Name: experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

B16-Flt3L hücreleri sağladığı için Dr. Stephen Schoenberger'e ve LJI hayvan ve akış sitometri tesislerinin personeline mükemmel destek için teşekkür ederiz.

Çalışmada kullanılan tüm fareler, kontrollü sıcaklık ve nem ile spesifik patojensiz koşullar altında La Jolla İmmünoloji Enstitüsü'nün (LJI) vivaryumunda muhafaza edildi ve barındırıldı. Hayvan deneyleri, LJI Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanan kılavuzlara ve protokollere göre 8-14 haftalık dişi C57BL / 6 farelerle gerçekleştirildi.
1. İmplantasyon için kültürlenmiş tümör hücrelerinin hazırlanması
<ol><li>Iscove'un Modifiye Dulbecc...

<ol>
	<li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy:+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications.">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell &amp; Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells.">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li><li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice:+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified.">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li><li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral,+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells.">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280 (2004).</li><li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors.">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li><li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma.">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li><li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity.">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+activation+of+CD103(+)+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition.">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy.">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).</li><li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function.">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li></ol>

Burada açıklanan protokol, Allison'ın grubu tarafından yapılan çalışmaya dayanıyor. B16-Flt3L aşısının CTLA-4 blokajı ile kombinasyonunun sağkalım oranı ve tümör büyümesi üzerinde sinerjik bir etki gösterdiğini, oysa B16-Flt3L aşısı veya tek başına anti-CTLA-4 antikor tedavisi alan farelerde tümör büyümesinde bir azalma görülmediğini gösterdiler7. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Treg11'in temasa bağımlı baskılayıcı aktivites...

Kanser immünoterapisi, daha az toksik yan etkileri ve daha dayanıklı yanıtlarına dayanan umut verici bir terapötik strateji olarak kabul edilmiştir. Onkolitik virüs tedavileri, kanser aşıları, sitokin tedavileri, monoklonal antikorlar, evlat edinen hücre transferi (CAR-T hücreleri veya CAR-NK) ve immün kontrol noktası blokajı1 dahil olmak üzere çeşitli immünoterapi türleri geliştirilmiştir.
Kanser aşıları için, tüm hücre bazlı aşılar, protein veya peptit aşıları ve RNA veya DNA aşıları gibi farklı terapötik aşı formları vardır. Aşılama, antijen sunan hücrelerin (APC'ler) tümöre özgü antijenler de dahil olmak üzere tümör antijenlerini işleme ve bunları T hücrelerine immünojenik bir biçimde sunma yeteneğine dayanır. Dendritik hücrelerin (DC'ler) en güçlü APC'ler olduğu bilinmektedir ve antitümör immünitesinde önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır 2,3. Bu hücreler tümör antijenlerini alır ve işler ve daha sonra T-hücresi reseptörü (TCR) ve kostimülatör moleküllerin katılımı yoluyla tümöre özgü T efektör (Teff) hücrelerini astarlamak ve aktive etmek için drenaj lenf düğümlerine (dLN) göç eder. Bu, tümöre sızan ve tümör hücrelerini öldüren tümöre özgü sitotoksik T hücrelerinin (CTL) farklılaşması ve genişlemesi ile sonuçlanır4. Sonuç olarak, DC'lerin aktivasyonu ve olgunlaşması, tümör antijenlerine karşı bağışıklığı uyarmak için çekici stratejileri temsil eder.
Flt3L'nin, MHC sınıf II, CD11c, DEC205 ve CD86 proteinlerini5 eksprese eden fonksiyonel olarak olgun DC'lerin olgunlaşmasını ve genişlemesini teşvik ettiği bilinmektedir. Flt3L genini (Adv-Flt3L ) içeren bir adenovirüs vektörünün intratümöral, ancak intravenöz olmayan uygulamasının, ortrotopik tümörlere karşı immün terapötik aktiviteyi teşvik ettiği gösterilmiştir6. Flt3L ayrıca, tümör antijenlerinin DC'ler tarafından çapraz sunumunu arttırmanın ve böylece antitümör yanıtlarını arttırmanın bir yolu olarak retroviral olarak transdüke edilmiş Flt3L'yi kararlı bir şekilde eksprese eden ışınlanmış B16-F10 hücrelerinden oluşan tümör hücresi bazlı aşılarda da kullanılmıştır. Burada açıklanan B16-Flt3L tümör aşılama protokolü, Dr. James Allison'ın grup7'si tarafından yayınlanan bir çalışmaya dayanmaktadır. Bu yazıda, CTLA-4 blokajı ile kombine edilen bir B16-Flt3L aşısının, yerleşik melanomun reddini sinerjik olarak indüklediğini ve sağkalımın artmasına neden olduğunu bildirmişlerdir.
Bu protokolün amacı, melanom için klinik öncesi bir immünoterapi modeli sağlamaktır. Burada, tümör aşılarının nasıl hazırlanacağı ve implante edileceği ve katı tümörden intratümöral immün hücrelerin bileşiminin ve işlevinin nasıl analiz edileceği hakkında ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% heat-inactivated FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02&#160;</td>
			<td>Lot# 209018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-shape-bottom plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3926.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)</td>
			<td>Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F10 cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix fixation buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Cell fixation buffer (4.2% PFA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiStop (protein transport inhibitor)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554724</td>
			<td>1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR-II cytometers&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td>density gradient specific medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS2000 X-ray Irradiator</td>
			<td>Rad Source Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>477530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua fixable viability kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103135</td>
			<td>Clone: 30-F11 
			Fluorophore: BV570 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD3&#949;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100327</td>
			<td>Clone: 145-2C11 
			Fluorophore: PerCP-Cy5.5 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730 
			100724</td>
			<td>Clone: 53-6.7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Clone: GK1.5 
			Fluorophore: APC-Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mFoxp3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11577382</td>
			<td>Clone: FJK-16s 
			Fluorophore: FITC 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-m/hGzmB</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>372208</td>
			<td>Clone: QA16A02 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mIFNg</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Clone: XMG1.2 
			Fluorophore: PE-Cy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD19</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>Clone: 6D5 
			Fluorophore: BV785 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mGr1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108423</td>
			<td>Clone: RB6-8C5 
			Fluorophore: APC/Cy7 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101223</td>
			<td>Clone: M1/70 
			Fluorophore: Pacific blue 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mF4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone: BM8 
			Fluorophore: PECy7 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD11c</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>Clone: N418 
			Fluorophore: PerCP Cy5.5 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mMHCII</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2 
			Fluorophore: AF700 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD103</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121410</td>
			<td>Clone: 2E7 
			Fluorophore: Alexa Fluor 647 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mCD86</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105007</td>
			<td>Clone: GL-1 
			Fluorophore: PE 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Clone: 2.4G2 
			Dilution: 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental melanoma immunotherapy model using tumor vaccination with a hematopoietic cytokine

Fms benzeri tirozin kinaz 3 ligand (Flt3L), dendritik hücrelerin (DC'ler) hayatta kalmasını ve farklılaşmasını destekleyen hematopoetik bir sitokindir. Tümör aşılarında doğuştan gelen bağışıklığı aktive etmek ve antitümör yanıtlarını arttırmak için kullanılmıştır. Bu protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanom hücrelerinden oluşan hücre bazlı tümör aşısının yanı sıra tümör mikroortamındaki (TME) bağışıklık hücrelerinin fenotipik ve fonksiyonel analizini kullanan terapötik bir model göstermektedir. Kültürlü tümör hücresi hazırlığı, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör boyutu ölçümü, intratümöral immün hücre izolasyonu ve akım sitometri analizi için prosedürler tanımlanmıştır. Bu protokolün genel amacı, klinik öncesi katı tümör immünoterapi modeli ve tümör hücreleri ile infiltrasyon yapan bağışıklık hücreleri arasındaki ilişkiyi incelemek için bir araştırma platformu sağlamaktır. Burada tarif edilen immünoterapi protokolü, melanomun kanser terapötik etkisini iyileştirmek için immün kontrol noktası blokajı (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antikorları) veya kemoterapi gibi diğer terapötik modalitelerle birleştirilebilir.

İmplante edilen B16-F10 hücrelerinin görünür siyah bir noktası genellikle tümör implantasyonundan ~ 3 gün sonra cilt yüzeyinde gözlenir. Fareler, tümör nodülünün ≥2 mm'lik bir boyuta ulaşmasından 3, 6 ve 9 gün sonra tümör aşısı ile tedavi edilir. Tümör implantasyonundan ~ 2 hafta sonra aşılanmış farelerde tümör büyümesinde anlamlı bir azalma gözlemledik (Şekil 1). Deneyin sonunda, intratümöral immün hücreleri izole ettik ve yukarıda tarif edildiği...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine at JoVE.com

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanomu ile hücre bazlı tümör aşılamasını kullanan bir kanser immünoterapi modeli sunmaktadır. Bu protokol, kültürlenmiş tümör hücrelerinin hazırlanması, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör büyümesinin ölçülmesi, intratümöral immün hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi analizi dahil olmak üzere prosedürleri göstermektedir.

Hematopoetik Sitokin ile Tümör Aşılaması Kullanılarak Deneysel Melanom İmmünoterapi Modeli

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Bu protokol, klinik solid tümör immünoterapi modeli ve tümör hücreleri ile infiltrasyon yapan immün hücreler arasındaki ilişkiyi incelemek için bir araştırma platformu sağlar. Bu hücre bazlı tümör aşısı uygundur, kullanımı kolaydır ve daha güçlü ve yüksek tümör bağışıklığı ile sonuçlanabilecek katkı maddesi veya sinerjik etki elde etmek için kontrol noktası blokajı gibi diğer terapötik modalitelerle birleştirilebilir. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak kişi, laboratuvarımdan bir araştırma teknisyeni olan Ann Balanjio olacak.Başlamak için, IMDM'de% 10 ısı inaktif FBS, 2 milimolar glutamin, 1 milimolar sodyum piruvat, 1 milimolar MEM esansiyel olmayan amino asitler ve her biri penisilin ve streptomisin mililitre başına 100 birim içeren kültür B16-F10 melanom hücreleri. Hücre hattını% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede tutun. B16-F10 hücrelerini metin el yazmasında açıklandığı gibi tohumlayın ve hasat edin.Kültür ortamını çıkarın ve şişeleri PBS ile bir kez yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 5 mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin, ardından kültür şişesinin kenarına sert bir şekilde dokunun. Tripsin-EDTA'yı nötralize etmek için 15 mililitre kültür ortamı ekleyin ve şişenin içeriğini 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne dökün.Bulaşık yüzeyini 10 mililitre PBS ile yıkayın ve aynı 50 mililitre santrifüj tüpüne dökün. Hücreleri 200 RCF'de 5 dakika santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve tüpün dibine dokunarak hücre peletini kırın.Soğuk 10 mililitre PBS ekleyin ve hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyin. Ardından, bir hemositometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın. Enjeksiyondan önce hücreleri buz üzerinde tutun.30 gauge iğne kullanarak, sol kanattaki 50 mikrolitre soğuk PBS'ye 500.000 hücre B16-F10 tümör hücresini intradermal olarak implante edin. İmplante edilmiş B16-F10 tümör hücrelerinin dozunun, başarılı tümör gelişimi için 50.000 ila 500.000 hücre aralığında ayarlanması gerekebilir. Uygulamadan sonra, elektronik bir dijital kumpas kullanarak tümör uzunluğunu ve genişliğini haftada üç kez ölçün.Tümör hacmini hesaplayın ve metin yazısında açıklandığı gibi tümörler iki milimetrelik bir boyuta ulaştığında fareleri tümör aşısı ile tedavi edin. 160 kilovolt ve 25 miliamperde ayarlanmış bir x-ışını ışınlayıcısı kullanarak, hücreleri 150 gri gama ışını dozunda ışınlayın. Enjeksiyondan önce tripan mavisi boyama ile hücre canlılığını sayın ve kontrol edin.Farelere, orijinal tümör implantasyonu ile aynı kanatta 50 mikrolitre soğuk PBS'de 1 milyon ışınlanmış B16-Flt3L hücresi ile intradermally enjekte edin. İlk hücre implantasyonundan sonraki 3, 6 ve 9. günlerde primer tümör bölgesinden yaklaşık bir santimetre. Aşı enjeksiyon bölgelerini birincil tümörden ayırt etmek için renkli bir kalemle işaretleyin.Başlangıçta 50.000 B16-F10 hücresi implante edilmişse, aşı tedavisinin 8, 11 ve 14. günlerde yapılması önerilir. Tümörü her ötenazi fareden deri ile cerrahi olarak çıkardı ve 1 mililitre% 10 FBS RPMI 1640 orta ile 24 kuyucuklu bir plakaya koyun. Tümörleri iki mililitre sindirim tamponunda küçük parçalara ayırın ve 37 santigrat derecede 25 dakika boyunca inkübe edin.Sindirimi durdurmak için 10 mililitre% 10 FBS RPMI 1640 orta ekleyin. 25 mililitrelik serolojik pipet kullanarak hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine aktarın. Daha sonra dokuları öğütmek için bir mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanın.Hücreleri 500 RCF'de 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca santrifüj edin. Pelet, 1x konsantrasyona seyreltilmiş PBS'de% 40 yoğunluk gradyanı spesifik ortamın 5 mililitresinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu, PBS içeren %80 yoğunluk gradyanı spesifik ortamın 5 mililitresinin üzerine yavaşça ekleyin.Oda sıcaklığında 23 dakika boyunca düşük fren ayarı ile 325 RCF'deki hücrelere santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, lökosit tabakasını arayüzde% 40 ila% 80 yoğunluk gradyanı spesifik ortam arasında dikkatlice toplayın ve 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 500 RCF'de 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca santrifüj edin.Pelet, oda sıcaklığında beş dakika boyunca iki mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, RBC lizis tamponunu söndürmek için 10 mililitre% 10 FBS RPMI 1640 orta ekleyin. Hücreleri 400 RCF'de 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca santrifüj edin.Hücreleri 0.5 mililitre% 10 FBS RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın ve daha fazla analiz için kullanmadan önce toplam hücre sayısını sayın. Dalak veya drenaj lenf düğümlerini, akış sitometrisi analizi ile immün hücre alt kümelerinin geçit stratejisi için kontrol olarak toplayın. Metin makalesinde açıklanan hücre izolasyon yöntemini izleyin.İmplante edilen B16-F10 hücrelerinin görünür siyah bir noktası genellikle tümör implantasyonundan yaklaşık üç gün sonra cilt yüzeyinde gözlenmiştir. Fareler, tümör nodülünün iki milimetre boyutuna ulaşmasından veya aşmasından üç, altı ve dokuz gün sonra bir tümör aşısı ile tedavi edildi. Tümör implantasyonundan yaklaşık iki hafta sonra aşılanmış fare grubunda önemli bir tümör büyümesi azalması gözlendi.Lökosit tabakasından toplanan hücreler birçok tümör hücresi içeriyordu ve bu da lenfosit popülasyonunu kolayca tanımlamayı zorlaştırıyordu. Bu nedenle, akım sitometri analizinde intratümöral immün hücre alt gruplarının uygun geçişi için splenosit paralel olarak kullanıldı. CD103 pozitif, CD11C pozitif DC, CD8 pozitif, CD4 pozitif ve Treg'in geçiş stratejileri kompanzasyon matrisi ile birlikte çizildi.Edinilen hesapların temsili verileri ve her popülasyonun sıklığı da sağlanmıştır. İntratümöral CD103 pozitif, aşılanmış farelerden CD11C pozitif DC, yardımcı uyarıcı ligand CD86'nın anlamlı derecede yüksek bir ekspresyonunu gösterdi. Aşılanmış fareler ayrıca CD8 pozitif ve CD4 pozitif, Foxp3 negatif hücrelere ve ayrıca CD8 pozitif granzim B pozitif ve interferon gama pozitif CTL'lere sızan tümörde bir artış gösterdi.Primer tümör ve tümör aşısı arasında yeterli mesafeyi koruyun. Bu fiziksel ayrım, iki tümör implantı arasındaki potansiyel füzyonu önlemek için kritik öneme sahiptir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Orijinal Tümör Geliştirme Murin Deneysel Modeli ve Periton Metastaz<em&gt; yoluyla</emYumurtalık Kanseri Hücreleri ile&gt; Ortotopik aşılama

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Bir Fare Ortotopik Mesane Tümör Modeli ve Tümör Tespit Sistemi

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tümör Engraftment insan Mantle hücreli lenfoma, Xenograft fare modeli

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Bir melanom hasta-türetilen xenograft model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...