Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
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B16-Flt3L細胞を提供してくださったStephen Schoenberger博士と、LJI動物およびフローサイトメトリー施設のスタッフに素晴らしいサポートを提供してくださったことに感謝します。

研究で使用されたすべてのマウスは、温度と湿度が制御された特定の病原体のない条件下で、ラホーヤ免疫学研究所(LJI)のビバリウムに維持および収容されました。動物実験は、LJI動物管理委員会によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って、8〜14週齢の雌C57BL / 6マウスで実施されました。
1. 移植用培養腫瘍細胞の調製
<ol><li>B16-F10メラノーマ細?...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、アリソンのグループによる研究に基づいています。その結果、B16-Flt3LワクチンとCTLA-4遮断の組み合わせは生存率と腫瘍増殖に相乗効果を示したが、B16-Flt3Lワクチンまたは抗CTLA-4抗体治療のみを受けたマウスでは腫瘍増殖の減少は見られなかったことが示された7。最近の研究では、Treg11の接触依存的な抑制活性の調節に重要な...

がん免疫療法は、毒性の低い副作用とより耐久性のある反応に基づいて、有望な治療戦略として認識されています。腫瘍溶解性ウイルス療法、癌ワクチン、サイトカイン療法、モノクローナル抗体、養子細胞移植(CAR-T細胞またはCAR-NK)、免疫チェックポイント遮断など、いくつかのタイプの免疫療法が開発されています1。
がんワクチンの場合、全細胞ベースのワクチン、タンパク質またはペプチドワクチン、RNAまたはDNAワクチンなど、さまざまな形態の治療用ワクチンがあります。ワクチン接種は、抗原提示細胞(APC)が腫瘍特異的抗原を含む腫瘍抗原を処理し、それらを免疫原性の形でT細胞に提示する能力に依存しています。樹状細胞(DC)は最も強力なAPCであることが知られており、抗腫瘍免疫に重要な役割を果たすと考えられています2,3。これらの細胞は腫瘍抗原を取り込んで処理した後、ドレナージュリンパ節(dLN)に移動して、T細胞受容体(TCR)と共刺激分子の関与を介して腫瘍特異的Tエフェクター(Teff)細胞をプライミングおよび活性化します。これにより、腫瘍特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)が分化および増殖し、腫瘍に浸潤して腫瘍細胞を死滅させます4。したがって、DCの活性化と成熟は、腫瘍抗原に対する免疫を刺激するための魅力的な戦略を表しています。
Flt3Lは、MHCクラスII、CD11c、DEC205、およびCD86タンパク質を発現する機能的に成熟したDCの成熟と拡大を促進することが知られています5。静脈内ではなく腫瘍内、 Flt3L 遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター(Adv-Flt3L)の投与は、オルトピー腫瘍に対する免疫治療活性を促進することが示されている6。Flt3Lは、DCによる腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションを増強し、抗腫瘍応答を増加させる方法として、レトロウイルス形質導入Flt3Lを安定的に発現する照射B16-F10細胞からなる腫瘍細胞ベースのワクチンにも使用されています。ここで説明するB16-Flt3L腫瘍ワクチン接種のプロトコルは、ジェームズ・アリソン博士のグループ7によって発表された研究に基づいています。この論文では、CTLA-4遮断と組み合わせたB16-Flt3Lワクチンが相乗的に確立された黒色腫の拒絶反応を誘発し、生存期間が延びることを報告しました。
このプロトコルの目標は、黒色腫の前臨床免疫療法モデルを提供することです。ここでは、腫瘍ワクチンの調製方法や移植方法、固形腫瘍由来の腫瘍内免疫細胞の組成や機能を解析する方法の詳細な手順について説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

Fms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)は、樹状細胞(DC)の生存および分化を促進する造血サイトカインである。自然免疫を活性化し、抗腫瘍反応を高めるために腫瘍ワクチンに使用されています。このプロトコルは、Flt3L発現B16-F10メラノーマ細胞からなる細胞ベースの腫瘍ワクチンを使用した治療モデルと、腫瘍微小環境(TME)における免疫細胞の表現型および機能分析を示しています。培養腫瘍細胞の調製、腫瘍移植、細胞照射、腫瘍サイズ測定、腫瘍内免疫細胞単離、およびフローサイトメトリー分析の手順について説明します。このプロトコルの全体的な目標は、前臨床固形腫瘍免疫療法モデルと、腫瘍細胞と浸潤免疫細胞との関係を研究するための研究プラットフォームを提供することです。ここで説明する免疫療法プロトコルは、黒色腫の癌治療効果を改善するために、免疫チェックポイント遮断(抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1抗体)または化学療法などの他の治療法と組み合わせることができます。

移植されたB16-F10細胞の目に見える黒い点は、通常、腫瘍移植後~3日後に皮膚表面に観察されます。マウスは、腫瘍結節が≥2mmのサイズに達してから3、6、および9日後に腫瘍ワクチンで治療されます。ワクチン接種マウス群~腫瘍移植後2週間で腫瘍増殖の有意な減少が観察されました(図1)。実験の最後に、腫瘍内免疫細胞を単離し、それらの数と細胞表面マーカー発現、?...

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Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

このプロトコルは、Flt3L発現B16-F10黒色腫を伴う細胞ベースの腫瘍ワクチン接種を使用した癌免疫療法モデルを提示します。このプロトコルは、培養腫瘍細胞の調製、腫瘍移植、細胞照射、腫瘍増殖の測定、腫瘍内免疫細胞の分離、フローサイトメトリー分析などの手順を示しています。

造血サイトカインによる腫瘍ワクチン接種を用いた実験的黒色腫免疫療法モデル

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

このプロトコルは、臨床固形腫瘍免疫療法モデルと、腫瘍細胞と浸潤免疫細胞との関係を研究するための研究プラットフォームを提供します。この細胞ベースの腫瘍ワクチンは、便利で使いやすく、チェックポイント遮断などの他の治療法と組み合わせて、より強力で高い腫瘍免疫をもたらすことができる相加的または相乗的な効果を達成することができます。手順のデモンストレーションを手伝うのは、私の研究室の研究技術者であるアン・バランシオです。まず、B16-F10メラノーマ細胞をIMDMで培養し、10%熱不活性FBS、2ミリモルグルタミン、1ミリモルピルビン酸ナトリウム、1ミリモルMEM非必須アミノ酸、およびペニシリンとストレプトマイシンのそれぞれ1ミリリットルあたり100単位を含みます。細胞株を5%二酸化炭素で摂氏37度に維持します。B16-F10細胞を、本文に記載されているように播種して収穫します。培養液を取り出し、フラスコをPBSで1回洗浄します。PBSを吸引し、5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAを加え、続いて培養フラスコの縁を強くたたきます。15ミリリットルの培養液を加えてトリプシン-EDTAを中和し、フラスコの内容物を50ミリリットルの遠沈管に注ぎます。皿の表面を10ミリリットルのPBSで洗い、同じ50ミリリットルの遠沈管に注ぎます。細胞を200 RCFで5分間遠心分離します。上清を捨て、チューブの底を指で軽くたたくことで細胞ペレットを壊します。冷たい10ミリリットルのPBSを加え、細胞懸濁液を静かにピペットで固めます。次に、血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。注射前に細胞を氷上に保管してください。30ゲージ針を用いて、左脇腹の50マイクロリットルの冷たいPBSに500,000個の細胞B16-F10腫瘍細胞を皮内移植した。移植されたB16-F10腫瘍細胞の用量は、腫瘍発生を成功させるために50, 000〜500, 000細胞の範囲で調整する必要があるかもしれません。実施後、電子デジタルキャリパーを使用して週に3回腫瘍の長さと幅を測定します。腫瘍体積を計算し、テキスト原稿に記載されているように腫瘍が2ミリメートルのサイズに達したときに腫瘍ワクチンでマウスを治療します。160キロボルト、25ミリアンペアに設定したX線照射器を用いて、150グレイ線量のガンマ線を細胞に照射する。注射前にトリパンブルー染色により細胞生存率をカウントして確認する。100万個の照射B16-Flt3L細胞を50マイクロリットルの冷たいPBSにマウスに皮内注射し、元の腫瘍移植と同じ脇腹に注入します。最初の細胞移植後3、6、および9日目の原発腫瘍の部位から約1センチメートル。ワクチン注射部位を色付きのペンでマークして、原発腫瘍と区別します。50, 000個のB16-F10細胞が最初に移植された場合、8、11、14日目にワクチン治療を行うことが推奨されます。各安楽死マウスから皮膚を有する腫瘍を外科的に除去し、それを1ミリリットルの10%FBS RPMI 1640培地を含む24ウェルプレートに入れた。腫瘍を2ミリリットルの消化バッファーで細かく切り、摂氏37度で25分間インキュベートします。10ミリリットルの10%FBS RPMI 1640培地を加えて消化を停止します。25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、細胞を40マイクロメートルのセルストレーナーに移します。次に、1ミリリットルの注射器のプランジャーを使用して組織を粉砕します。細胞を500 RCFで摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを1倍濃度に希釈したPBS中の5ミリリットルの40%濃度勾配特異的培地に再懸濁します。PBSを含む5ミリリットルの80%密度勾配特異的培地の上に細胞懸濁液をゆっくりと加えます。室温で23分間、低ブレーキ設定で325 RCFでセルに遠心分離します。遠心分離後、40%と80%の密度勾配特異的培地の間の界面にある白血球層を注意深く収集し、40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。細胞を500 RCFで摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを2ミリリットルの赤血球溶解バッファー中で室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、10ミリリットルの10%FBS RPMI 1640培地を加えて、RBC溶解バッファーをクエンチします。細胞を400 RCFで摂氏4度で5分間遠心分離します。細胞を0.5ミリリットルの10%FBS RPMI 1640培地に再懸濁し、さらなる分析のために使用前に細胞の総数を数えます。フローサイトメトリー分析による免疫細胞サブセットのゲーティング戦略のコントロールとして、脾臓または排液リンパ節を収集します。本文に記載されている細胞単離方法に従ってください。移植されたB16-F10細胞の目に見える黒い点は、通常、腫瘍移植の約3日後に皮膚表面に観察されました。マウスは、腫瘍結節が2ミリメートルのサイズに達するか超えてから3、6、および9日後に腫瘍ワクチンで治療されました。腫瘍移植後約2週間でワクチン接種マウス群において有意な腫瘍増殖減少が観察された。白血球層から採取した細胞は腫瘍細胞を多く含んでいるため、リンパ球集団を容易に定義することは困難であった。したがって、フローサイトメトリー分析における腫瘍内免疫細胞サブセットの適切なゲーティングのために、脾細胞を並行して使用しました。CD103陽性、CD11C陽性DC、CD8陽性、CD4陽性、およびTregのゲーティング戦略を補償マトリックスとともにプロットしました。取得したアカウントの代表的なデータと各母集団の頻度も提供されました。ワクチン接種マウスからの腫瘍内CD103陽性、CD11C陽性DCは、共刺激性リガンドCD86の有意に上昇した発現を示した。ワクチン接種マウスはまた、CD8陽性およびCD4陽性、Foxp3陰性細胞、ならびにCD8陽性グランザイムB陽性およびインターフェロンガンマ陽性CTLにおける腫瘍浸潤の増加を示した。原発腫瘍と腫瘍ワクチンとの間に十分な距離を保ってください。この物理的分離は、2つの腫瘍インプラント間の潜在的な融合を回避するために重要です。

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B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

黒色腫患者由来異種移植片モデル

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3D腫瘍球状モデル

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...