Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

We bedanken Dr. Stephen Schoenberger voor het leveren van B16-Flt3L-cellen en het personeel van de LJI-dier- en flowcytometriefaciliteiten voor uitstekende ondersteuning.

Alle muizen die in de studie werden gebruikt, werden onderhouden en gehuisvest in het vivarium van het La Jolla Institute for Immunology (LJI) onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid. Dierproeven werden uitgevoerd met 8-14 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen volgens richtlijnen en protocollen goedgekeurd door de LJI Animal Care Committee.
1. Voorbereiding van gekweekte tumorcellen voor implantatie
<ol><li>Kweek B16-F10 m...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

Het hier beschreven protocol is gebaseerd op de studie van allison's groep. Ze toonden aan dat de combinatie van B16-Flt3L-vaccin met CTLA-4-blokkade een synergetisch effect had op de overlevingskans en tumorgroei, terwijl er geen vermindering van tumorgroei werd gezien bij muizen die alleen het B16-Flt3L-vaccin of anti-CTLA-4-antilichaambehandelingkregen 7. Recente studies hebben een nieuwe Treg-intrinsieke CTLA4-PKCη signaleringsroute onthuld die een belangrijke verplichte rol speelt bij het re...

Kankerimmunotherapie is erkend als een veelbelovende therapeutische strategie op basis van de minder toxische bijwerkingen en duurzamere reacties. Er zijn verschillende soorten immunotherapieën ontwikkeld, waaronder oncolytische virustherapieën, kankervaccins, cytokinetherapieën, monoklonale antilichamen, adoptieve celoverdracht (CAR-T-cellen of CAR-NK) en immuuncheckpointblokkade1.
Voor kankervaccins zijn er verschillende vormen van therapeutische vaccins, zoals vaccins op basis van hele cellen, eiwit- of peptidevaccins en RNA- of DNA-vaccins. Vaccinatie is afhankelijk van het vermogen van antigeen-presenterende cellen (APC's) om tumorantigeen, waaronder tumorspecifieke antigenen, te verwerken en in een immunogene vorm aan T-cellen te presenteren. Van dendritische cellen (DC's) is bekend dat ze de krachtigste APC's zijn en worden verondersteld een belangrijke rol te spelen in de immuniteit van de antitumor 2,3. Deze cellen nemen tumorantigenen op en verwerken deze en migreren vervolgens naar de drainerende lymfeklieren (dLN) om tumorspecifieke T-effectorcellen (Teff) te primen en te activeren door betrokkenheid van de T-celreceptor (TCR) en costimulatorische moleculen. Dit resulteert in differentiatie en uitbreiding van tumorspecifieke cytotoxische T-cellen (CTL), die de tumor infiltreren en tumorcellen doden4. Bijgevolg vertegenwoordigen activering en rijping van DC's aantrekkelijke strategieën om de immuniteit tegen tumorantigenen te stimuleren.
Van Flt3L is bekend dat het de rijping en uitbreiding bevordert van functioneel volwassen DC's die MHC klasse II, CD11c, DEC205 en CD86 eiwitten tot expressie brengen5. Intratumorale, maar niet intraveneuze toediening van een adenovirusvector waarin het Flt3L-gen (Adv-Flt3L) is opgenomen, heeft aangetoond dat het immuuntherapeutische activiteit tegen ortrotopische tumoren bevordert6. Flt3L is ook gebruikt in op tumorcellen gebaseerde vaccins bestaande uit bestraalde B16-F10-cellen die stabiel retroviraal getransduceerde Flt3L tot expressie brengen als een manier om de kruispresentatie van tumorantigenen door DC's te verbeteren en zo de antitumorresponsen te verhogen. Het protocol van B16-Flt3L tumorvaccinatie dat hier wordt beschreven, is gebaseerd op een studie gepubliceerd door Dr. James Allison's groep7. In dit artikel meldden ze dat een B16-Flt3L-vaccin in combinatie met CTLA-4-blokkade synergetisch de afwijzing van vastgesteld melanoom veroorzaakte, wat resulteerde in een verhoogde overleving.
Het doel van dit protocol is om een preklinisch immunotherapiemodel voor melanoom te bieden. Hier worden gedetailleerde procedures beschreven voor het bereiden en implanteren van tumorvaccins en het analyseren van de samenstelling en functie van intratumorale immuuncellen van solide tumoren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

Fms-achtige tyrosinekinase 3 ligand (Flt3L) is een hematopoëtisch cytokine dat de overleving en differentiatie van dendritische cellen (DC's) bevordert. Het is gebruikt in tumorvaccins om aangeboren immuniteit te activeren en antitumorresponsen te verbeteren. Dit protocol demonstreert een therapeutisch model met behulp van een op cellen gebaseerd tumorvaccin bestaande uit Flt3L-tot expressie brengende B16-F10 melanoomcellen samen met fenotypische en functionele analyse van immuuncellen in de tumormicro-omgeving (TME). Procedures voor kweekcelvoorbereiding, tumorimplantatie, celbestraling, tumorgroottemeting, intratumorale immuuncelisolatie en flowcytometrieanalyse worden beschreven. Het algemene doel van dit protocol is om een preklinisch solide tumorimmunotherapiemodel te bieden en een onderzoeksplatform om de relatie tussen tumorcellen en infiltrerende immuuncellen te bestuderen. Het hier beschreven immunotherapieprotocol kan worden gecombineerd met andere therapeutische modaliteiten, zoals immuuncheckpointblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1-antilichamen) of chemotherapie om het kankertherapeutische effect van melanoom te verbeteren.

Een zichtbare zwarte stip van de geïmplanteerde B16-F10-cellen wordt meestal waargenomen op het huidoppervlak ~ 3 dagen na tumorimplantatie. Muizen worden behandeld met het tumorvaccin 3, 6 en 9 dagen nadat de tumorknobbel een grootte van ≥2 mm heeft bereikt. We zagen een significante vermindering van tumorgroei in gevaccineerde muizengroep ~ 2 weken na tumorimplantatie (figuur 1). Aan het einde van het experiment isoleerden we de intratumorale immuuncellen en analyseerden we hun aantal e...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Dit protocol voorziet in een klinisch solide tumorimmunotherapiemodel en een onderzoeksplatform om de relatie tussen tumorcellen en infiltrerende immuuncellen te bestuderen. Dit op cellen gebaseerde tumorvaccin is handig, eenvoudig te gebruiken en kan worden gecombineerd met andere therapeutische modaliteiten zoals checkpointblokkade, om een additief of synergetisch effect te bereiken dat kan resulteren in krachtigere en hogere tumorimmuniteit. Ann Balancio, een onderzoekstechnicus uit mijn laboratorium, zal helpen om de procedure te demonstreren.Om te beginnen kweek B16-F10 melanoomcellen in IMDM, met 10% warmte-inactieve FBS, 2 millimolar glutamine, 1 millimol natriumpyruvaat, 1 millimol MEM niet-essentiële aminozuren en 100 eenheden per milliliter elk van penicilline en streptomycine. Houd de cellijn op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Zaai en oogst de B16-F10 cellen zoals beschreven in het tekstmanuscript.Verwijder het kweekmedium en was de kolven eenmaal met PBS. Aspirateer PBS en voeg 5 milliliter van 0,25% trypsine-EDTA toe, gevolgd door hard op de rand van de kweekkolf te tikken. Voeg 15 milliliter kweekmedium toe om het trypsine-EDTA te neutraliseren en giet de inhoud van de kolf in een centrifugebuis van 50 milliliter.Was het oppervlak van de afwas met 10 milliliter PBS en giet in dezelfde centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 RCF. Gooi het supernatant weg en breek de celkorrel door met de vinger op de onderkant van de buis te tikken.Voeg koude 10 milliliter PBS toe en pipetteer voorzichtig de celsuspensie. Tel vervolgens de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer. Houd de cellen op ijs voor injectie.Implanteer 500.000 cellen B16-F10 tumorcellen in 50 microliter koude PBS in de linkerflank, met behulp van een naald van 30 gauge. De dosis geïmplanteerde B16-F10-tumorcellen moet mogelijk worden aangepast in een bereik van 50.000 tot 500.000 cellen voor een succesvolle tumorontwikkeling. Meet na implementatie drie keer per week de lengte en breedte van de tumor met behulp van een elektronische digitale remklauw.Bereken het tumorvolume en behandel de muizen met een tumorvaccin wanneer tumoren een grootte van twee millimeter hebben bereikt zoals beschreven in het tekstmanuscript. Met behulp van een röntgenbestralingstoestel ingesteld op 160 kilovolt en 25 milliamperes, bestraal cellen met 150 grijze doses gammastralen. Tel en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-kleuring vóór injectie.Injecteer de muizen intradermaal met 1 miljoen bestraalde B16-Flt3L-cellen in 50 microliter koude PBS op dezelfde flank als de oorspronkelijke tumorimplantatie. Ongeveer een centimeter van de plaats van de primaire tumor op dag 3, 6 en 9 na de eerste celimplantatie. Markeer de injectieplaatsen van het vaccin met een gekleurde pen om ze te onderscheiden van de primaire tumor.Als er aanvankelijk 50.000 B16-F10-cellen werden geïmplanteerd, wordt aanbevolen om een vaccinbehandeling uit te voeren op dag 8, 11 en 14. Operatief verwijderde de tumor met de huid van elke geëuthanaseerde muis en plaatste deze in een 24-putplaat met 1 milliliter van 10% FBS RPMI 1640 medium. Snijd de tumoren in kleine stukjes in twee milliliter digestiebuffer en incubeer gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius.Voeg 10 milliliter van 10%FBS RPMI 1640 medium toe om de spijsvertering te stoppen. Breng de cellen over op een celzeef van 40 micrometer met behulp van een serologische pipet van 25 milliliter. Gebruik vervolgens de zuiger van een spuit van één milliliter om de weefsels te malen.Centrifugeer de cellen op 500 RCF gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Resuspendeer de pellet in 5 milliliter van 40% dichtheid gradiëntspecifiek medium in PBS verdund tot 1x concentratie. Voeg de celsuspensie langzaam toe bovenop 5 milliliter van 80% dichtheid gradiëntspecifiek medium dat PBS bevat.Centrifugeer naar de cellen bij 325 RCF met een lage reminstelling gedurende 23 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel na centrifugatie zorgvuldig de leukocytenlaag op het grensvlak tussen 40% en 80% dichtheidsgradiëntspecifiek medium en passeer het door een 40 micrometer celzeef. Centrifugeer de cellen op 500 RCF gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius.Incubeer de pellet in twee milliliter rode bloedcellysisbuffer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na incubatie 10 milliliter van 10% FBS RPMI 1640 medium toe om de RBC-lysisbuffer te doven. Centrifugeer de cellen op 400 RCF gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius.Resuspendeer de cellen in 0,5 milliliter van 10% FBS RPMI 1640 medium en tel het totale aantal cellen voor gebruik voor verdere analyse. Verzamel de milt of de drainerende lymfeklieren als controles voor de gatingstrategie van immuuncelsubsets door flowcytometrie-analyse. Volg de celisolatiemethode die in het tekstmanuscript wordt beschreven.Een zichtbare zwarte stip van de geïmplanteerde B16-F10-cellen werd meestal waargenomen op het huidoppervlak ongeveer drie dagen na de implantatie van de tumor. Muizen werden behandeld met een tumorvaccin drie, zes en negen dagen nadat de tumorknobbel de grootte van twee millimeter had bereikt of overschreden. Een significante vermindering van de tumorgroei werd waargenomen in de gevaccineerde muizengroep ongeveer twee weken na tumorimplantatie.Cellen verzameld uit de leukocytenlaag bevatten veel tumorcellen, waardoor het moeilijk was om de lymfocytenpopulatie gemakkelijk te definiëren. Daarom werden splenocyten parallel gebruikt, voor een goede gating van intratumorale immuuncelsubsets in flowcytometrie-analyse. De gatingstrategieën van CD103 positief, CD11C positief DC, CD8 positief, CD4 positief en Treg werden samen met de compensatiematrix uitgezet.Representatieve gegevens van verworven rekeningen en frequentie van elke populatie werden ook verstrekt. Intratumorale CD103-positieve, CD11C-positieve DC van gevaccineerde muizen vertoonde een significant verhoogde expressie van het co-stimulerende ligand CD86. Gevaccineerde muizen vertoonden ook een toename van tumorinfiltrerende CD8-positieve en CD4-positieve, Foxp3-negatieve cellen, evenals in CD8-positieve granzyme B-positieve en interferon gamma-positieve CTL's.Houd voldoende afstand tussen de primaire tumor en het tumorvaccin. Deze fysieke scheiding is van cruciaal belang om mogelijke fusie tussen de twee tumorimplantaten te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model van de oorspronkelijke tumor Ontwikkeling en peritoneale metastase<em&gt; via</em&gt; Orthotope Inenting met ovariumcarcinoom Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Een melanoom patiënt-afgeleide xenograft model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...