Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Stephen Schoenberger por fornecer células B16-Flt3L e à equipe das instalações de citometria de fluxo e animal LJI pelo excelente suporte.

Todos os camundongos utilizados no estudo foram mantidos e alojados no biotério do Instituto de Imunologia de La Jolla (LJI) em condições específicas livres de patógenos com temperatura e umidade controladas. Experimentos em animais foram realizados com camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-14 semanas de idade de acordo com diretrizes e protocolos aprovados pelo LJI Animal Care Committee.
1. Preparação de células tumorais cultivadas para implantação
<ol><li>Cultura de c...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

O protocolo aqui descrito é baseado no estudo do grupo de Allison. Eles demonstraram que a combinação da vacina B16-Flt3L com o bloqueio CTLA-4 mostrou um efeito sinérgico na taxa de sobrevivência e no crescimento do tumor, enquanto nenhuma redução do crescimento tumoral foi observada em camundongos que receberam a vacina B16-Flt3L ou o tratamento com anticorpos anti-CTLA-4 isoladamente7. Estudos recentes revelaram uma nova via de sinalização CTLA4-PKCη intrínseca ao Treg que desempenha...

A imunoterapia contra o câncer tem sido reconhecida como uma estratégia terapêutica promissora com base em seus efeitos colaterais menos tóxicos e respostas mais duráveis. Vários tipos de imunoterapias foram desenvolvidos, incluindo terapias com vírus oncolíticos, vacinas contra o câncer, terapias com citocinas, anticorpos monoclonais, transferência de células adotivas (células CAR-T ou CAR-NK) e bloqueio de ponto de verificação imune1.
Para vacinas contra o câncer, existem diferentes formas de vacinas terapêuticas, como vacinas baseadas em células inteiras, vacinas de proteínas ou peptídeos e vacinas de RNA ou DNA. A vacinação baseia-se na capacidade das células apresentadoras de antígenos (APCs) de processar antígenos tumorais, incluindo antígenos específicos do tumor, e apresentá-los de forma imunogênica às células T. Sabe-se que as células dendríticas (DCs) são as APCs mais potentes e acredita-se que desempenhem um papel importante na imunidade antitumoral 2,3. Essas células absorvem e processam antígenos tumorais e, em seguida, migram para os gânglios linfáticos drenantes (dLN) para preparar e ativar células efetoras T específicas do tumor (Teff) através do envolvimento do receptor de células T (TCR) e moléculas costimulatórias. Isso resulta na diferenciação e expansão das células T citotóxicas específicas do tumor (CTL), que se infiltram no tumor e matam as células tumorais4. Consequentemente, a ativação e a maturação das DO representam estratégias atraentes para estimular a imunidade contra antígenos tumorais.
Sabe-se que o Flt3L promove a maturação e expansão de CDs funcionalmente maduras que expressam as proteínas MHC classe II, CD11c, DEC205 e CD865. A administração intratumoral, mas não intravenosa, de um vetor de adenovírus incorporando o gene Flt3L (Adv-Flt3L) demonstrou promover atividade imunoterapêutica contra tumores ortrotópicos6. O Flt3L também tem sido usado em vacinas baseadas em células tumorais que consistem em células B16-F10 irradiadas expressando de forma estável o Flt3L transduzido retroviralmente como forma de melhorar a apresentação cruzada de antígenos tumorais por CDs e, assim, aumentar as respostas antitumorais. O protocolo de vacinação contra o tumor B16-Flt3L descrito aqui é baseado em um estudo publicado pelo grupo7 do Dr. James Allison. Neste artigo, eles relataram que uma vacina B16-Flt3L combinada com o bloqueio CTLA-4 induziu sinergicamente a rejeição do melanoma estabelecido, resultando em aumento da sobrevida.
O objetivo deste protocolo é fornecer um modelo de imunoterapia pré-clínica para melanoma. Aqui, procedimentos detalhados de como preparar e implantar vacinas tumorais e como analisar a composição e a função das células imunes intratumorais do tumor sólido são descritos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

O ligante tirosina quinase 3 semelhante ao Fms (Flt3L) é uma citocina hematopoiética que promove a sobrevivência e diferenciação de células dendríticas (DCs). Tem sido usado em vacinas tumorais para ativar a imunidade inata e melhorar as respostas antitumorais. Este protocolo demonstra um modelo terapêutico usando vacina tumoral baseada em células que consiste em células de melanoma B16-F10 expressando Flt3L, juntamente com análise fenotípica e funcional de células imunes no microambiente tumoral (TME). Procedimentos para preparação de células tumorais cultivadas, implantação de tumor, irradiação celular, medição do tamanho do tumor, isolamento intratumoral de células imunes e análise de citometria de fluxo são descritos. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um modelo pré-clínico de imunoterapia de tumores sólidos e uma plataforma de pesquisa para estudar a relação entre células tumorais e células imunes infiltrantes. O protocolo de imunoterapia aqui descrito pode ser combinado com outras modalidades terapêuticas, como bloqueio de checkpoint imunológico (anticorpos anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) ou quimioterapia, a fim de melhorar o efeito terapêutico do melanoma sobre o câncer.

Um ponto preto visível das células B16-F10 implantadas é geralmente observado na superfície da pele ~ 3 dias após o implante do tumor. Os ratos são tratados com a vacina tumoral 3, 6 e 9 dias após o nódulo tumoral ter atingido um tamanho de ≥2 mm. Observamos uma redução significativa no crescimento tumoral no grupo de camundongos vacinados ~2 semanas após o implante do tumor (Figura 1). Ao final do experimento, isolamos as células imunes intratumorais e analisamos seu número e...

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Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.

Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Este protocolo fornece um modelo clínico de imunoterapia de tumores sólidos e uma plataforma de pesquisa para estudar a relação entre células tumorais e células imunes infiltrantes. Esta vacina tumoral baseada em células é conveniente, simples de usar e pode ser combinada com outras modalidades terapêuticas, como o bloqueio de pontos de verificação, para alcançar um efeito aditivo ou sinérgico que pode resultar em imunidade tumoral mais potente e alta. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Ann Balancio, uma técnica de pesquisa do meu laboratório.Para começar, cultura de células de melanoma B16-F10 em IMDM, contendo 10% de FBS inativo ao calor, 2 glutamina milimolar, 1 piruvato de sódio milimolar, 1 milimolar de aminoácidos não essenciais MEM e 100 unidades por mililitro cada de penicilina e estreptomicina. Mantenha a linhagem celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Semee e colha as células B16-F10 conforme descrito no manuscrito do texto.Retire o meio de cultura e lave os frascos uma vez com PBS. Aspirar PBS e adicionar 5 mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA, seguidos de bater duramente na borda do balão de cultura. Adicionar 15 mililitros de meio de cultura para neutralizar a tripsina-EDTA e deitar o conteúdo do balão num tubo de centrifugação de 50 mililitros.Lave a superfície do prato com 10 mililitros de PBS e despeje no mesmo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar as células durante 5 minutos a 200 RCF. Descarte o sobrenadante e quebre a pastilha celular batendo com o dedo no fundo do tubo.Adicione 10 mililitros frios de PBS e pipete suavemente a suspensão celular. Em seguida, conte manualmente as células usando um hemocitômetro. Mantenha as células no gelo antes da injeção.Implante intradermicamente 500.000 células de células tumorais B16-F10 em 50 microlitros de PBS frio no flanco esquerdo, usando uma agulha de calibre 30. A dose de células tumorais B16-F10 implantadas pode precisar ser ajustada em uma faixa de 50.000 a 500.000 células para o desenvolvimento bem-sucedido do tumor. Após a implementação, meça o comprimento e a largura do tumor três vezes por semana usando um paquímetro digital eletrônico.Calcule o volume do tumor e trate os camundongos com vacina tumoral quando os tumores tiverem atingido um tamanho de dois milímetros, conforme descrito no manuscrito do texto. Usando um irradiador de raios-X ajustado a 160 quilovolts e 25 miliamperes, irradie células a 150 doses cinzentas de raios gama. Conte e verifique a viabilidade celular por coloração azul de tripano antes da injeção.Injetar intradermicamente os camundongos com 1 milhão de células B16-Flt3L irradiadas em 50 microlitros de PBS frio no mesmo flanco do implante tumoral original. Aproximadamente um centímetro do local do tumor primário nos dias 3, 6 e 9 após o implante celular inicial. Marque os locais de injeção da vacina com uma caneta colorida para distingui-los do tumor primário.Se 50.000 células B16-F10 foram inicialmente implantadas, recomenda-se a realização do tratamento vacinal nos dias 8, 11 e 14. Cirurgicamente removeu o tumor com a pele de cada rato eutanasiado e colocou-o em uma placa de 24 poços com 1 mililitro de 10% FBS RPMI 1640 médio. Corte os tumores em pequenos pedaços em dois mililitros de tampão de digestão e incube por 25 minutos a 37 graus Celsius.Adicione 10 mililitros de 10% FBS RPMI 1640 meio para parar a digestão. Transfira as células para um filtro celular de 40 micrômetros usando uma pipeta sorológica de 25 mililitros. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa de um mililitro para moer os tecidos.Centrifugar as células a 500 RCF durante 5 minutos a 4 graus Celsius. Ressuspeite o pellet em 5 mililitros de meio específico de gradiente de densidade de 40% em PBS diluído para concentração de 1x. Adicione a suspensão celular lentamente em cima de 5 mililitros de meio específico de gradiente de densidade de 80% contendo PBS.Centrífuga para as células a 325 RCF com uma regulação de travagem baixa durante 23 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, coletar cuidadosamente a camada de leucócitos na interface entre o meio específico do gradiente de densidade de 40% e 80% e passá-la através de um filtro celular de 40 micrômetros. Centrifugar as células a 500 RCF durante 5 minutos a 4 graus Celsius.Incubar o pellet em dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por cinco minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 10 mililitros de 10% de meio FBS RPMI 1640 para extinguir o tampão de lise RBC. Centrifugar as células a 400 RCF durante 5 minutos a 4 graus Celsius.Ressuspeite as células em 0,5 mililitros de 10% de meio FBS RPMI 1640 e conte o número total de células antes de usar para análise posterior. Coletar o baço ou os gânglios linfáticos drenantes como controles para a estratégia de bloqueio de subconjuntos de células imunes por análise de citometria de fluxo. Siga o método de isolamento celular descrito no manuscrito do texto.Um ponto preto visível das células B16-F10 implantadas foi geralmente observado na superfície da pele aproximadamente três dias após o implante do tumor. Os camundongos foram tratados com uma vacina tumoral três, seis e nove dias após o nódulo tumoral ter atingido ou excedido o tamanho de dois milímetros. Uma redução significativa do crescimento tumoral foi observada no grupo de camundongos vacinados cerca de duas semanas após o implante do tumor.As células coletadas da camada de leucócitos continham muitas células tumorais, dificultando a definição imediata da população de linfócitos. Portanto, os esplenócitos foram utilizados em paralelo, para o tratamento adequado dos subconjuntos de células imunes intratumorais na análise da citometria de fluxo. As estratégias de gating de CD103 positivo, CD11C positivo, CD8 positivo, CD4 positivo e Treg foram plotadas juntamente com a matriz de compensação.Também foram fornecidos dados representativos das contas adquiridas e frequência de cada população. CD103 CD103 positivo para CD11C intratumoral, DC de camundongos vacinados, apresentaram expressão significativamente elevada do ligante coestimulatório CD86. Os camundongos vacinados também apresentaram um aumento nas células CD8 positivas para CD8 e CD4 positivas, Foxp3 negativas, bem como nas CTLs CD8 positivas para granzima B e interferon gama positivas.Mantenha uma distância suficiente entre o tumor primário e a vacina tumoral. Essa separação física é fundamental para evitar a potencial fusão entre os dois implantes tumorais.

Research

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Pesquisa do câncer

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...