Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
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B16-Flt3L 세포를 제공한 Stephen Schoenberger 박사와 LJI 동물 및 유세포분석 시설의 직원들에게 탁월한 지원을 해주셔서 감사합니다.

연구에 사용 된 모든 마우스는 온도와 습도가 제어 된 특정 병원체가없는 조건에서 La Jolla Institute for Immunology (LJI)의 동물 사육장에 보관 및 보관되었습니다. 동물 실험은 LJI 동물 관리 위원회에서 승인한 지침 및 프로토콜에 따라 8-14주령 암컷 C57BL/6 마우스로 수행되었습니다.
1. 이식용 배양된 종양세포의 제조
<ol><li>10% 열 불활성화 FBS, 2mM 글루타민, 1mM 나트륨 ?...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜은 Allison 그룹의 연구를 기반으로 합니다. 그들은 B16-Flt3L 백신과 CTLA-4 차단의 조합이 생존율과 종양 성장에 시너지 효과를 보인 반면, B16-Flt3L 백신 또는 항 CTLA-4 항체 단독 치료를받은 마우스에서는 종양 성장의 감소가 보이지 않았 음을 입증했다7. 최근 연구에 따르면 Treg11의 접촉 의존적 억제 활성을 조절하는 데 중요한 필수 역할을하?...

암 면역 요법은 독성이 적은 부작용과 더 지속적인 반응을 기반으로 유망한 치료 전략으로 인식되어 왔습니다. 종양 용해 바이러스 요법, 암 백신, 사이토 카인 요법, 단일 클론 항체, 입양 세포 전달 (CAR-T 세포 또는 CAR-NK) 및 면역 체크 포인트 차단1을 포함하는 여러 유형의 면역 요법이 개발되었습니다.
암 백신의 경우 전체 세포 기반 백신, 단백질 또는 펩타이드 백신, RNA 또는 DNA 백신과 같은 다양한 형태의 치료 백신이 있습니다. 백신 접종은 종양 특이 항원을 포함한 종양 항원을 처리하고 T 세포에 면역 원성 형태로 제시하는 항원 제시 세포 (APC)의 능력에 의존합니다. 수지상 세포(DC)는 가장 강력한 APC로 알려져 있으며 항종양 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 믿어집니다 2,3. 이 세포는 종양 항원을 흡수하고 처리 한 다음 배수 림프절 (dLN)으로 이동하여 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동 자극 분자의 결합을 통해 종양 특이 적 T 이펙터 (Teff) 세포를 프라이밍하고 활성화합니다. 그 결과 종양 특이적 세포독성 T 세포(CTL)의 분화 및 확장이 일어나 종양에 침투하여종양 세포를 사멸시킵니다4. 결과적으로, DC의 활성화 및 성숙은 종양 항원에 대한 면역을 자극하는 매력적인 전략을 나타낸다.
Flt3L은 MHC 클래스 II, CD11c, DEC205 및 CD86 단백질5를 발현하는 기능적으로 성숙한 DC의 성숙 및 확장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. Flt3L 유전자(Adv-Flt3L)를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 정맥내 투여는 오르토픽 종양에 대한 면역 치료 활성을 촉진하는 것으로나타났습니다6. Flt3L은 또한 DC에 의한 종양 항원의 교차 제시를 향상시켜 항종양 반응을 증가시키는 방법으로 후방바이러스 형질도입된 Flt3L을 안정적으로 발현하는 방사선 조사된 B16-F10 세포로 구성된 종양 세포 기반 백신에 사용되었습니다. 여기에 설명된 B16-Flt3L 종양 백신 접종 프로토콜은 James Allison 박사의 그룹7에서 발표한 연구를 기반으로 합니다. 이 논문에서 그들은 CTLA-3 차단과 결합 된 B4-Flt4L 백신이 상승적으로 확립 된 흑색 종의 거부를 유도하여 생존율을 증가 시킨다고보고했습니다.
이 프로토콜의 목표는 흑색종에 대한 전임상 면역요법 모델을 제공하는 것입니다. 여기에서는 종양 백신을 제조하고 이식하는 방법과 고형 종양으로부터 종양 내 면역 세포의 구성과 기능을 분석하는 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

Fms 유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L)는 수지상 세포 (DCs)의 생존 및 분화를 촉진하는 조혈 사이토 카인이다. 선천성 면역을 활성화하고 항 종양 반응을 향상시키기 위해 종양 백신에 사용되었습니다. 이 프로토콜은 종양 미세 환경 (TME)에서 면역 세포의 표현형 및 기능 분석과 함께 Flt3L 발현 B16-F10 흑색 종 세포로 구성된 세포 기반 종양 백신을 사용하는 치료 모델을 보여줍니다. 배양된 종양 세포 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 크기 측정, 종양내 면역 세포 단리, 및 유세포분석을 위한 절차가 기재되어 있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 전임상 고형 종양 면역 요법 모델과 종양 세포와 침윤 면역 세포 간의 관계를 연구하기위한 연구 플랫폼을 제공하는 것입니다. 여기에 기술된 면역요법 프로토콜은 흑색종의 암 치료 효과를 개선하기 위해 면역 체크포인트 차단 (항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1 항체) 또는 화학요법과 같은 다른 치료 양식과 조합될 수 있다.

이식된 B16-F10 세포의 눈에 보이는 검은 점은 일반적으로 종양 이식 후 ~3일 후에 피부 표면에서 관찰됩니다. 마우스는 종양 결절이 ≥2 mm의 크기에 도달한 후 3, 6, 및 9일 후에 종양 백신으로 치료된다. 우리는 종양 이식 후 ~ 2 주 후에 백신 접종 된 마우스 그룹에서 종양 성장의 현저한 감소를 관찰했습니다 (그림 1). 실험이 끝나면 종양 내 면역 세포를 분리하고 상기와 같이 ?...

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Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.

조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

이 프로토콜은 종양 세포와 침윤 면역 세포 사이의 관계를 연구하기 위한 임상 고형 종양 면역요법 모델 및 연구 플랫폼을 제공합니다. 이 세포 기반 종양 백신은 편리하고 사용하기 쉬우며 체크포인트 차단과 같은 다른 치료 방식과 결합하여 더 강력하고 높은 종양 면역을 초래할 수 있는 추가 또는 시너지 효과를 달성할 수 있습니다. 절차를 시연하는 데 도움이되는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Ann Balancio입니다.시작하려면 10 % 열 비활성 FBS, 2 밀리몰 글루타민, 1 밀리몰 나트륨 피루 베이트, 1 밀리몰 MEM 비 필수 아미노산 및 페니실린과 스트렙토 마이신의 밀리리터 당 100 단위를 포함하는 IMDM에서 B16-F10 흑색 종 세포를 배양하십시오. 세포주를 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 유지하십시오. B16-F10 세포를 시드하고 텍스트 원고에 설명 된대로 수확합니다.배양액을 제거하고 PBS로 플라스크를 1회 세척한다. PBS를 흡인하고 0.25% 트립신-EDTA 5밀리리터를 추가한 다음 배양 플라스크의 가장자리를 거칠게 두드립니다. 15 밀리리터의 배양 배지를 추가하여 트립신 -EDTA를 중화시키고 플라스크의 내용물을 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 붓습니다.10 밀리리터의 PBS로 접시 표면을 씻고 동일한 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 붓습니다. 세포를 200 RCF에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 튜브 바닥을 손가락으로 두드려 세포 펠릿을 깨뜨립니다.차가운 PBS 10 밀리리터를 넣고 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 수동으로 계산합니다. 주사하기 전에 세포를 얼음 위에 두십시오.30 게이지 바늘을 사용하여 왼쪽 옆구리에 50 마이크로리터의 차가운 PBS에 500, 000 세포 B16-F10 종양 세포를 피내 이식한다. 이식 된 B16-F10 종양 세포의 투여 량은 성공적인 종양 발달을 위해 50, 000에서 500, 000 세포의 범위에서 조정되어야 할 수도 있습니다. 시행 후 전자 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 세 번 종양 길이와 너비를 측정합니다.종양 부피를 계산하고 종양이 텍스트 원고에 설명 된대로 2 밀리미터의 크기에 도달하면 종양 백신으로 마우스를 치료하십시오. 160킬로볼트 및 25밀리암페어로 설정된 X선 조사기를 사용하여 150회분의 감마선으로 세포를 조사합니다. 주사 전에 트리판 블루 염색에 의해 세포 생존율을 계수하고 확인하였다.원래 종양 이식과 동일한 측면에 50마이크로리터의 차가운 PBS에 100만 개의 조사된 B16-Flt3L 세포를 마우스에 피내 주사합니다. 초기 세포 이식 후 3, 6, 9 일에 원발 종양 부위에서 약 1 센티미터. 백신 주사 부위를 컬러 펜으로 표시하여 원발 종양과 구별하십시오.50, 000 개의 B16-F10 세포를 처음 이식 한 경우 8, 11 및 14 일에 백신 치료를 수행하는 것이 좋습니다. 안락사된 각 마우스에서 피부와 함께 종양을 외과적으로 제거하고 10% FBS RPMI 1640 배지 1 밀리리터가 있는 24웰 플레이트에 넣었다. 2 밀리리터의 소화 완충액에서 종양을 작은 조각으로 자르고 섭씨 37도에서 25 분 동안 배양하십시오.소화를 멈추기 위해 10% FBS RPMI 1640 배지 10ml를 추가합니다. 25 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 세포를 40 마이크로 미터 세포 여과기로 옮깁니다. 그런 다음 1 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 연마하십시오.셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 500RCF로 원심분리합니다. 1x 농도로 희석된 PBS의 40% 밀도 구배 특이적 배지 5ml에 펠릿을 재현탁합니다. PBS를 함유하는 80% 밀도 구배 특이적 배지 5밀리리터 위에 세포 현탁액을 천천히 첨가한다.실온에서 23분 동안 낮은 브레이크 설정으로 325 RCF에서 셀을 원심분리합니다. 원심분리 후 40%와 80% 밀도 구배 특정 배지 사이의 계면에서 백혈구 층을 조심스럽게 수집하고 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통과시킵니다. 셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 500RCF로 원심분리합니다.펠렛을 2 밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 배양 후 10% FBS RPMI 1640 배지 10밀리리터를 추가하여 적혈구 용해 완충액을 퀀칭합니다. 셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 400RCF로 원심분리합니다.세포를 0.5 밀리리터의 10%FBS RPMI 1640 배지에 재현탁시키고, 추가 분석을 위해 사용하기 전에 총 세포 수를 계수한다. 비장 또는 배수 림프절을 유세포 분석에 의한 면역 세포 하위세트의 게이팅 전략을 위한 대조군으로서 수집한다. 텍스트 원고에 설명 된 세포 분리 방법을 따르십시오.이식된 B16-F10 세포의 가시적인 검은 점은 일반적으로 종양 이식 후 약 3일 후에 피부 표면에서 관찰되었다. 마우스는 종양 결절이 2 밀리미터의 크기에 도달하거나 초과한 후 3, 6 및 9일 후에 종양 백신으로 처리되었다. 종양 이식 약 2주 후에 백신을 접종한 마우스 그룹에서 유의한 종양 성장 감소가 관찰되었다.백혈구 층에서 채취한 세포에는 많은 종양 세포가 포함되어 있어 림프구 집단을 쉽게 정의하기 어려웠습니다. 따라서, 비장 세포는 유세포 분석 분석에서 종양 내 면역 세포 서브 세트의 적절한 게이팅을 위해 병행하여 사용되었다. CD103 양성, CD11C 양성 DC, CD8 양성, CD4 양성 및 Treg의 게이팅 전략을 보상 매트릭스와 함께 플롯했습니다.획득 한 계정의 대표 데이터와 각 모집단의 빈도도 제공되었습니다. 종양내 CD103 양성, 백신접종된 마우스로부터의 CD11C 양성 DC는 공동자극 리간드 CD86의 유의하게 상승된 발현을 나타내었다. 백신 접종 마우스는 또한 CD8 양성 및 CD4 양성, Foxp3 음성 세포뿐만 아니라 CD8 양성 그랜자임 B 양성 및 인터페론 감마 양성 CTL에서 종양 침윤의 증가를 보였다.원발성 종양과 종양 백신 사이에 충분한 거리를 유지하십시오. 이러한 물리적 분리는 두 종양 임플란트 간의 잠재적인 융합을 방지하는 데 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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연구

암 연구학

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