Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Vi takker Dr. Stephen Schoenberger for at have leveret B16-Flt3L-celler og personalet på LJI-dyre- og flowcytometrifaciliteterne for fremragende support.

Alle mus, der blev brugt i undersøgelsen, blev vedligeholdt og anbragt i vivarium fra La Jolla Institute for Immunology (LJI) under specifikke patogenfrie forhold med kontrolleret temperatur og fugtighed. Dyreforsøg blev udført med 8-14 uger gamle hunmus C57BL/6 i henhold til retningslinjer og protokoller godkendt af LJI Animal Care Committee.
1. Forberedelse af dyrkede tumorceller til implantation
<ol><li>Kultur B16-F10 melanomceller i Iscoves modificerede Dulbeccos medi...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

Protokollen beskrevet her er baseret på undersøgelsen fra Allisons gruppe. De viste, at kombinationen af B16-Flt3L-vaccine med CTLA-4-blokade viste en synergistisk effekt på overlevelsesrate og tumorvækst, mens der ikke sås nogen reduktion af tumorvækst hos mus, der fik B16-Flt3L-vaccinen eller anti-CTLA-4-antistofbehandling alene7. Nylige undersøgelser har afsløret en ny Treg-iboende CTLA4-PKCη signalvej, der spiller en vigtig obligatorisk rolle i reguleringen af den kontaktafhængige un...

Cancer immunterapi er blevet anerkendt som en lovende terapeutisk strategi baseret på dens mindre giftige bivirkninger og mere holdbare reaktioner. Der er udviklet flere typer immunterapier, herunder onkolytiske virusterapier, kræftvacciner, cytokinterapier, monoklonale antistoffer, adoptivcelleoverførsel (CAR-T-celler eller CAR-NK) og immunkontrolpunktblokade1.
For kræftvacciner er der forskellige former for terapeutiske vacciner, såsom hele cellebaserede vacciner, protein- eller peptidvacciner og RNA- eller DNA-vacciner. Vaccination er afhængig af antigenpræsenterende cellers (APC'ers) evne til at behandle tumorantigener, herunder tumorspecifikke antigener, og præsentere dem i en immunogen form for T-celler. Dendritiske celler (DC'er) har været kendt for at være de mest potente APC'er og menes at spille en vigtig rolle i antitumorimmunitet 2,3. Disse celler optager og behandler tumorantigener og migrerer derefter til de drænende lymfeknuder (dLN) for at prime og aktivere tumorspecifikke T-effektor (Teff) celler gennem engagement af T-cellereceptoren (TCR) og costimulatoriske molekyler. Dette resulterer i differentiering og udvidelse af tumorspecifikke cytotoksiske T-celler (CTL), som infiltrerer tumoren og dræber tumorceller4. Derfor repræsenterer aktivering og modning af DC'er attraktive strategier til at stimulere immunitet mod tumorantigener.
Flt3L er kendt for at fremme modning og udvidelse af funktionelt modne DC'er, der udtrykker MHC klasse II, CD11c, DEC205 og CD86 proteiner5. Intratumoral, men ikke intravenøs, administration af en adenovirusvektor, der inkorporerer Flt3L-genet (Adv-Flt3L), har vist sig at fremme immunterapeutisk aktivitet mod ortrotopiske tumorer6. Flt3L er også blevet anvendt i tumorcellebaserede vacciner bestående af bestrålede B16-F10-celler, der stabilt udtrykker retroviralt transduceret Flt3L som en måde at forbedre krydspræsentationen af tumorantigener af DC'er og dermed øge antitumorresponserne. Protokollen for B16-Flt3L tumorvaccination beskrevet her er baseret på en undersøgelse offentliggjort af Dr. James Allisons gruppe7. I dette papir rapporterede de, at en B16-Flt3L-vaccine kombineret med CTLA-4-blokade synergistisk inducerede afvisning af etableret melanom, hvilket resulterede i øget overlevelse.
Målet med denne protokol er at tilvejebringe en præklinisk immunterapimodel for melanom. Her beskrives detaljerede procedurer for, hvordan man forbereder og implanterer tumorvacciner, og hvordan man analyserer sammensætningen og funktionen af intratumorale immunceller fra fast tumor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

Fms-lignende tyrosinkinase 3 ligand (Flt3L) er et hæmatopoietisk cytokin, der fremmer overlevelse og differentiering af dendritiske celler (DC'er). Det er blevet brugt i tumorvacciner til at aktivere medfødt immunitet og forbedre antitumorresponser. Denne protokol demonstrerer en terapeutisk model ved anvendelse af cellebaseret tumorvaccine bestående af Flt3L-ekspressive B16-F10 melanomceller sammen med fænotypisk og funktionel analyse af immunceller i tumormikromiljøet (TME). Procedurer for dyrkning af tumorcelleforberedelse, tumorimplantation, cellebestråling, måling af tumorstørrelse, intratumoral immuncelleisolering og flowcytometrianalyse er beskrevet. Det overordnede mål med denne protokol er at tilvejebringe en præklinisk solid tumorimmunterapimodel og en forskningsplatform til at studere forholdet mellem tumorceller og infiltrerende immunceller. Immunterapiprotokollen beskrevet her kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter, såsom immunkontrolpunktblokade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antistoffer) eller kemoterapi for at forbedre den kræftterapeutiske virkning af melanom.

En synlig sort prik af de implanterede B16-F10-celler observeres normalt på hudoverfladen ~ 3 dage efter tumorimplantation. Mus behandles med tumorvaccinen 3, 6 og 9 dage efter, at tumorknuden har nået en størrelse på ≥2 mm. Vi observerede en signifikant reduktion i tumorvækst hos vaccinerede mus ~ 2 uger efter tumorimplantation (figur 1). I slutningen af eksperimentet isolerede vi de intratumorale immunceller og analyserede deres antal og celleoverflademarkørekspression samt cytokin...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Protokollen præsenterer en kræftimmunterapimodel ved hjælp af cellebaseret tumorvaccination med Flt3L-ekspressive B16-F10 melanom. Denne protokol demonstrerer procedurerne, herunder forberedelse af dyrkede tumorceller, tumorimplantation, cellebestråling, måling af tumorvækst, isolering af intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.

Eksperimentel melanom immunterapi model ved hjælp af tumorvaccination med et hæmatopoietisk cytokin

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Denne protokol giver klinisk solid tumorimmunterapi model og en forskningsplatform til at studere forholdet mellem tumorceller og infiltrerende immunceller. Denne cellebaserede tumorvaccine er praktisk, ligetil at bruge og kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter såsom checkpoint-blokade for at opnå additiv eller synergistisk effekt, der kan resultere i mere potent og høj tumorimmunitet. Med til at demonstrere proceduren vil være Ann Balancio, en forskningstekniker fra mit laboratorium.Til at begynde med dyrkes B16-F10 melanomceller i IMDM, der indeholder 10% varme inaktiv FBS, 2 millimolar glutamin, 1 millimolar natriumpyruvat, 1 millimolar MEM ikke-essentielle aminosyrer og 100 enheder pr. milliliter hver af penicillin og streptomycin. Oprethold cellelinjen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Frø og høst B16-F10-cellerne som beskrevet i tekstmanuskriptet.Fjern dyrkningsmediet, og vask kolberne én gang med PBS. Aspirer PBS og tilsæt 5 ml 0,25% trypsin-EDTA, efterfulgt af hårdt at banke på kanten af kulturkolben. Tilsæt 15 ml kulturmedium for at neutralisere trypsin-EDTA og hæld indholdet af kolben i et 50 ml centrifugerør.Vask opvaskeoverfladen med 10 ml PBS og hæld i det samme 50 ml centrifugerør. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 200 RCF. Kassér supernatanten og bryd cellepelleten ved at fingerklikke på bunden af røret.Tilsæt kolde 10 ml PBS og pipetter forsigtigt cellesuspensionen. Tæl derefter cellerne manuelt ved hjælp af et hæmocytometer. Hold cellerne på is før injektion.Intradermalt implantat 500.000 celler B16-F10 tumorceller i 50 mikroliter kold PBS i venstre flanke ved hjælp af en 30 gauge nål. Dosis af implanterede B16-F10 tumorceller skal muligvis justeres i et interval på 50.000 til 500.000 celler for en vellykket tumorudvikling. Efter implementering måles tumorlængden og bredden tre gange om ugen ved hjælp af en elektronisk digital tykkelse.Beregn tumorvolumen og behandl musene med tumorvaccine, når tumorer har nået en størrelse på to millimeter som beskrevet i tekstmanuskriptet. Ved hjælp af en røntgenbestråler indstillet til 160 kilovolt og 25 milliampere, bestråle celler ved 150 grå doser gammastråler. Tæl og kontroller cellens levedygtighed ved trypanblå farvning før injektion.Intradermalt injicere musene med 1 million bestrålede B16-Flt3L-celler i 50 mikroliter kold PBS på samme flanke som den oprindelige tumorimplantation. Ca. en centimeter fra stedet for den primære tumor på dag 3, 6 og 9 efter den første celleimplantation. Marker vaccineinjektionsstederne med en farvet pen for at skelne dem fra den primære tumor.Hvis 50.000 B16-F10-celler oprindeligt blev implanteret, anbefales det at udføre vaccinebehandling på dag 8, 11 og 14. Kirurgisk fjernede tumoren med huden fra hver aflivet mus og satte den i en 24 brøndplade med 1 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium. Skær tumorerne i små stykker i to milliliter fordøjelsesbuffer og inkuber i 25 minutter ved 37 grader Celsius.Tilsæt 10 ml 10% FBS RPMI 1640 medium for at stoppe fordøjelsen. Overfør cellerne til en 40 mikrometer cellesi ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette. Brug derefter stemplet på en en milliliter sprøjte til at male vævene.Centrifuge cellerne ved 500 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Pelleten resuspenderes i 5 ml 40% densitetsgradientspecifikt medium i PBS fortyndet til 1x koncentration. Cellesuspensionen tilsættes langsomt oven på 5 ml 80% densitetsgradientspecifikt medium indeholdende PBS.Centrifuge til cellerne ved 325 RCF med en lav bremseindstilling i 23 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering opsamles leukocytlaget forsigtigt ved grænsefladen mellem 40% og 80% densitetsgradientspecifikt medium og føres gennem en 40 mikrometer cellesi. Centrifuge cellerne ved 500 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius.Inkuber pelleten i to milliliter lysisbuffer for røde blodlegemer i fem minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation tilsættes 10 ml 10% FBS RPMI 1640 medium for at slukke RBC-lysisbufferen. Centrifuge cellerne ved 400 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius.Resuspender cellerne i 0,5 ml 10% FBS RPMI 1640 medium, og tæl det samlede antal celler før brug til yderligere analyse. Saml milten eller de drænende lymfeknuder som kontroller for gatingstrategien for immuncelleundergrupper ved flowcytometrianalyse. Følg celleisoleringsmetoden beskrevet i tekstmanuskriptet.En synlig sort prik af de implanterede B16-F10-celler blev normalt observeret på hudoverfladen ca. tre dage efter tumorimplantation. Mus blev behandlet med en tumorvaccine tre, seks og ni dage efter, at tumorknuden havde nået eller overskredet størrelsen på to millimeter. En signifikant tumorvækstreduktion blev observeret i den vaccinerede musgruppe ca. to uger efter tumorimplantation.Celler indsamlet fra leukocytlaget indeholdt mange tumorceller, hvilket gjorde det vanskeligt at let definere lymfocytpopulationen. Derfor blev splenocyt anvendt parallelt til korrekt gating af intratumorale immuncelleundergrupper i flowcytometrianalyse. Gating-strategierne for CD103-positive, CD11C-positive DC, CD8-positive, CD4-positive og Treg blev plottet sammen med kompensationsmatrixen.Repræsentative data om erhvervede konti og hyppighed af hver befolkning blev også leveret. Intratumoral CD103-positiv, CD11C-positiv DC fra vaccinerede mus, viste en signifikant forhøjet ekspression af den co-stimulerende ligand CD86. Vaccinerede mus viste også en stigning i tumorinfiltrerende CD8-positive og CD4-positive, Foxp3-negative celler såvel som i CD8-positive granzyme B-positive og interferon gamma-positive CTL'er.Hold en tilstrækkelig afstand mellem den primære tumor og tumorvaccinen. Denne fysiske adskillelse er afgørende for at undgå potentiel fusion mellem de to tumorimplantater.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Eksperimentel Model af oprindelige tumor udvikling og Peritoneal Metastase<em&gt; via</em&gt; Orthotopisk Podning med ovariekarcinomceller

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Muse ortotopisk Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumor Engraftment i en Xenograft musemodel af menneskelige Mantle celle lymfom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering til at undersøge de muterede aktivitet af Mutant Calreticulin i cytokin afhængige hæmatopoietisk celler

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom klumpformet hudmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro Tumor celle Rechallenge For intelligent evaluering af kimære Antigen Receptor T-celle Antitumor funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

En melanom patient afledt xenograft-model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Moduleret 3D Tumor Spheroid Model for at studere Tumor-Stroma Interaktion og Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...