Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Vi tackar Dr Stephen Schönberger för att ha tillhandahållit B16-Flt3L-celler och personalen på LJI-djur- och flödescytometrianläggningarna för utmärkt stöd.

Alla möss som användes i studien upprätthölls och inrymdes i vivarium vid La Jolla Institute for Immunology (LJI) under specifika patogenfria förhållanden med kontrollerad temperatur och fuktighet. Djurförsök utfördes med 8-14 veckor gamla kvinnliga C57BL/6-möss enligt riktlinjer och protokoll godkända av LJI Animal Care Committee.
1. Beredning av odlade tumörceller för implantation
<ol><li>Kultur B16-F10 melanomceller i Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMD...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här är baserat på studien av Allisons grupp. De visade att kombinationen av B16-Flt3L-vaccin med CTLA-4-blockad visade en synergistisk effekt på överlevnad och tumörtillväxt, medan ingen minskning av tumörtillväxt sågs hos möss som fick B16-Flt3L-vaccinet eller anti-CTLA-4-antikroppsbehandling ensam7. Nya studier har avslöjat en ny Treg-inneboende CTLA4-PKCη-signalväg som spelar en viktig obligatorisk roll för att reglera den kontaktberoende undertryckande a...

Cancerimmunterapi har erkänts som en lovande terapeutisk strategi baserad på dess mindre toxiska biverkningar och mer hållbara svar. Flera typer av immunterapier har utvecklats, inklusive onkolytiska virusterapier, cancervacciner, cytokinterapier, monoklonala antikroppar, adoptiv cellöverföring (CAR-T-celler eller CAR-NK) och immunkontrollpunktsblockad1.
För cancervacciner finns det olika former av terapeutiska vacciner, såsom helcellsbaserade vacciner, protein- eller peptidvacciner och RNA- eller DNA-vacciner. Vaccination är beroende av förmågan hos antigenpresenterande celler (APC) att bearbeta tumörantigener, inklusive tumörspecifika antigener, och presentera dem i immunogen form till T-celler. Dendritiska celler (DC) har varit kända för att vara de mest potenta APC: erna och tros spela en viktig roll i antitumörimmunitet 2,3. Dessa celler tar upp och bearbetar tumörantigener och migrerar sedan till de dränerande lymfkörtlarna (dLN) för att prima och aktivera tumörspecifika T-effektorceller (Teff) genom engagemang av T-cellreceptorn (TCR) och kostimulatoriska molekyler. Detta resulterar i differentiering och expansion av tumörspecifika cytotoxiska T-celler (CTL), som infiltrerar tumören och dödar tumörceller4. Följaktligen representerar aktivering och mognad av DC attraktiva strategier för att stimulera immunitet mot tumörantigener.
Flt3L är känt för att främja mognad och expansion av funktionellt mogna DCs som uttrycker MHC klass II, CD11c, DEC205 och CD86 proteiner5. Intratumoral, men inte intravenös, administrering av en adenovirusvektor som innehåller Flt3L-genen (Adv-Flt3L) har visat sig främja immunterapeutisk aktivitet mot orthrotopiska tumörer6. Flt3L har också använts i tumörcellsbaserade vacciner bestående av bestrålade B16-F10-celler som stabilt uttrycker retroviralt transducerad Flt3L som ett sätt att förbättra korspresentationen av tumörantigener av DC och därmed öka antitumörsvaren. Protokollet för B16-Flt3L tumörvaccination som beskrivs här är baserat på en studie publicerad av Dr James Allisons grupp7. I detta dokument rapporterade de att ett B16-Flt3L-vaccin i kombination med CTLA-4-blockad synergistiskt inducerade avstötningen av etablerat melanom, vilket resulterade i ökad överlevnad.
Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en preklinisk immunterapimodell för melanom. Här beskrivs detaljerade procedurer för hur man förbereder och implanterar tumörvacciner och hur man analyserar sammansättningen och funktionen av intratumorala immunceller från fast tumör.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

FMS-liknande tyrosinkinas 3-ligand (Flt3L) är ett hematopoetiskt cytokin som främjar överlevnad och differentiering av dendritiska celler (DC). Det har använts i tumörvacciner för att aktivera medfödd immunitet och förbättra antitumörsvar. Detta protokoll visar en terapeutisk modell med cellbaserat tumörvaccin bestående av Flt3L-uttryckande B16-F10 melanomceller tillsammans med fenotypisk och funktionell analys av immunceller i tumörmikromiljön (TME). Procedurer för odlad tumörcellsberedning, tumörimplantation, cellbestrålning, tumörstorleksmätning, intratumoral immuncellisolering och flödescytometrianalys beskrivs. Det övergripande målet med detta protokoll är att tillhandahålla en preklinisk solid tumörimmunterapimodell och en forskningsplattform för att studera förhållandet mellan tumörceller och infiltrerande immunceller. Immunterapiprotokollet som beskrivs här kan kombineras med andra terapeutiska modaliteter, såsom immunkontrollpunktsblockad (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1-antikroppar) eller kemoterapi för att förbättra den cancerterapeutiska effekten av melanom.

En synlig svart prick av de implanterade B16-F10-cellerna observeras vanligtvis på hudytan ~ 3 dagar efter tumörimplantation. Möss behandlas med tumörvaccinet 3, 6 och 9 dagar efter att tumörknutan har nått en storlek på ≥2 mm. Vi observerade en signifikant minskning av tumörtillväxten hos vaccinerade mössgrupp ~ 2 veckor efter tumörimplantation (figur 1). I slutet av experimentet isolerade vi de intratumorala immuncellerna och analyserade deras antal och cellytmarköruttryck, s...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Protokollet presenterar en cancerimmunterapimodell med cellbaserad tumörvaccination med Flt3L-uttryckande B16-F10-melanom. Detta protokoll visar procedurerna, inklusive beredning av odlade tumörceller, tumörimplantation, cellbestrålning, mätning av tumörtillväxt, isolering av intratumorala immunceller och flödescytometrianalys.

Experimentell melanomimmunterapimodell med tumörvaccination med ett hematopoetiskt cytokin

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Detta protokoll tillhandahåller klinisk solid tumörimmunterapimodell och en forskningsplattform för att studera förhållandet mellan tumörceller och infiltrerande immunceller. Detta cellbaserade tumörvaccin är bekvämt, enkelt att använda och kan kombineras med andra terapeutiska metoder som checkpointblockad för att uppnå additiv eller synergistisk effekt som kan resultera i mer potent och hög tumörimmunitet. Hjälper till att demonstrera proceduren kommer att vara Ann Balancio, en forskningstekniker från mitt laboratorium.Till att börja med odla B16-F10 melanomceller i IMDM, innehållande 10% värme inaktiv FBS, 2 millimolär glutamin, 1 millimolar natriumpyruvat, 1 millimolar MEM icke-essentiella aminosyror och 100 enheter per milliliter vardera av penicillin och streptomycin. Håll cellinjen vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Frö och skörda B16-F10-cellerna enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Ta bort odlingsmediet och tvätta kolvarna en gång med PBS. Aspirera PBS och tillsätt 5 ml 0,25% trypsin-EDTA, följt av att hårt knacka på odlingskolvens kant. Tillsätt 15 ml odlingsmedium för att neutralisera trypsin-EDTA och häll innehållet i kolven i ett 50 ml centrifugrör.Tvätta diskytan med 10 ml PBS och häll i samma 50 ml centrifugrör. Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 RCF. Kassera supernatanten och bryt cellpelleten genom att fingra på rörets botten.Tillsätt kalla 10 ml PBS och pipettera försiktigt cellsuspensionen. Räkna sedan cellerna manuellt med en hemocytometer. Håll cellerna på is före injektion.Intradermalt implantera 500 000 celler B16-F10 tumörceller i 50 mikroliter kall PBS i vänster flank, med hjälp av en 30 gauge nål. Dosen av implanterade B16-F10-tumörceller kan behöva justeras i ett intervall av 50 000 till 500 000 celler för framgångsrik tumörutveckling. Efter implementering mäter du tumörlängden och bredden tre gånger i veckan med hjälp av en elektronisk digital bromsok.Beräkna tumörvolymen och behandla mössen med tumörvaccin när tumörerna har nått en storlek på två millimeter som beskrivs i textmanuskriptet. Med hjälp av en röntgenbestrålning inställd på 160 kilovolt och 25 milliampere, bestråla celler vid 150 grå doser gammastrålar. Räkna och kontrollera cellviabiliteten genom trypanblå färgning före injektion.Injicera mössen intradermalt med 1 miljon bestrålade B16-Flt3L-celler i 50 mikroliter kall PBS på samma flank som den ursprungliga tumörimplantationen. Cirka en centimeter från platsen för den primära tumören på dag 3, 6 och 9 efter den första cellimplantationen. Markera vaccininjektionsställena med en färgad penna för att skilja dem från den primära tumören.Om 50 000 B16-F10-celler initialt implanterades, rekommenderas att utföra vaccinbehandling på dagarna 8, 11 och 14. Kirurgiskt avlägsnade tumören med huden från varje avlivad mus och lade den i en 24-brunnsplatta med 1 milliliter 10% FBS RPMI 1640-medium. Skär tumörerna i små bitar i två milliliter matsmältningsbuffert och inkubera i 25 minuter vid 37 grader Celsius.Tillsätt 10 ml 10% FBS RPMI 1640-medium för att stoppa matsmältningen. Överför cellerna till en 40 mikrometer cellsil med en 25 ml serologisk pipett. Använd sedan kolven på en milliliter spruta för att slipa vävnaderna.Centrifugera cellerna vid 500 RCF i 5 minuter vid 4 grader Celsius. Återsuspendera pelleten i 5 ml 40% densitetsgradientspecifikt medium i PBS utspätt till 1x koncentration. Tillsätt cellsuspensionen långsamt ovanpå 5 ml 80% densitetsgradientspecifikt medium innehållande PBS.Centrifugera till cellerna vid 325 RCF med låg bromsinställning i 23 minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugering, samla försiktigt leukocytskiktet vid gränssnittet mellan 40% och 80% densitetsgradientspecifikt medium och passera det genom en 40 mikrometer cellsil. Centrifugera cellerna vid 500 RCF i 5 minuter vid 4 grader Celsius.Inkubera pelleten i två milliliter röd blodkroppslysbuffert i fem minuter vid rumstemperatur. Efter inkubation, tillsätt 10 ml 10% FBS RPMI 1640-medium för att släcka RBC-lysbufferten. Centrifugera cellerna vid 400 RCF i 5 minuter vid 4 grader Celsius.Återsuspendera cellerna i 0,5 ml 10% FBS RPMI 1640-medium och räkna det totala antalet celler före användning för vidare analys. Samla mjälten eller de dränerande lymfkörtlarna som kontroller för grindstrategin för immuncellsdelmängder genom flödescytometrianalys. Följ cellisoleringsmetoden som beskrivs i textmanuskriptet.En synlig svart prick av de implanterade B16-F10-cellerna observerades vanligtvis på hudytan ungefär tre dagar efter tumörimplantation. Möss behandlades med ett tumörvaccin tre, sex och nio dagar efter att tumörknutan hade nått eller överskridit storleken på två millimeter. En signifikant tumörtillväxtminskning observerades i gruppen vaccinerade möss cirka två veckor efter tumörimplantation.Celler som samlats in från leukocytskiktet innehöll många tumörceller, vilket gjorde det svårt att enkelt definiera lymfocytpopulationen. Därför användes splenocyt parallellt, för korrekt gating av intratumorala immuncellsdelmängder i flödescytometrianalys. Gatingstrategierna för CD103 positiv, CD11C positiv DC, CD8 positiv, CD4 positiv och Treg plottades tillsammans med kompensationsmatrisen.Representativa uppgifter om förvärvade konton och frekvens för varje population tillhandahölls också. Intratumoral CD103-positiv, CD11C-positiv DC från vaccinerade möss, visade ett signifikant förhöjt uttryck av den samstimulerande liganden CD86. Vaccinerade möss visade också en ökning av tumörinfiltrerande CD8-positiva och CD4-positiva, Foxp3-negativa celler, liksom i CD8-positiva granzym B-positiva och interferon gammapositiva CTL.Håll ett tillräckligt avstånd mellan den primära tumören och tumörvaccinet. Denna fysiska separation är avgörande för att undvika potentiell fusion mellan de två tumörimplantaten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murina Experimentellt av ursprungliga tumören utveckling och peritonealdialys metastasering<em&gt; via</em&gt; Orthotopic Ympning med ovarialcancer celler

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murin Orthotopic blåstumör modell och Tumör Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumör Engraftment i en Xenograft musmodell av mänskliga mantelcellslymfom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Med hjälp av CRISPR/Cas9 gen redigering för att undersöka onkogena aktiviteten av muterade Calreticulin i cytokin beroende av hematopoetiska celler

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom sfäroid hud modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitala polymeras Chain Reaction Assay för den genetiska variationen i en sporadisk familjär adenomatös polypos Patient med formatet Chip-i-ett-rör

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

En melanom patient-derived xenograft modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En ny Stromal Fibroblast-Modulerad 3D Tumör Spheroid modell för att studera tumör-Stroma interaktion och drug discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...