Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
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Ringraziamo il Dr. Stephen Schoenberger per aver fornito cellule B16-Flt3L e il personale delle strutture di citometria animale e a flusso LJI per l'eccellente supporto.

Tutti i topi utilizzati nello studio sono stati mantenuti e ospitati nel vivaio dell'Istituto di immunologia La Jolla (LJI) in specifiche condizioni prive di agenti patogeni con temperatura e umidità controllate. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con topi femmina C57BL / 6 di 8-14 settimane secondo le linee guida e i protocolli approvati dal LJI Animal Care Committee.
1. Preparazione di cellule tumorali in coltura per l'impianto
<ol><li>Cellule di melanoma B...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

Il protocollo qui descritto si basa sullo studio del gruppo di Allison. Hanno dimostrato che la combinazione del vaccino B16-Flt3L con il blocco CTLA-4 ha mostrato un effetto sinergico sul tasso di sopravvivenza e sulla crescita del tumore, mentre nessuna riduzione della crescita tumorale è stata osservata nei topi che hanno ricevuto il vaccino B16-Flt3L o il trattamento con anticorpi anti-CTLA-4 da solo7. Studi recenti hanno rivelato una nuova via di segnalazione CTLA4-PKCη intrinseca Treg-intr...

L'immunoterapia del cancro è stata riconosciuta come una strategia terapeutica promettente basata sui suoi effetti collaterali meno tossici e risposte più durature. Sono stati sviluppati diversi tipi di immunoterapie, tra cui terapie con virus oncolitici, vaccini contro il cancro, terapie con citochine, anticorpi monoclonali, trasferimento cellulare adottivo (cellule CAR-T o CAR-NK) e blocco del checkpoint immunitario1.
Per i vaccini contro il cancro, ci sono diverse forme di vaccini terapeutici, come vaccini a base di cellule intere, vaccini proteici o peptidici e vaccini a RNA o DNA. La vaccinazione si basa sulla capacità delle cellule presentanti l'antigene (APC) di elaborare gli antigeni tumorali, compresi gli antigeni tumorali specifici, e presentarli in forma immunogenica alle cellule T. Le cellule dendritiche (DC) sono note per essere le APC più potenti e si ritiene che svolgano un ruolo importante nell'immunità antitumorale 2,3. Queste cellule assorbono ed elaborano gli antigeni tumorali e quindi migrano verso i linfonodi drenanti (dLN) per innescare e attivare le cellule effettrici T tumore-specifiche (Teff) attraverso l'impegno del recettore delle cellule T (TCR) e delle molecole costimolatorie. Ciò si traduce nella differenziazione e nell'espansione delle cellule T citotossiche tumore-specifiche (CTL), che si infiltrano nel tumore e uccidono le cellule tumorali4. Di conseguenza, l'attivazione e la maturazione delle DC rappresentano strategie interessanti per stimolare l'immunità contro gli antigeni tumorali.
Flt3L è noto per promuovere la maturazione e l'espansione di DC funzionalmente mature che esprimono le proteine MHC di classe II, CD11c, DEC205 e CD865. La somministrazione intratumorale, ma non endovenosa, di un vettore adenovirus che incorpora il gene Flt3L (Adv-Flt3L) ha dimostrato di promuovere l'attività terapeutica immunitaria contro i tumori ortotopici6. Flt3L è stato utilizzato anche in vaccini basati su cellule tumorali costituiti da cellule B16-F10 irradiate che esprimono stabilmente Flt3L trasdotta in modo retroviralmente come un modo per migliorare la presentazione incrociata degli antigeni tumorali da parte delle DC e, quindi, aumentare le risposte antitumorali. Il protocollo di vaccinazione antitumorale B16-Flt3L qui descritto si basa su uno studio pubblicato dal gruppo7 del Dr. James Allison. In questo articolo, hanno riferito che un vaccino B16-Flt3L combinato con il blocco CTLA-4 ha indotto sinergicamente il rigetto del melanoma stabilito, con conseguente aumento della sopravvivenza.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un modello di immunoterapia preclinica per il melanoma. Qui vengono descritte procedure dettagliate su come preparare e impiantare vaccini tumorali e come analizzare la composizione e la funzione delle cellule immunitarie intratumorali dal tumore solido.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

Il ligando tirosin-chinas-simile 3 (Flt3L) è una citochina ematopoietica che promuove la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule dendritiche (DC). È stato utilizzato nei vaccini tumorali per attivare l'immunità innata e migliorare le risposte antitumorali. Questo protocollo dimostra un modello terapeutico che utilizza un vaccino tumorale basato su cellule costituito da cellule di melanoma B16-F10 che esprimono Flt3L insieme all'analisi fenotipica e funzionale delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale (TME). Vengono descritte le procedure per la preparazione delle cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione delle dimensioni del tumore, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un modello preclinico di immunoterapia dei tumori solidi e una piattaforma di ricerca per studiare la relazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie infiltranti. Il protocollo di immunoterapia qui descritto può essere combinato con altre modalità terapeutiche, come il blocco del checkpoint immunitario (anticorpi anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) o la chemioterapia al fine di migliorare l'effetto terapeutico del melanoma sul cancro.

Un punto nero visibile delle cellule B16-F10 impiantate viene solitamente osservato sulla superficie della pelle ~ 3 giorni dopo l'impianto del tumore. I topi vengono trattati con il vaccino tumorale 3, 6 e 9 giorni dopo che il nodulo tumorale ha raggiunto una dimensione di ≥2 mm. Abbiamo osservato una significativa riduzione della crescita tumorale nel gruppo di topi vaccinati ~ 2 settimane dopo l'impianto del tumore (Figura 1). Alla fine dell'esperimento, abbiamo isolato le cellule immun...

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Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Il protocollo presenta un modello di immunoterapia del cancro che utilizza la vaccinazione tumorale basata su cellule con melanoma B16-F10 che esprime Flt3L. Questo protocollo dimostra le procedure, compresa la preparazione di cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione della crescita tumorale, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso.

Modello sperimentale di immunoterapia del melanoma utilizzando la vaccinazione tumorale con una citochina ematopoietica

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Questo protocollo fornisce un modello clinico di immunoterapia dei tumori solidi e una piattaforma di ricerca per studiare la relazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie infiltranti. Questo vaccino tumorale a base cellulare è conveniente, semplice da usare e può essere combinato con altre modalità terapeutiche come il blocco del checkpoint, per ottenere un effetto additivo o sinergico che può comportare un'immunità tumorale più potente e elevata. Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Ann Balancio, un tecnico di ricerca del mio laboratorio.Per iniziare, colture di cellule di melanoma B16-F10 in IMDM, contenenti il 10% di FBS inattivo dal calore, 2 glutammina millimolare, 1 piruvato di sodio millimolare, 1 amminoacidi non essenziali MEM millimolari e 100 unità per millilitro ciascuna di penicillina e streptomicina. Mantenere la linea cellulare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Seminare e raccogliere le cellule B16-F10 come descritto nel manoscritto testuale.Rimuovere il terreno di coltura e lavare i palloni una volta con PBS. Aspirare PBS e aggiungere 5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25%, quindi picchiettare bruscamente sul bordo del pallone di coltura. Aggiungere 15 millilitri di terreno di coltura per neutralizzare la tripsina-EDTA e versare il contenuto del matraccio in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.Lavare la superficie del piatto con 10 millilitri di PBS e versare nello stesso tubo da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare le celle per 5 minuti a 200 RCF. Scartare il surnatante e rompere il pellet cellulare toccando con le dita il fondo del tubo.Aggiungere 10 millilitri freddi di PBS e pipettare delicatamente la sospensione cellulare. Quindi, contare manualmente le cellule utilizzando un emocitometro. Tenere le cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione.Impiantare per via intradermica 500.000 cellule tumorali B16-F10 in 50 microlitri di PBS freddo nel fianco sinistro, utilizzando un ago di calibro 30. Potrebbe essere necessario regolare la dose di cellule tumorali B16-F10 impiantate in un intervallo da 50.000 a 500.000 cellule per uno sviluppo tumorale di successo. Dopo l'implementazione, misurare la lunghezza e la larghezza del tumore tre volte alla settimana utilizzando un calibro digitale elettronico.Calcolare il volume del tumore e trattare i topi con il vaccino tumorale quando i tumori hanno raggiunto una dimensione di due millimetri come descritto nel manoscritto del testo. Utilizzando un irradiatore a raggi X impostato a 160 kilovolt e 25 milliampere, irradiare le cellule a 150 dosi grigie di raggi gamma. Contare e controllare la vitalità cellulare mediante colorazione blu tripano prima dell'iniezione.Iniettare per via intradermica i topi con 1 milione di cellule B16-Flt3L irradiate in 50 microlitri di PBS freddo sullo stesso fianco dell'impianto tumorale originale. Circa un centimetro dal sito del tumore primario nei giorni 3, 6 e 9 dopo l'impianto iniziale della cellula. Contrassegnare i siti di iniezione del vaccino con una penna colorata per distinguerli dal tumore primario.Se inizialmente sono state impiantate 50.000 cellule B16-F10, si raccomanda di eseguire il trattamento vaccinale nei giorni 8, 11 e 14. Rimosso chirurgicamente il tumore con la pelle da ciascun topo eutanasia e metterlo in una piastra a 24 pozzetti con 1 millilitro di 10% FBS RPMI 1640 mezzo. Tagliare i tumori in piccoli pezzi in due millilitri di tampone di digestione e incubare per 25 minuti a 37 gradi Celsius.Aggiungere 10 millilitri di 10% FBS RPMI 1640 mezzo per interrompere la digestione. Trasferire le cellule su un filtro cellulare da 40 micrometri utilizzando una pipetta sierologica da 25 millilitri. Quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da un millilitro per macinare i tessuti.Centrifugare le celle a 500 RCF per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Risospendere il pellet in 5 millilitri di mezzo specifico con gradiente di densità del 40% in PBS diluito a concentrazione 1x. Aggiungere lentamente la sospensione cellulare sopra 5 millilitri di mezzo specifico con gradiente di densità dell'80% contenente PBS.Centrifugare alle celle a 325 RCF con una regolazione del freno bassa per 23 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura lo strato di leucociti all'interfaccia tra il 40% e l'80% del mezzo specifico del gradiente di densità e farlo passare attraverso un filtro cellulare di 40 micrometri. Centrifugare le celle a 500 RCF per 5 minuti a 4 gradi Celsius.Incubare il pellet in due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di 10% FBS RPMI 1640 mezzo per estinguere il tampone di lisi RBC. Centrifugare le celle a 400 RCF per 5 minuti a 4 gradi Celsius.Risospendere le celle in 0,5 millilitri di 10% FBS RPMI 1640 terreno e contare il numero totale di celle prima dell'uso per ulteriori analisi. Raccogliere la milza o i linfonodi drenanti come controlli per la strategia di gating dei sottogruppi di cellule immunitarie mediante analisi citometrica a flusso. Seguire il metodo di isolamento cellulare descritto nel manoscritto testuale.Un punto nero visibile delle cellule B16-F10 impiantate è stato solitamente osservato sulla superficie della pelle circa tre giorni dopo l'impianto del tumore. I topi sono stati trattati con un vaccino tumorale tre, sei e nove giorni dopo che il nodulo tumorale aveva raggiunto o superato le dimensioni di due millimetri. Una significativa riduzione della crescita tumorale è stata osservata nel gruppo di topi vaccinati circa due settimane dopo l'impianto del tumore.Le cellule raccolte dallo strato di leucociti contenevano molte cellule tumorali, rendendo difficile definire facilmente la popolazione di linfociti. Pertanto, gli splenociti sono stati utilizzati in parallelo, per il corretto gating dei sottogruppi di cellule immunitarie intratumorali nell'analisi della citometria a flusso. Le strategie di gating di CD103 positivo, CD11C positivo DC, CD8 positivo, CD4 positivo e Treg sono state tracciate insieme alla matrice di compensazione.Sono stati inoltre forniti dati rappresentativi dei conti acquisiti e della frequenza di ciascuna popolazione. La DC CD103 positiva intratumorale e CD11C positiva da topi vaccinati ha mostrato un'espressione significativamente elevata del ligando co-stimolante CD86. I topi vaccinati hanno anche mostrato un aumento delle cellule CD8 positive e CD4 positive infiltranti il tumore, Foxp3 negative, nonché nei CTL CD8 positivi al granzima B positivo e all'interferone gamma.Mantenere una distanza sufficiente tra il tumore primario e il vaccino tumorale. Questa separazione fisica è fondamentale per evitare la potenziale fusione tra i due impianti tumorali.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Modello murino sperimentale di sviluppo del tumore originale e peritoneale Metastasi<em&gt; via</em&gt; Ortotopico inoculazione con cellule dell&#39;ovaio Carcinoma

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Un modello di pelle sferoide 3D Organotypic Melanoma

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Un modello di Xenotrapianto a parte del paziente di melanoma

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...