Name: visualizing subcellular localization of a protein in the heart using quantum dots-mediated immuno-labeling followed by transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-09-16T13:30:00
Duration: 8 min 13 s
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这项工作得到了美国国立卫生研究院资助的支持：R01HL145753、R01HL145753-01S1、R01HL145753-03S1和R01HL152723;MSB获得LSUHSC-S CCDS终点线奖，COVID-19研究奖和LARC研究奖;LSUHSC-S Malcolm Feist 心血管和 AHA CSA 博士后奖学金 （20POST35210789）;和 LSUHSC-S Malcolm Feist 博士前奖学金到 RA。

该协议中的动物处理程序符合实验动物护理和使用指南（第八版，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达），并得到路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特动物护理和使用委员会的批准。具有FVB / N背景的六个月大的雄性小鼠用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。将使用的小鼠饲养在调节良好的笼子环境中，允许12小时的明暗循环，提供水和随意的 常规食物饮食，并根据NIH实验动物护理和使用指南进行护理。 整个过程如图 1 所示。
1. 动物制备
<ol><li>使用3%异氟醚麻醉小鼠。通过在中腹部上方的区域做一个水平切口并拉扯皮肤来打开胸部。小心地，做另一个切口以打开胸腔，而不刺穿任何其他器官21，22，23。<ol><li>首先通过心尖灌注24 心脏，然后使用冷的3%戊二醛在心脏停搏溶液（50mM KCl，PBS中的5%葡萄糖，参见 补充文件1）中灌注24个心脏，以确保完全心肌松弛。</li>
	</ol></li>
	<li>使用冰冷的3%戊二醛在0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4，步骤2.1.1）中灌注心脏2分钟。使用重力压力，使用 25 G 5/8“ 针将固定剂引入心脏。在心脏开始充满固定剂后，立即抬起心脏的顶端，并在距离心脏1-2毫米处切开下面的血管，以减轻压力并让液体排出。</li>
	<li>解剖心脏，取出心房24，并将心室放入培养皿中的冰冷的3%戊二醛/ 0.1M二甲胂酸钠中。固定30-60分钟后切开蝴蝶，并将其放入含有3%戊二醛/二甲胂酸的培养皿中（见 材料表）。在戊二醛/二甲胂酸溶液中，使用手术刀片在 1 mm3 的小立方体中切碎心脏。</li>
	<li>将解剖的心脏组织固定/浸入戊二醛/二甲胂酸盐溶液中，在4°C下24小时。</li>
</ol>2. 心脏组织加工
<ol><li>固定24小时后，在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中洗涤组织20分钟。<ol><li>按照以下步骤制备0.1 M二甲胂酸盐缓冲液。<ol><li>要制备0.1 M二甲胂酸钠缓冲液，通过将二甲胂酸钠（21.4g）和1%氯化钙溶液（3mL）溶解在90 mL蒸馏水中来制备1 M二甲胂酸钠缓冲液的储备。通过加入蒸馏水将溶液体积提高到 100 mL。充分搅拌溶液，放置过夜以溶解溶质。</li>
			<li>接下来，取 10 mL 的 1 M 二甲胂酸钠储备溶液，并将其加入 80 mL 蒸馏水中。使用 HCl 将 pH 值调节至 7.4，并通过加入蒸馏水将其体积提高到 100 mL。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中重复洗涤20分钟。从二甲胂酸钠缓冲液中取出组织，并在室温下将其浸入2%四氧化锇溶液中4小时。这个过程称为振荡。<ol><li>按照以下步骤制备2%四氧化锇溶液。<ol><li>要制备2%四氧化锇溶液，请取4%四氧化锇溶液，4mL（见 材料表），1M二甲胂酸钠储备溶液（0.8mL）和蒸馏水（3.2mL）制成总共8mL溶液。 注意：整个过程和从此开始的步骤必须在通风橱中进行。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>渗透后，将组织在室温下浸入2%乙酸钠溶液中10分钟。<ol><li>通过将4g乙酸钠溶解在20mL蒸馏水中来制备2%乙酸钠溶液。</li>
	</ol></li>
	<li>接下来，在室温下将组织浸入2%乙酸铀酰溶液中1小时。<ol><li>通过将4g乙酸铀酰溶解在20mL蒸馏水中来制备2%乙酸铀酰溶液。</li>
	</ol></li>
	<li>乙酸铀酰染色后，按 补充文件1中提到的顺序依次通过分级醇和丙酮使组织脱水。</li>
</ol>3. 心脏组织包埋
<ol><li>按照以下步骤将脱水组织嵌入低粘度环氧树脂中。<ol><li>要制备低粘度环氧树脂，请在 50 mL 管中混合 10.24 mL 乙烯基二氧化环己烯 （ERL 4221） 环氧单体、6.74 mL 聚丙烯二缩水甘油醚 （DER 732） 和 30.05 mL 壬烯基琥珀酸酐 （NSA）（参见 材料表）。用手搅拌悬浮液2分钟。</li>
		<li>加入18滴2-二甲氨基乙醇（DMAE，见 材料表）环氧促进剂，搅拌悬浮液以充分混合组分。</li>
		<li>按以下混合物顺序将组织浸渍在环氧树脂中。<ol><li>用1：1树脂：丙酮悬浮液替换100%丙酮，并在室温下将组织浸入其中1小时。</li>
			<li>用6：1树脂：丙酮悬浮液替换1：1树脂：丙酮悬浮液，并将组织浸入其中3小时。</li>
			<li>最后，用100%树脂悬浮液替换6：1树脂：丙酮悬浮液，并将组织浸入室温下过夜。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>将组织放入8mm微模具中的新鲜树脂中（参见 材料表），并在70°C下将嵌入的组织固化过夜。 注意：确保树脂固化后坚硬但不脆。</li>
</ol>4. 使用超切片机进行组织切片
<ol><li>在安装在超薄切片机上之前，用组织修剪树脂块至不超过 1 毫米（参见 材料表）。将模具尽可能精确地放置在超薄切片机的分段臂中，并手动将样品模具推向金刚石刀。</li>
	<li>用Histo刀（见 材料表）切割厚度为500纳米（半微米）的切片，并使用EM环工具将它们拾起并放在载玻片上。</li>
	<li>将载玻片放在热板上进行甲苯胺蓝染色25 以找到感兴趣的区域。</li>
	<li>找到感兴趣的区域后，使用Ultra 45°刀（参见 材料表）产生淡金色超薄切片（100 nm）。将这些超薄部分放在 200 目铜网格的暗淡侧。</li>
</ol>5. 超薄心脏切片染色
<ol><li>通过使用蚀刻溶液（即5%偏高碘酸钠溶液）揭开抗原来开始染色。<ol><li>在蒸馏水中制备500μL的5%偏高碘酸钠（参见 材料表）溶液。 注意：使用前准备新鲜溶液。</li>
		<li>将 20 μL 间高碘酸钠溶液放在干净的石蜡膜上。将带有组织切片的完全干燥的网格放在蚀刻溶液的液滴上。 注意：带有组织部分的网格的暗淡面必须朝向蚀刻溶液。</li>
		<li>在室温下将截面网格留在溶液上30分钟。</li>
	</ol></li>
	<li>通过将蚀刻的组织切片放在一滴蒸馏水上60秒来洗涤蚀刻的组织切片。</li>
	<li>通过在室温下将切片网格放在0.05M甘氨酸溶液的液滴上10分钟来阻止残留醛。在滤纸上吸干网格的边缘以去除残留的甘氨酸溶液。<ol><li>通过将 3.75 mg 甘氨酸溶解在 1 mL 的 1x PBS （pH 7.4） 中来制备 0.05 M 甘氨酸溶液（参见 材料表）。</li>
	</ol></li>
	<li>将切片网格置于室温下10-20μL封闭溶液中25分钟。 注意：封闭溶液组成：2 μL 1% 正常山羊血清 （NGS） + 20 μL 1% BSA（终浓度：10%）+ 178 μL 1x PBS （pH 7.4），使最终体积为 200 μL。</li>
	<li>在滤纸上吸干网格边缘，并将网格部分放在抗体稀释剂上以在室温下调节10分钟。</li>
	<li>将网格切片与一抗（在这种情况下为Sigmar1，参见 材料表;在抗体稀释剂中以1：10稀释）在加湿室中孵育1小时30分钟。</li>
	<li>吸干网格并用抗体稀释剂洗涤网格部分两次，每次5分钟。</li>
	<li>用生物素化的二抗（在这种情况下，生物素化的山羊抗兔多克隆二抗，参见 材料表;在抗体稀释剂中以1：10稀释）在加湿室中孵育网格部分1小时。</li>
	<li>吸干网格并用抗体稀释剂洗涤网格部分两次，每次5分钟。</li>
	<li>在室温下的加湿室中，将网格切片在市售链霉亲和素偶联的QD（QD655nm，参见 材料表;在抗体稀释剂中以1：10稀释）中孵育1小时。用铝箔覆盖腔室来防止暴露在光线下。</li>
	<li>使用滤纸吸干网格边缘，并通过将它们放在水滴上2分钟来洗涤网格部分。</li>
	<li>吸干网格的边缘以干燥。</li>
</ol>6. 透射电子显微镜（TEM）成像
<ol><li>将超薄切片放在铜栅上，放在试样四重奏支架中，并将它们夹在允许在电子束中选择栅极的位置。</li>
	<li>将标本支架插入显微镜色谱柱中，接合泵开关以抽空测角仪，然后将样品支架完全插入显微镜柱中（参见 材料表）。</li>
	<li>在产生用于图像观察的光束之前，将电压设置为 80 kV。</li>
	<li>对焦于所需区域，使用高速数码相机捕获图像，并以.tif格式保存文件。 注意：本研究中用于捕获图像的显微镜设置为80 kV的加速电压或高压电压和20，000倍的放大倍率。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

在本研究中，QD介导的免疫标记用于独特地显示Sigmar1的亚细胞定位。使用QD，Sigmar1在线粒体膜上的定位，特别是线粒体内膜，被描绘在心脏组织中。此外，还发现Sigmar1位于肌质/内质网（S/ER）和超微结构水平的溶酶体上，如图2A-D所示。
该方案中的一个关键步骤是使用高浓度的偏高碘酸钠溶液进行蚀刻或抗原揭开步骤，以在戊二醛固定和渗透后揭开抗原。该方案在室温下使用高浓度（5%）偏高碘酸钠的单次处理30分钟。此步骤需要格外小心，因为偏高碘酸钠孵育的持续时间较长或浓度较高会导致结构聚集，细胞器膜清晰度丧失，并导致切片穿孔，难以可视化蛋白质或结构。或者，也可以使用较低浓度的（3%）偏高碘酸盐溶液分两步30分钟代替5%偏高碘酸盐。研究表明，这种选择与5%偏高碘酸盐溶液进行一步30分钟孵育的结果相似。然而，3%偏高碘酸盐溶液孵育30分钟两次提供了对过程的更好控制26，27，28。最初，该协议使用用10%偏高碘酸盐溶液孵育切片30分钟。然而，由于该浓度在组织切片中产生的穿孔过多，间高碘酸盐溶液的最终浓度和孵育持续时间逐渐减少并优化至5%30分钟。
另一个步骤需要用戊二醛优化固定时间。组织固定欠佳导致QD标记不足，而组织过度固定导致非特异性标记较高。因此，在确定和滴定最佳组织固定水平时，必须仔细考虑正确和特异性的蛋白质标记。在该方法中使用心脏组织，以24小时和48小时为时间点滴定戊二醛固定时间。基于两个时间点固定切片的染色图像，发现固定24小时的切片显示出更好的结果。迄今为止，QD纳米晶体有多种尺寸可供选择，包括525、565、585、605、655和705 nm11，29。这些QD中的每一个都有自己的发射光谱，并发出不同波长的荧光。此外，这些不同尺寸的市售量子点显示出不同的形状;例如，QD 525、565 和 585 实际上是不同尺寸的球形，而 QD 605、655 和 705 是不规则的长方形。在这些不同的QD纳米晶体中，QD 525，565和655很容易彼此区分11，29。发射光谱和形状的这些差异使QD成为蛋白质多重标记以及荧光和电子显微镜可视化的绝佳候选者。在这项研究中，使用市售QD 655标记Sigmar1蛋白，以将其与染色切片中的任何非特异性背景区分开来。
在高分辨率显微镜中用于蛋白质标记的QD的另一个对应物是免疫金颗粒。免疫金颗粒传统上用于标记用于高分辨率显微镜的蛋白质。与QD纳米晶体相比，这些金颗粒具有高电子密度且易于识别。然而，QD表现出更高的效率，更好的组织渗透性，更高的稳定性和保质期，以及更好的超微结构组分保留，使其成为蛋白质标记的更好候选者4，5。QD还具有通过光学和电子显微镜检测的独特能力，这增加了其相对于免疫金标记10的价值。
这种QD介导的免疫标记的一个局限性是在加工过程中使用四氧化锇。四氧化锇用于增加电子密度较低且对比度较低的生物膜结构的电子密度、电导率和对比度5，30。然而，当用QD6标记时，使用四氧化锇会瞬间且不可逆地破坏样品的性质以产生荧光。这限制了QD在荧光显微镜中的使用。一种不使用四氧化锇的替代方法将有利于保留荧光特性，从而有利于QD介导的免疫标记的双重应用。一些较新的TEM型号可以选择连接能量色散X射线分析（EDX）系统，该系统可以识别材料的元素组成。该研究的另一个局限性是缺乏使用EDX的样品和图像分析的元素映射。因此，未来的研究应侧重于QD光谱的EDX分析，以分析元素组成。
蛋白质的QD标记近年来引起了很多关注。QD在生物研究和医学治疗方面具有多种应用和优势。另外用聚齿状配体包裹的QD表现出更高的稳定性，保持了量子产率。此外，用这些生物有利试剂包封QD也增加了其在组织中的生物利用度，使其成为检测肿瘤，活细胞成像，药物递送和组织成像的潜在应用的良好候选者3，31，32。

人体由许多蛋白质组成，负责许多身体机能。蛋白质的功能在很大程度上取决于它们在器官和细胞器中的定位。几种技术，包括亚细胞分离、免疫荧光和洗涤剂介导的蛋白质提取，通常用于确定蛋白质的亚细胞定位1，2。使用免疫荧光染料的显微镜是这些技术中使用最广泛的方法。然而，该技术中使用的荧光染料不太稳定，并且容易发生光漂白3。其他技术涉及高分辨率显微镜，通过用电子致密重金属（金、铁蛋白）或量子点纳米晶体对蛋白质进行免疫标记，然后在超微结构水平上可视化蛋白质，然后使用透射电子显微镜（TEM）4，5。
QD是由半导体金属化合物组成的半导体纳米晶，具有可控的光致发光性能，在生物系统中具有重要意义3。QD纳米晶体以核壳形式制成，其中纳米晶体被封装在纳米晶体的形成中，以确保其适当的稳定性和功能。常用的核壳纳米晶体组合是CdSe/ZnS，CdSe / CdS CdSe / ZnSe，CdTe / CdS，CdTe / ZnS和CdTe / CdS / ZnS（核/壳/壳）3。在这些纳米晶体组合中，CdSe/ZnS和CdSe/CdS的研究最为活跃，并经常用作二抗偶联物3，6。这些QD纳米颗粒还具有与传统荧光团不同的激发和发射光谱的荧光特性。与传统荧光团相比，QD利用本体价带激发电子，表现出更高的荧光量子产率。半导体金属的纳米晶体排列使QD介导的标记更加稳定和耐光漂白6。此外，QD中的纳米晶芯及其晶体结构允许不同尺寸的QD具有宽范围的吸收光谱和非常窄的发射峰7。此外，这些QD颗粒足够大以产生高电子密度，使它们可用于高分辨率显微镜技术，包括透射电子显微镜5，8，9。这些QD纳米晶体还具有多种尺寸，具有不同的荧光发射光谱和形状，使其成为用多种抗体标记10，11的绝佳候选者。
QD技术具有多种功能特性，包括用于活细胞成像，研究细胞中的运输机制，蛋白质扩散运动的膜转运，细胞的功能异质性以及细胞内细胞器的标记3，12，13，14，15，16，QD技术在生物学研究中具有重要意义.QD还可用于分子诊断，用于靶向和检测癌症组织，表征肿瘤的分子谱和免疫状态，以及可视化玻璃体和视网膜前膜3，17，18。此外，QD还可用于医学治疗，通过光动力疗法治疗肿瘤恶性肿瘤，并通过向眼睛输送药物来治疗眼科异常3，17，18，19。
利用这些非常有用的QD纳米晶体，本研究确定了名为Sigma 1受体（Sigmar1）的蛋白质的亚细胞定位。Sigmar1是一种普遍表达的多任务分子伴侣蛋白。针对Sigmar1在不同组织和器官中的亚细胞定位的广泛研究报告了引起分子功能的细胞和组织类型特异性亚细胞定位20。在使用不同生化方法的不同细胞（神经元、光感受器和免疫细胞）和组织（肝脏和大脑）中，研究报告了 Sigmar1 在内质网 （ER）、线粒体相关 ER 膜 （MAM）、核包膜、质膜、核质网、细胞核和线粒体上的定位。尽管进行了所有这些研究，但Sigmar1在心脏中的亚细胞定位仍然未知20。因此，使用QD介导的免疫标记和TEM成像确定Sigmar1在心脏组织中的亚细胞定位。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 Mesh copper grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G200HH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-month-old male mice with FVB/N background</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 100%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sigmar1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>61994S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSAc (10%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>25557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal Xyl</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DER 732C36AA10:C33</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Histo; Ultra 450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAE</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEOL-1400 Flash</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERL 4221</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A405P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 3%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16538-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromolds</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metaperiodate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (size 10)</td>
			<td>Aspen surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM&#160; image software</td>
			<td>AMT-V700</td>
			<td>AMT TEM imaging systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM imaging camera</td>
			<td>XR80 TEM series</td>
			<td>AMT TEM imaging systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O solution (0.5%)</td>
			<td>Fisher Scientic</td>
			<td>S25612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing subcellular localization of a protein in the heart using quantum dots-mediated immuno-labeling followed by transmission electron microscopy

亚细胞定位对于描述特定蛋白质的正常功能和确定分子机制至关重要。几种定性和定量技术用于确定蛋白质的亚细胞定位。确定蛋白质亚细胞定位的新兴技术之一是量子点（QD）介导的蛋白质免疫标记，然后用透射电子显微镜（TEM）对其进行成像。QD是一种半导体纳米晶体，具有晶体结构和高电子密度的双重性质，使其适用于电子显微镜。目前的方法在超微结构水平上使用QD-TEM在心脏组织中可视化Sigma 1受体（Sigmar1）蛋白的亚细胞定位。将来自野生型小鼠的心脏组织切片的小立方体固定在3%戊二醛中，随后渗透，用乙酸铀酰染色，然后用乙醇和丙酮顺序脱水。将这些脱水的心脏组织切片嵌入低粘度环氧树脂中，切成500nm厚的薄切片，放在网格上，随后用5%偏高碘酸钠进行抗原揭开，然后用甘氨酸淬灭残留醛。封闭组织，然后在一抗、生物素化二抗和链霉亲和素偶联QD中依次孵育。将这些染色切片进行印迹干燥并使用TEM在高放大倍率下成像。QD-TEM技术允许在心脏的超微结构水平上可视化 Sigmar1蛋白的亚细胞定位。这些技术可用于可视化任何器官系统中任何蛋白质和亚细胞定位的存在。

目前的QD-TEM方法通过在成年小鼠超薄心脏切片上执行抗Sigmar1靶向QD标记，可视化了Sigmar1的存在及其在亚细胞心脏区室上的定位。QD-TEM图像说明了线粒体膜（内膜和外膜）、溶酶体和内质网/肌质网（ER/SR）膜-线粒体界面上的电子致密抗Sigmar1标记的QD（图2A，B）。此外，心脏切片还用兔IgG和QD标记，作为抗Sigmar1兔一抗的同种型对照（图2C，D）。因此，QD-TEM成像突出了内源性Sigmar1的定位及其主要在溶酶体和线粒体膜上的富集。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig01.jpg"> 图 1：示意图显示了用于执行 QD-TEM 的顺序步骤和程序。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig02.jpg"> 图2：成年小鼠心脏组织中的Sigmar1免疫标记QD 。 （A，B）代表性的TEM图像显示线粒体（外膜和内膜），线粒体相关内质网（ER）/肌质网（SR）膜和溶酶体上的Sigmar1标记QD。（中，四）用QD和兔IgG标记的同种型对照的心脏切片的TEM图像。比例尺：200 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
补充文件1：PBS和其他用于组织脱水的溶液的组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

本协议描述了一种使用量子点在心脏组织切片中免疫标记蛋白质的方法。该技术提供了一种有用的工具，可以在超微结构水平上可视化任何蛋白质的亚细胞定位和表达。

使用量子点介导的免疫标记，然后通过透射电子显微镜可视化心脏中蛋白质的亚细胞定位

The subcellular localization is critical to delineating proper function and determining the molecular mechanisms of a particular protein. Several ...

确定蛋白质的亚细胞定位对于描述其正常功能和参与其中的机制至关重要。这种方法可以帮助我们在超结构水平上可视化蛋白质的亚细胞定位。量子点介导的免疫标记更稳定，抗光漂白，具有自己的发射光谱，产生高电子密度，并且在组织中表现出更高的效率和保留性，在组织中的渗透性更好。该过程的多个步骤，即固定、蚀刻、阻塞和最佳量子点浓度，是优化具有挑战性的步骤。建议尝试所用试剂的多个时间点和浓度。另一个挑战是处理网格，只有耐心，当然还有练习才能解决。展示该程序的将是邮政研究员Chowdhury Abdullah，我实验室的研究生Naznin Remex和我们电子显微镜服务的电子显微镜主管Brandon Hartman。麻醉小鼠并打开胸腔后，使用冰冷的3%戊二醛在0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液中大量注射心脏两分钟。使用5×8英寸的25号针，利用重力压力将固定剂引入心脏。在心脏开始充满固定剂后，立即抬起心脏的顶点以缓解压力。在距离心脏一到两毫米的地方切开下面的血管，让液体排出。解剖心脏。取出心房并将心室放入含有冰冷的3%戊二醛和0.1摩尔二甲胂酸钠的培养皿中。固定 30 到 60 分钟后切开蝴蝶，然后将心室放回培养皿中。使用一立方毫米的小立方体手术刀片切碎心脏。将解剖的心脏组织固定并浸入戊二醛和二甲胂酸盐溶液中，在4摄氏度下24小时。固定24小时后，在0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液中洗涤组织两次，持续20分钟。从二甲胂酸钠缓冲液中取出组织，并在室温下浸入2%四氧化锇溶液中四小时。渗透后，将组织在室温下浸入2%乙酸钠溶液中10分钟。接下来，将组织在室温下浸入2%乙酸铀酰溶液中一小时。乙酸铀酰染色后，通过分级醇和丙酮依次使组织脱水。如手稿中所述，将脱水组织嵌入低粘度环氧树脂中。将纸巾放入8毫米微模具中的新鲜树脂中，并在70摄氏度下固化过夜。找到感兴趣的区域后，使用超45度刀，产生淡金色超薄切片。将这些超薄部分放在 200 目铜网格的暗淡侧。通过将20微升蚀刻液中高碘酸盐放在干净的石蜡膜上来揭开抗原，从而开始染色。将带有组织切片的干燥网格放在蚀刻溶液的液滴上。在室温下将截面网格留在溶液上30分钟。通过将蚀刻的组织切片放在蒸馏水滴上60秒来洗涤它们。通过在室温下将切片网格放在0.05摩尔甘氨酸溶液的液滴上10分钟来阻止残留醛。在滤纸上吸干网格的边缘以去除残留的甘氨酸溶液。将切片网格置于室温下10至20微升封闭溶液中25分钟。在滤纸上吸干网格边缘，并将网格部分放在抗体稀释剂上，在室温下调节10分钟。用一抗孵育网格切片在加湿室中孵育一小时30分钟。吸干网格并用抗体稀释剂洗涤网格部分两次，每次五分钟。用生物素化的二抗在加湿室中孵育网格部分一小时。网格干燥后，用抗体稀释剂洗涤网格部分两次，每次五分钟。在室温下在市售链霉亲和素偶联QD中孵育网格部分一小时。用铝箔覆盖腔室来防止暴露在光线下。使用滤纸吸干网格边缘后，通过将网格部分放在水滴上两分钟来清洗网格部分，然后吸干网格边缘以干燥。将标本支架插入显微镜柱中，接合泵开关以评估测角仪，然后将标本支架完全插入显微镜柱中。专注于所需的区域。使用高速数码相机捕获图像并以tif格式保存文件。线粒体膜、溶酶体和内质网或肌质网膜线粒体界面显示存在 Sigmar1 标记的量子点。使用兔免疫球蛋白G和量子点作为抗Sigmar1兔一抗的同种型对照观察心脏切片。在制定此协议时要考虑的一件重要事情是揭示抗原的暴露时间。如果组织切片蚀刻时间过长，偏高周期溶液将在薄组织切片中产生穿孔。量子点介导的标记在肿瘤检测、肿瘤分子和免疫状态分析以及组织成像方面受到关注，为医学诊断铺平了一条新途径。量子点也可用于通过光动力疗法治疗肿瘤，并通过向眼睛输送药物来治疗眼科异常。

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In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

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高压冷冻、微波辅助对比度增强和最小树脂嵌入在体积成像中的生物样品制备

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...