسع DCs الناضجة وظيفيا التي تعبر عن بروتينات MHC من الفئة II و CD11c و DEC205 و CD865. ثبت أن الإدارة داخل الورم ، ولكن ليس عن طريق الوريد ، لناقل الفيروس الغدي الذي يتضمن جين Flt3L (Adv-Flt3L) تعزز النشاط العلاجي المناعي ضد أورام الخصية6. كما تم استخدام Flt3L في اللقاحات القائمة على الخلايا السرطانية التي تتكون من خلايا B16-F10 المشععة التي تعبر بثبات عن Flt3L المحول بالفيروسات القهقرية كوسيلة لتعزيز العرض المتقاطع لمستضدات الورم بواسطة DCs ، وبالتالي زيادة الاستجابات المضادة للأورام. يعتمد بروتوكول التطعيم ضد الورم B16-Flt3L الموصوف هنا على دراسة نشرتها مجموعة الدكتور جيمس أليسون7. في هذه الورقة ، أفادوا أن لقاح B16-Flt3L جنبا إلى جنب مع حصار CTLA-4 أدى بشكل تآزري إلى رفض سرطان الجلد الثابت ، مما أدى إلى زيادة البقاء على قيد الحياة.
الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نموذج العلاج المناعي قبل السريري لسرطان الجلد. هنا ، يتم وصف الإجراءات التفصيلية لكيفية تحضير وزرع لقاحات الورم ، وكيفية تحليل تكوين ووظيفة الخلايا المناعية داخل الورم من الورم الصلب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

التيروزين كيناز 3 ليجند الشبيه ب Fms (Flt3L) هو سيتوكين مكون للدم يعزز بقاء وتمايز الخلايا المتغصنة (DCs). تم استخدامه في لقاحات الأورام لتنشيط المناعة الفطرية وتعزيز الاستجابات المضادة للأورام. يوضح هذا البروتوكول نموذجا علاجيا باستخدام لقاح الورم القائم على الخلايا الذي يتكون من خلايا الورم الميلانيني B16-F10 المعبرة عن Flt3L جنبا إلى جنب مع التحليل الظاهري والوظيفي للخلايا المناعية في البيئة المكروية للورم (TME). يتم وصف إجراءات تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس حجم الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير نموذج العلاج المناعي للورم الصلب قبل السريري ، ومنصة بحثية لدراسة العلاقة بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية المتسللة. يمكن دمج بروتوكول العلاج المناعي الموصوف هنا مع طرق علاجية أخرى ، مثل حصار نقاط التفتيش المناعية (الأجسام المضادة ل CTLA-4 ، والأجسام المضادة ل PD-1 ، والأجسام المضادة ل PD-L1) أو العلاج الكيميائي من أجل تحسين التأثير العلاجي للسرطان لسرطان الجلد.

عادة ما يتم ملاحظة نقطة سوداء مرئية لخلايا B16-F10 المزروعة على سطح الجلد ~ 3 أيام بعد زرع الورم. يتم علاج الفئران بلقاح الورم بعد 3 و 6 و 9 أيام من وصول العقيدة الورمية إلى حجم ≥2 مم. لاحظنا انخفاضا كبيرا في نمو الورم في مجموعة الفئران الملقحة ~ 2 أسابيع بعد زرع الورم (الشكل 1). في نها...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

يقدم البروتوكول نموذجا للعلاج المناعي للسرطان باستخدام التطعيم ضد الورم القائم على الخلايا مع سرطان الجلد B16-F10 المعبر عن Flt3L. يوضح هذا البروتوكول الإجراءات ، بما في ذلك تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس نمو الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي.

نموذج العلاج المناعي التجريبي للورم الميلانيني باستخدام التطعيم ضد الورم باستخدام السيتوكين المكونة للدم

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

يوفر هذا البروتوكول نموذج العلاج المناعي للأورام الصلبة السريرية ومنصة بحثية لدراسة العلاقة بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية المتسللة. لقاح الورم القائم على الخلايا هذا مناسب ومباشر للاستخدام ، ويمكن دمجه مع طرق علاجية أخرى مثل حصار نقاط التفتيش ، لتحقيق تأثير إضافي أو تآزري يمكن أن يؤدي إلى مناعة أكثر قوة وعالية من الورم. ستساعد في إظهار الإجراء آن بالانسيو ، وهي فنية أبحاث من مختبري.للبدء ، استزرع خلايا سرطان الجلد B16-F10 في IMDM ، تحتوي على 10٪ حرارة غير نشطة FBS ، 2 مليمولار جلوتامين ، 1 مليمولار بيروفات الصوديوم ، 1 مليمولار MEM أحماض أمينية غير أساسية و 100 وحدة لكل ملليلتر لكل من البنسلين والستربتومايسين. الحفاظ على خط الخلية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بذر وحصاد خلايا B16-F10 كما هو موضح في مخطوطة النص.قم بإزالة وسط الاستزراع واغسل القوارير مرة واحدة باستخدام PBS. قم بشفط PBS وأضف 5 ملليلتر من 0.25٪ من التربسين-EDTA ، متبوعا بالنقر بقسوة على حافة قارورة الثقافة. أضف 15 ملليلترا من وسط الاستزراع لتحييد التربسين-EDTA وصب محتويات القارورة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.اغسل سطح الطبق ب 10 ملليلتر من PBS واسكبه في نفس أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 200 RCF. تخلص من المادة الطافية وكسر حبيبات الخلية عن طريق النقر بالإصبع على قاع الأنبوب.أضف 10 ملليلتر باردة من PBS وماصة برفق تعليق الخلية. ثم عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم. الحفاظ على الخلايا على الجليد قبل الحقن.زرع داخل الأدمة 500،000 خلية B16-F10 الخلايا السرطانية في 50 ميكرولتر من PBS الباردة في الجانب الأيسر ، وذلك باستخدام إبرة قياس 30. قد تحتاج جرعة الخلايا السرطانية المزروعة B16-F10 إلى تعديلها في نطاق من 50،000 إلى 500،000 خلية لتطوير الورم بنجاح. بعد التنفيذ ، قم بقياس طول الورم وعرضه ثلاث مرات في الأسبوع باستخدام الفرجار الرقمي الإلكتروني.احسب حجم الورم وعالج الفئران بلقاح الورم عندما تصل الأورام إلى حجم مليمترين كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام جهاز تشعيع بالأشعة السينية عند 160 كيلوفولت و 25 مللي أمبير ، قم بتشعيع الخلايا عند 150 جرعة رمادية من أشعة جاما. عد وتحقق من صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ تريبان الأزرق قبل الحقن.حقن الفئران داخل الأدمة بمليون خلية B16-Flt3L مشعة في 50 ميكرولتر من PBS البارد على نفس الجناح مثل زرع الورم الأصلي. ما يقرب من سنتيمتر واحد من موقع الورم الرئيسي في الأيام 3 و 6 و 9 بعد زرع الخلية الأولي. ضع علامة على مواقع حقن اللقاح بقلم ملون لتمييزها عن الورم الرئيسي.إذا تم زرع 50،000 خلية B16-F10 في البداية ، فمن المستحسن إجراء علاج اللقاح في الأيام 8 و 11 و 14. إزالة الورم جراحيا مع الجلد من كل فأر القتل الرحيم ووضعه في لوحة بئر 24 مع 1 ملليلتر من 10 ٪ FBS RPMI 1640 المتوسطة. قطع الأورام إلى قطع صغيرة في ملليلتر من عازلة الهضم واحتضانها لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية.أضف 10 ملليلتر من 10٪ FBS RPMI 1640 متوسطة لوقف عملية الهضم. انقل الخلايا إلى مصفاة خلية 40 ميكرومتر باستخدام ماصة مصلية سعة 25 ملليلتر. ثم استخدم مكبس حقنة ملليلتر واحد لطحن الأنسجة.أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 RCF لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 5 ملليلتر من وسط محدد التدرج بكثافة 40٪ في PBS المخفف إلى تركيز 1x. أضف معلق الخلية ببطء فوق 5 ملليلتر من وسط محدد متدرج الكثافة بنسبة 80٪ يحتوي على PBS.جهاز طرد مركزي للخلايا عند 325 RCF مع إعداد فرامل منخفض لمدة 23 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، اجمع بعناية طبقة الكريات البيض عند الواجهة بين 40٪ و 80٪ من الوسط المحدد للتدرج الكثافة، وقم بتمريرها عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 RCF لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.احتضان الحبيبات في ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أضف 10 ملليلتر من وسيط FBS RPMI 1640 بنسبة 10٪ لإخماد المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 400 RCF لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.أعد تعليق الخلايا في 0.5 ملليلتر من وسط FBS RPMI 1640 بنسبة 10٪ ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا قبل الاستخدام لمزيد من التحليل. اجمع الطحال أو الغدد الليمفاوية المستنزفة كعناصر تحكم لاستراتيجية بوابة المجموعات الفرعية للخلايا المناعية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. اتبع طريقة عزل الخلية الموضحة في مخطوطة النص.عادة ما لوحظت نقطة سوداء مرئية لخلايا B16-F10 المزروعة على سطح الجلد بعد حوالي ثلاثة أيام من زرع الورم. وعولجت الفئران بلقاح الورم بعد ثلاثة وستة وتسعة أيام من وصول العقيدة الورمية إلى حجم مليمترين أو تجاوزه. لوحظ انخفاض كبير في نمو الورم في مجموعة الفئران الملقحة بعد حوالي أسبوعين من زرع الورم.احتوت الخلايا التي تم جمعها من طبقة الكريات البيض على العديد من الخلايا السرطانية ، مما يجعل من الصعب تحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية بسهولة. لذلك ، تم استخدام الخلايا الطحالية بالتوازي ، من أجل البوابات المناسبة للمجموعات الفرعية للخلايا المناعية داخل الورم في تحليل قياس التدفق الخلوي. تم رسم استراتيجيات بوابات CD103 الإيجابية ، CD11C إيجابية DC ، CD8 إيجابية ، CD4 إيجابية ، و Treg جنبا إلى جنب مع مصفوفة التعويض.كما تم توفير بيانات تمثيلية للحسابات المكتسبة وتواتر كل مجموعة سكانية. أظهر CD103 الإيجابي داخل الورم ، CD11C الإيجابي DC من الفئران الملقحة ، تعبيرا مرتفعا بشكل ملحوظ عن الرباط التحفيزي المشترك CD86. أظهرت الفئران الملقحة أيضا زيادة في تسلل الورم الإيجابي CD8 والخلايا الإيجابية CD4 ، والخلايا السلبية Foxp3 ، وكذلك في CD8 الإيجابي للجرانزيم B الإيجابي و CTLs إيجابية جاما الإنترفيرون.حافظ على مسافة كافية بين الورم الرئيسي ولقاح الورم. هذا الفصل الجسدي أمر بالغ الأهمية لتجنب الاندماج المحتمل بين غرستي الورم.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

فأري موديل التجريبية التنمية الورم الأصلي والبريتوني ورم خبيث<em&gt; عبر</em&gt; مثلي تلقيح مع خلايا المبيض سرطان

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

والفئران مثلي المثانة نموذج ورم والورم نظام لكشف

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

ورم انجرافتمينت في نموذج الفأر إكسينوجرافت من عباءة البشرية الخلية اللمفاوية

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

كريسبر/Cas9 باستخدام الجينات للتحقيق في نشاط النمطان Calreticulin المسخ في الخلايا المكونة للدم سيتوكين تعتمد على تحرير

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

في ريتشالينجي خلية الورم المختبر للتقييم التنبؤي من مستضد تشيميريك مستقبلات خلية تي انتيتومور الدالة

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

نموذج Xenograft مشتق من سرطان الجلد

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

رواية سترومال ليفيبليوم-تعديل 3D نموذج الورم كرويويد لدراسة الورم ستروما التفاعل واكتشاف المخدرات

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...