Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Wir danken Dr. Stephen Schoenberger für die Bereitstellung von B16-Flt3L-Zellen und den Mitarbeitern der LJI-Tier- und Durchflusszytometrie-Einrichtungen für hervorragende Unterstützung.

Alle in der Studie verwendeten Mäuse wurden im Vivarium des La Jolla Institute for Immunology (LJI) unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit gepflegt und untergebracht. Tierversuche wurden mit 8-14 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen gemäß den vom LJI Animal Care Committee genehmigten Richtlinien und Protokollen durchgeführt.
1. Vorbereitung kultivierter Tumorzellen für die Implantation
<ol><li>Kultur von B16-F...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der Studie von Allisons Gruppe. Sie zeigten, dass die Kombination von B16-Flt3L-Impfstoff mit CTLA-4-Blockade einen synergistischen Effekt auf die Überlebensrate und das Tumorwachstum zeigte, während bei Mäusen, die den B16-Flt3L-Impfstoff oder die Anti-CTLA-4-Antikörperbehandlung allein erhielten, keine Verringerung des Tumorwachstums beobachtet wurde7. Neuere Studien haben einen neuartigen Treg-intrinsischen CTLA4-PKCη-Signalweg aufgedeckt, der ei...

Die Krebsimmuntherapie wurde aufgrund ihrer weniger toxischen Nebenwirkungen und dauerhafteren Reaktionen als vielversprechende therapeutische Strategie anerkannt. Es wurden verschiedene Arten von Immuntherapien entwickelt, darunter onkolytische Virustherapien, Krebsimpfstoffe, Zytokintherapien, monoklonale Antikörper, adoptiver Zelltransfer (CAR-T-Zellen oder CAR-NK) und Immun-Checkpoint-Blockade1.
Für Krebsimpfstoffe gibt es verschiedene Formen von therapeutischen Impfstoffen, wie Ganzzellimpfstoffe, Protein- oder Peptidimpfstoffe sowie RNA- oder DNA-Impfstoffe. Die Impfung beruht auf der Fähigkeit von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), Tumorantigene, einschließlich tumorspezifischer Antigene, zu verarbeiten und sie in immunogener Form T-Zellen zu präsentieren. Dendritische Zellen (DCs) sind bekanntermaßen die stärksten APCs und es wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle bei der Antitumorimmunität spielen 2,3. Diese Zellen nehmen Tumorantigene auf und verarbeiten sie und wandern dann zu den drainierenden Lymphknoten (dLN), um tumorspezifische T-Effektorzellen (Teff) durch Engagement des T-Zell-Rezeptors (TCR) und kostimulatorischer Moleküle vorzubereiten und zu aktivieren. Dies führt zu einer Differenzierung und Expansion von tumorspezifischen zytotoxischen T-Zellen (CTL), die den Tumor infiltrieren und Tumorzellen abtöten4. Folglich stellen Aktivierung und Reifung von DCs attraktive Strategien dar, um die Immunität gegen Tumorantigene zu stimulieren.
Es ist bekannt, dass Flt3L die Reifung und Expansion von funktionell reifen DCs fördert, die MHC-Proteine der Klassen II, CD11c, DEC205 und CD86 exprimieren5. Es wurde gezeigt, dass die intratumorale, aber nicht intravenöse Verabreichung eines Adenovirusvektors mit dem Flt3L-Gen (Adv-Flt3L) die immuntherapeutische Aktivität gegen orthrotope Tumoren fördert6. Flt3L wurde auch in Tumorzell-basierten Impfstoffen verwendet, die aus bestrahlten B16-F10-Zellen bestehen, die stabil retroviral transduziertes Flt3L exprimieren, um die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen durch DCs zu verbessern und somit die Antitumorreaktionen zu erhöhen. Das hier beschriebene Protokoll der B16-Flt3L-Tumorimpfung basiert auf einer Studie, die von Dr. James Allisons Gruppe7 veröffentlicht wurde. In dieser Arbeit berichteten sie, dass ein B16-Flt3L-Impfstoff in Kombination mit der CTLA-4-Blockade synergistisch die Abstoßung des etablierten Melanoms induzierte, was zu einem erhöhten Überleben führte.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein präklinisches Immuntherapiemodell für Melanome bereitzustellen. Hier werden detaillierte Verfahren zur Herstellung und Implantation von Tumorimpfstoffen sowie zur Analyse der Zusammensetzung und Funktion intratumoraler Immunzellen aus soliden Tumoren beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

Der Fms-ähnliche Tyrosinkinase-3-Ligand (Flt3L) ist ein hämatopoetisches Zytokin, das das Überleben und die Differenzierung von dendritischen Zellen (DCs) fördert. Es wurde in Tumorimpfstoffen verwendet, um die angeborene Immunität zu aktivieren und die Antitumorreaktionen zu verbessern. Dieses Protokoll zeigt ein therapeutisches Modell mit zellbasiertem Tumorimpfstoff, bestehend aus Flt3L-exprimierenden B16-F10-Melanomzellen sowie phänotypischer und funktioneller Analyse von Immunzellen in der Tumormikroumgebung (TME). Verfahren zur kultivierten Tumorzellpräparation, Tumorimplantation, Zellbestrahlung, Tumorgrößenmessung, intratumorale Immunzellisolierung und Durchflusszytometrieanalyse werden beschrieben. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein präklinisches solides Tumorimmuntherapiemodell und eine Forschungsplattform zur Untersuchung der Beziehung zwischen Tumorzellen und infiltrierenden Immunzellen bereitzustellen. Das hier beschriebene Immuntherapieprotokoll kann mit anderen therapeutischen Modalitäten wie Immun-Checkpoint-Blockade (Anti-CTLA-4, Anti-PD-1, Anti-PD-L1-Antikörper) oder Chemotherapie kombiniert werden, um die krebstherapeutische Wirkung des Melanoms zu verbessern.

Ein sichtbarer schwarzer Punkt der implantierten B16-F10-Zellen wird normalerweise ~3 Tage nach der Tumorimplantation auf der Hautoberfläche beobachtet. Mäuse werden 3, 6 und 9 Tage nach Erreichen einer Größe von ≥2 mm mit dem Tumorimpfstoff behandelt. Wir beobachteten eine signifikante Verringerung des Tumorwachstums in der Gruppe der geimpften Mäuse ~2 Wochen nach der Tumorimplantation (Abbildung 1). Am Ende des Experiments isolierten wir die intratumoralen Immunzellen und analysier...

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Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Das Protokoll stellt ein Krebsimmuntherapiemodell mit zellbasierter Tumorimpfung mit Flt3L-exprimierendem B16-F10-Melanom vor. Dieses Protokoll demonstriert die Verfahren, einschließlich der Vorbereitung kultivierter Tumorzellen, der Tumorimplantation, der Zellbestrahlung, der Messung des Tumorwachstums, der Isolierung intratumoraler Immunzellen und der Durchflusszytometrieanalyse.

Experimentelles Melanom-Immuntherapiemodell mit Tumorimpfung mit einem hämatopoetischen Zytokin

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Dieses Protokoll bietet ein klinisches solides Tumorimmuntherapiemodell und eine Forschungsplattform, um die Beziehung zwischen Tumorzellen und infiltrierenden Immunzellen zu untersuchen. Dieser zellbasierte Tumorimpfstoff ist praktisch, einfach zu verwenden und kann mit anderen therapeutischen Modalitäten wie Checkpoint-Blockade kombiniert werden, um einen additiven oder synergistischen Effekt zu erzielen, der zu einer stärkeren und höheren Tumorimmunität führen kann. Bei der Demonstration des Verfahrens wird Ann Balancio, eine Forschungstechnikerin aus meinem Labor, helfen.Um zu beginnen, kultivieren Sie B16-F10 Melanomzellen in IMDM, die 10% wärmeinaktives FBS, 2 Millimolar Glutamin, 1 Millimolar Natriumpyruvat, 1 Millimolar MEM nicht-essentielle Aminosäuren und jeweils 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und Streptomycin enthalten. Halten Sie die Zelllinie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Saat und Ernte der B16-F10-Zellen wie im Textmanuskript beschrieben.Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Kolben einmal mit PBS. PBS absaugen und 5 Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen, gefolgt von einem harten Klopfen auf den Rand des Kulturkolbens. Fügen Sie 15 Milliliter Kulturmedium hinzu, um das Trypsin-EDTA zu neutralisieren, und gießen Sie den Inhalt des Kolbens in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Waschen Sie die Schalenoberfläche mit 10 Milliliter PBS und gießen Sie sie in das gleiche 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten bei 200 RCF. Verwerfen Sie den Überstand und brechen Sie das Zellpellet, indem Sie mit dem Finger auf den Boden des Röhrchens klopfen.Fügen Sie kalte 10 Milliliter PBS hinzu und pipetten Sie die Zellsuspension vorsichtig. Dann zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämozytometer. Halten Sie die Zellen vor der Injektion auf Eis.Intradermal 500.000 Zellen B16-F10 Tumorzellen in 50 Mikroliter kaltes PBS in der linken Flanke mit einer 30-Gauge-Nadel implantieren. Die Dosis der implantierten B16-F10-Tumorzellen muss möglicherweise in einem Bereich von 50.000 bis 500.000 Zellen für eine erfolgreiche Tumorentwicklung angepasst werden. Nach der Implementierung messen Sie die Tumorlänge und -breite dreimal pro Woche mit einem elektronischen digitalen Messschieber.Berechnen Sie das Tumorvolumen und behandeln Sie die Mäuse mit Tumorimpfstoff, wenn Tumore eine Größe von zwei Millimetern erreicht haben, wie im Textmanuskript beschrieben. Mit einem Röntgenstrahler, der auf 160 Kilovolt und 25 Milliampere eingestellt ist, bestrahlen Sie Zellen mit 150 Graudosen Gammastrahlen. Zählen und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung vor der Injektion.Intradermal injizieren Sie den Mäusen 1 Million bestrahlte B16-Flt3L-Zellen in 50 Mikrolitern kaltem PBS auf derselben Flanke wie die ursprüngliche Tumorimplantation. Etwa einen Zentimeter von der Stelle des Primärtumors entfernt an den Tagen 3, 6 und 9 nach der ersten Zellimplantation. Markieren Sie die Impfstoffinjektionsstellen mit einem farbigen Stift, um sie vom Primärtumor zu unterscheiden.Wenn ursprünglich 50.000 B16-F10-Zellen implantiert wurden, wird empfohlen, eine Impfbehandlung an den Tagen 8, 11 und 14 durchzuführen. Entfernen Sie den Tumor chirurgisch mit der Haut von jeder eingeschläferten Maus und legen Sie ihn in eine 24-Well-Platte mit 1 Milliliter 10% FBS RPMI 1640 Medium. Schneiden Sie die Tumore in zwei Milliliter Verdauungspuffer in kleine Stücke und inkubieren Sie für 25 Minuten bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie 10 Milliliter 10% FBS RPMI 1640 Medium hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Die Zellen werden mit einer 25-Milliliter-serologischen Pipette in ein 40-Mikrometer-Zellsieb überführt. Verwenden Sie dann den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, um das Gewebe zu mahlen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 RCF für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 Milliliter 40% Dichte Gradient spezifisches Medium in PBS verdünnt auf 1x Konzentration. Fügen Sie die Zellsuspension langsam auf 5 Milliliter 80% Dichtegradienten-spezifisches Medium hinzu, das PBS enthält.Zentrifugieren Sie zu den Zellen bei 325 RCF mit niedriger Bremseinstellung für 23 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation die Leukozytenschicht an der Grenzfläche zwischen 40% und 80% Dichte gradientenspezifisches Medium vorsichtig sammeln und durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb leiten. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 RCF für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.Inkubieren Sie das Pellet in zwei Milliliter Lysepuffer der roten Blutkörperchen für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation 10 Milliliter 10% FBS RPMI 1640 Medium hinzufügen, um den RBC-Lysepuffer zu löschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 RCF für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.Resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Milliliter 10% FBS RPMI 1640 Medium und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen vor der weiteren Analyse. Sammeln Sie die Milz oder die drainierenden Lymphknoten als Kontrollen für die Gating-Strategie von Immunzelluntergruppen durch Durchflusszytometrie-Analyse. Folgen Sie der im Textmanuskript beschriebenen Methode der Zellisolierung.Ein sichtbarer schwarzer Punkt der implantierten B16-F10-Zellen wurde in der Regel etwa drei Tage nach der Tumorimplantation auf der Hautoberfläche beobachtet. Die Mäuse wurden drei, sechs und neun Tage nach dem Erreichen oder Überschreiten der Größe des Tumorknotens von zwei Millimetern mit einem Tumorimpfstoff behandelt. Eine signifikante Verringerung des Tumorwachstums wurde in der geimpften Mäusegruppe etwa zwei Wochen nach der Tumorimplantation beobachtet.Zellen, die aus der Leukozytenschicht gesammelt wurden, enthielten viele Tumorzellen, was es schwierig machte, die Lymphozytenpopulation ohne weiteres zu definieren. Daher wurden Splenozyten parallel verwendet, um intratumorale Immunzelluntergruppen in der Durchflusszytometrie zu kontrollieren. Die Gating-Strategien von CD103 positiv, CD11C positiv DC, CD8 positiv, CD4 positiv und Treg wurden zusammen mit der Kompensationsmatrix dargestellt.Repräsentative Daten der erworbenen Konten und der Häufigkeit jeder Bevölkerung wurden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Intratumorale CD103-positive, CD11C-positive DC von geimpften Mäusen zeigten eine signifikant erhöhte Expression des kostimulatorischen Liganden CD86. Geimpfte Mäuse zeigten auch einen Anstieg der tumorinfiltrierenden CD8-positiven und CD4-positiven, Foxp3-negativen Zellen sowie der CD8-positiven Granzym-B-positiven und Interferon-gamma-positiven CTLs.Halten Sie einen ausreichenden Abstand zwischen dem Primärtumor und dem Tumorimpfstoff. Diese physikalische Trennung ist entscheidend, um eine mögliche Fusion zwischen den beiden Tumorimplantaten zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung<em&gt; über</em&gt; Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Forschung

Krebsforschung

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...