Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Vi takker Dr. Stephen Schoenberger for å gi B16-Flt3L-celler og personalet på LJI-dyret og flowcytometrifasilitetene for utmerket støtte.

Alle musene som ble brukt i studien ble vedlikeholdt og plassert i vivariumet til La Jolla Institute for Immunology (LJI) under spesifikke patogenfrie forhold med kontrollert temperatur og fuktighet. Dyreforsøk ble utført med 8-14 uker gamle kvinnelige C57BL / 6 mus i henhold til retningslinjer og protokoller godkjent av LJI Animal Care Committee.
1. Forberedelse av dyrkede tumorceller for implantasjon
<ol><li>Kultur B16-F10 melanomceller i Iscoves modifiserte Dulbeccos me...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

Protokollen beskrevet her er basert på studien av Allisons gruppe. De viste at kombinasjonen av B16-Flt3L-vaksine med CTLA-4-blokkering viste en synergistisk effekt på overlevelse og tumorvekst, mens ingen reduksjon av tumorvekst ble sett hos mus som fikk B16-Flt3L-vaksinen eller anti-CTLA-4-antistoffbehandlingen alene7. Nylige studier har avslørt en ny Treg-inneboende CTLA4-PKCη signalvei som spiller en viktig obligatorisk rolle i å regulere den kontaktavhengige undertrykkende aktiviteten ti...

Kreftimmunterapi har blitt anerkjent som en lovende terapeutisk strategi basert på mindre giftige bivirkninger og mer holdbare responser. Flere typer immunterapier er utviklet, inkludert onkolytiske virusterapier, kreftvaksiner, cytokinbehandlinger, monoklonale antistoffer, adoptivcelleoverføring (CAR-T-celler eller CAR-NK) og immunkontrollpunktblokkade1.
For kreftvaksiner finnes det ulike former for terapeutiske vaksiner, som helcellebaserte vaksiner, protein- eller peptidvaksiner, og RNA- eller DNA-vaksiner. Vaksinasjon er avhengig av evnen til antigenpresenterende celler (APCs) til å behandle tumorantigener, inkludert tumorspesifikke antigener, og presentere dem i immunogen form til T-celler. Dendrittiske celler (DCs) har vært kjent for å være de mest potente APCene og antas å spille en viktig rolle i antitumorimmunitet 2,3. Disse cellene tar opp og behandler tumorantigener, og migrerer deretter til drenerende lymfeknuter (dLN) for å prime og aktivere tumorspesifikke T-effektorceller (Teff) gjennom engasjement av T-cellereseptoren (TCR) og kostimulatoriske molekyler. Dette resulterer i differensiering og utvidelse av tumorspesifikke cytotoksiske T-celler (CTL), som infiltrerer svulsten og dreper tumorceller4. Følgelig representerer aktivering og modning av DCs attraktive strategier for å stimulere immunitet mot tumorantigener.
Flt3L er kjent for å fremme modning og utvidelse av funksjonelt modne DCer som uttrykker MHC klasse II, CD11c, DEC205 og CD86 proteiner5. Intratumoral, men ikke intravenøs, administrering av en adenovirusvektor som inneholder Flt3L-genet ( Adv-Flt3L ) har vist seg å fremme immunterapeutisk aktivitet mot ortrotopiske svulster6. Flt3L har også blitt brukt i tumorcellebaserte vaksiner som består av bestrålte B16-F10-celler som stabilt uttrykker retroviralt transducert Flt3L som en måte å øke krysspresentasjonen av tumorantigener av DCs og dermed øke antitumorresponsen. Protokollen for B16-Flt3L tumorvaksinasjon beskrevet her er basert på en studie publisert av Dr. James Allisons gruppe7. I dette papiret rapporterte de at en B16-Flt3L-vaksine kombinert med CTLA-4-blokkering synergistisk induserte avvisningen av etablert melanom, noe som resulterte i økt overlevelse.
Målet med denne protokollen er å gi en preklinisk immunterapimodell for melanom. Her beskrives detaljerte prosedyrer for hvordan man forbereder og implanterer tumorvaksiner, og hvordan man analyserer sammensetningen og funksjonen til intratumorale immunceller fra solid tumor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

Fms-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Flt3L) er et hematopoietisk cytokin som fremmer overlevelse og differensiering av dendrittiske celler (DC). Det har blitt brukt i tumorvaksiner for å aktivere medfødt immunitet og forbedre antitumorresponser. Denne protokollen demonstrerer en terapeutisk modell ved bruk av cellebasert tumorvaksine bestående av Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanomceller sammen med fenotypisk og funksjonell analyse av immunceller i tumormikromiljøet (TME). Prosedyrer for dyrkede tumorcellepreparater, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorstørrelse, intratumoral immuncelleisolasjon og flowcytometrianalyse er beskrevet. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en preklinisk solid tumor immunterapi modell, og en forskningsplattform for å studere forholdet mellom tumorceller og infiltrerende immunceller. Immunterapiprotokollen som er beskrevet her, kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter, for eksempel immunkontrollpunktblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antistoffer) eller kjemoterapi for å forbedre kreftterapeutisk effekt av melanom.

En synlig svart prikk av de implanterte B16-F10-cellene observeres vanligvis på hudoverflaten ~ 3 dager etter tumorimplantasjon. Mus behandles med tumorvaksinen 3, 6 og 9 dager etter at tumorknuten har nådd en størrelse på ≥2 mm. Vi observerte en signifikant reduksjon i tumorvekst i vaksinerte mus gruppe ~ 2 uker etter tumorimplantasjon (figur 1). På slutten av forsøket isolerte vi de intratumorale immuncellene og analyserte deres antall og celleoverflatemarkøruttrykk, samt cytokinp...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Protokollen presenterer en kreftimmunterapimodell ved bruk av cellebasert tumorvaksinasjon med Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanom. Denne protokollen demonstrerer prosedyrene, inkludert fremstilling av dyrkede tumorceller, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorvekst, isolering av intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.

Eksperimentell melanom immunterapimodell ved bruk av tumorvaksinasjon med et hematopoietisk cytokin

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Denne protokollen gir klinisk solid tumor immunterapi modell og en forskningsplattform for å studere forholdet mellom tumorceller og infiltrerende immunceller. Denne cellebaserte tumorvaksinen er praktisk, enkel å bruke, og kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter som sjekkpunktblokkade, for å oppnå additiv eller synergistisk effekt som kan resultere i mer potent og høy tumorimmunitet. Med på å demonstrere prosedyren vil være Ann Balancio, en forskningstekniker fra laboratoriet mitt.Til å begynne med, kultur B16-F10 melanomceller i IMDM, som inneholder 10% varmeinaktiv FBS, 2 millimolar glutamin, 1 millimolar natriumpyruvat, 1 millimolar MEM ikke-essensielle aminosyrer og 100 enheter per milliliter hver av penicillin og streptomycin. Oppretthold cellelinjen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Frø og høst B16-F10-cellene som beskrevet i tekstmanuskriptet.Fjern kulturmediet og vask kolbene en gang med PBS. Aspirer PBS og tilsett 5 milliliter 0,25% trypsin-EDTA, etterfulgt av hardt tapping av kanten av kulturflasken. Tilsett 15 milliliter kulturmedium for å nøytralisere trypsin-EDTA og hell innholdet i kolben i et 50 milliliter sentrifugerør.Vask oppvaskflaten med 10 ml PBS og hell i samme 50 milliliter sentrifugerør. Sentrifuger cellene i 5 minutter ved 200 RCF. Kast supernatanten og bryt cellepelleten ved å trykke fingeren på bunnen av røret.Tilsett kalde 10 milliliter PBS og pipetter forsiktig cellesuspensjonen. Deretter teller du cellene manuelt ved hjelp av et hemocytometer. Hold cellene på is før injeksjon.Intradermalt implantat 500.000 celler B16-F10 tumorceller i 50 mikroliter kald PBS i venstre flanke, ved hjelp av en 30 gauge nål. Dosen av implanterte B16-F10 tumorceller må kanskje justeres i et område på 50.000 til 500.000 celler for vellykket tumorutvikling. Etter implementering måler du tumorlengden og bredden tre ganger i uken ved hjelp av en elektronisk digital kaliper.Beregn tumorvolumet og behandle musene med tumorvaksine når svulster har nådd en størrelse på to millimeter som beskrevet i tekstmanuskriptet. Ved hjelp av en røntgenbestråler satt til 160 kilovolt og 25 milliampere, bestråler celler ved 150 grå doser gammastråler. Tell og kontroller cellens levedyktighet ved trypanblå farging før injeksjon.Intradermalt injisere musene med 1 million bestrålte B16-Flt3L-celler i 50 mikroliter kald PBS på samme flanke som den opprinnelige tumorimplantasjonen. Omtrent en centimeter fra stedet for primærtumoren på dagene 3, 6 og 9 etter den første celleimplantasjonen. Merk vaksineinjeksjonsstedene med en farget penn for å skille dem fra den primære svulsten.Hvis 50.000 B16-F10-celler først ble implantert, anbefales det å utføre vaksinebehandling på dagene 8, 11 og 14. Kirurgisk fjernet svulsten med huden fra hver euthanized mus og satte den inn i en 24 brønnplate med 1 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium. Skjær svulstene i små biter i to milliliter fordøyelsesbuffer og inkuber i 25 minutter ved 37 grader Celsius.Tilsett 10 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium for å stoppe fordøyelsen. Overfør cellene til en 40 mikrometer cellesil ved hjelp av en 25 milliliter serologisk pipette. Bruk deretter stempelet på en milliliter sprøyte for å male vevet.Sentrifuger cellene ved 500 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Resuspend pelleten i 5 milliliter 40% tetthetsgradientspesifikt medium i PBS fortynnet til 1x konsentrasjon. Legg cellesuspensjonen sakte på toppen av 5 milliliter 80% tetthetsgradientspesifikt medium som inneholder PBS.Sentrifuge til cellene ved 325 RCF med lav bremseinnstilling i 23 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering samler du forsiktig leukocyttlaget ved grensesnittet mellom 40% og 80% tetthetsgradientspesifikt medium, og passerer det gjennom en 40 mikrometer cellesil. Sentrifuger cellene ved 500 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius.Inkuber pelleten i to milliliter av røde blodlegemer lysis buffer i fem minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjon, tilsett 10 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium for å slukke RBC-lysebufferen. Sentrifuger cellene ved 400 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius.Resuspend cellene i 0, 5 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium, og telle totalt antall celler før bruk for videre analyse. Samle milten eller drenerende lymfeknuter som kontroller for gatingstrategien til immuncelleundergrupper ved flowcytometrianalyse. Følg celleisolasjonsmetoden som er beskrevet i tekstmanuskriptet.En synlig svart prikk av de implanterte B16-F10-cellene ble vanligvis observert på hudoverflaten omtrent tre dager etter tumorimplantasjon. Mus ble behandlet med tumorvaksine tre, seks og ni dager etter at svulstknuten hadde nådd eller overskredet størrelsen på to millimeter. En signifikant tumorvekstreduksjon ble observert i den vaksinerte musegruppen omtrent to uker etter tumorimplantasjon.Celler samlet fra leukocyttlaget inneholdt mange tumorceller, noe som gjør det vanskelig å lett definere lymfocyttpopulasjonen. Derfor ble splenocytt brukt parallelt, for riktig gating av intratumorale immuncelleundergrupper i flowcytometrianalyse. Gating-strategiene for CD103 positiv, CD11C positiv DC, CD8 positiv, CD4 positiv og Treg ble plottet sammen med kompensasjonsmatrisen.Representative data om oppkjøpte kontoer og hyppighet av hver befolkning ble også gitt. Intratumoral CD103-positiv, CD11C-positiv DC fra vaksinerte mus, viste et signifikant forhøyet uttrykk for den kostimulerende liganden CD86. Vaksinerte mus viste også en økning i tumorinfiltrerende CD8-positive og CD4-positive, Foxp3-negative celler, samt i CD8-positive granzyme B-positive og interferon gamma-positive CTLer.Hold tilstrekkelig avstand mellom primærtumoren og tumorvaksinen. Denne fysiske separasjonen er kritisk for å unngå potensiell fusjon mellom de to tumorimplantatene.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Eksperimentell modell av Original Tumor Utvikling og Peritoneal metastaser<em&gt; via</em&gt; Ortotopiske Inoculation med ovarialcancer Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murine ortotopiske Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Svulst Engraftment i en Xenograft musemodell av menneskelig mantelen celle lymfomer

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Bruker CRISPR/Cas9 Gene redigering for å undersøke kreftfremkallende aktiviteten av muterte Calreticulin i cytokin avhengige blodkreft cellene

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic melanom Spheroid huden modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro svulst celle Rechallenge For prediktiv evaluering av Chimeric Antigen reseptor T celle Antitumor funksjon

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

En melanom pasient-avledet Xenograft modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Modulert 3D Tumor Sfæroid Modell for å studere tumor-Stroma interaksjon og narkotika oppdagelse

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...