Name: visualizing subcellular localization of a protein in the heart using quantum dots-mediated immuno-labeling followed by transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-09-16T13:30:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy at JoV

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1, और R01HL152723; एलएसयूएचएससी-एस सीसीडीएस फिनिश लाइन अवार्ड, कोविड-19 रिसर्च अवार्ड और एमएसबी को एलएआरसी रिसर्च अवार्ड; एलएसयूएचएससी-एस मैल्कम फिस्ट कार्डियोवैस्कुलर और सीएसए के लिए एएचए पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप (20POST35210789); और एलएसयूएचएससी-एस मैल्कम फिस्ट आरए के लिए प्री-डॉक्टरेट फैलोशिप।

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	<li>Lidke, D. S., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+imaging+-+techniques+for+three-dimensional+imaging+of+cellular+structures.">Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures.</a> Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).</li><li>de Duve, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+fraction-past+and+present.">Tissue fraction-past and present.</a> The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20 (1971).</li><li>Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E., Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. , 323-334 (2018).</li><li>Mayhew, T. M., M&#252;hlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).</li><li>Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+EM+of+non-heavy+metal+stained+biosamples:+Large-field+of+view,+high+contrast+and+highly+efficient+immunolabeling.">Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling.</a> Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).</li><li>Deerinck, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+fluorescent+quantum+dots+to+confocal,+multiphoton,+and+electron+microscopic+imaging.">The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).</li><li>Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantum+dots+as+probes+for+correlative+fluorescence,+conventional,+and+energy-filtered+transmission+electron+microscopy.">Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+for+live+cells,+in+vivo+imaging,+and+diagnostics.">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307 (5709), 538-544 (2005).</li><li>Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-+and+electron+microscopy+using+quantum+dot+nanoparticles.">Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54307 (2016).</li><li>Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H., Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantum Dots: Applications in Biology. , 43-53 (2007).</li><li>Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).</li><li>Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+ligands+provide+new+insights+into+erbB/HER+receptor-mediated+signal+transduction.">Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction.</a> Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).</li><li>Pleskova, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+functional+activity+of+human+neutrophilic+granulocytes+in+their+interactions+with+semiconductor+quantum+dots.">Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots.</a> Morfologiia. 135 (3), 47-49 (2009).</li><li>Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+single+molecule+tracking+reveals+a+wide+range+of+diffusive+motions+of+membrane+transport+proteins.">Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins.</a> Proceedings of SPIE. 7189, (2009).</li><li>Hanaki, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiconductor+quantum+dot/albumin+complex+is+a+long-life+and+highly+photostable+endosome+marker.">Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).</li><li>Lim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).</li><li>Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cancer+targeting+and+imaging+with+semiconductor+quantum+dots.">In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).</li><li>&#197;kerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanocrystal+targeting+in+vivo.">Nanocrystal targeting in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).</li><li>Sarwat, S. A. -. O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+ophthalmology:+A+literature+review.">Quantum dots in ophthalmology: A literature review.</a> Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).</li><li>Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigmar1's+molecular,+cellular,+and+biological+functions+in+regulating+cellular+pathophysiology.">Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology.</a> Frontiers in Physiology. 12, 705575 (2021).</li><li>Bohne, B., Harding, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).</li><li>Roszkowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-protocol. 11 (5), 3988 (2021).</li><li>Jones, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+murine+alpha+myosin+heavy+chain+gene+leads+to+dosage+effects+and+functional+deficits+in+the+heart.">Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).</li><li>Hunter, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , (1993).</li><li>Morris, R. E., Ciraolo, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+post-embedding+protocol+for+immunogold+labelling+of+osmium-fixed,+epoxy+resin-embedded+tissue.">A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue.</a> Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).</li><li>Brorson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deplasticizing+or+etching+of+epoxy+sections+with+different+concentrations+of+sodium+ethoxide+to+enhance+the+immunogold+labeling.">Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling.</a> Micron. 32 (2), 101-105 (2001).</li><li>Lobo, M. V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+Staining+with+Sodium+Metaperiodate+and+Sodium+Borohydride.">Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).</li><li>Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiconductor+nanocrystals+as+fluorescent+biological+labels.">Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels.</a> Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugated+quantum+dots+for+in+vivo+molecular+and+cellular+imaging.">Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).</li><li>Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutical+applications+of+quantum+dots.">Pharmaceutical applications of quantum dots.</a> AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233 (2021).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

वर्तमान अध्ययन में, क्यूडी-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग का उपयोग सिगमार 1 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को विशिष्ट रूप से दिखाने के लिए किया गया था। क्यूडी का उपयोग करते हुए, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली, विशेष रूप से आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली पर सिगमार 1 के स्थानीयकरण को हृदय ऊतक में चित्रित किया गया था। इसके अतिरिक्त, सिगमार 1 को अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर सारकोप्लाज्मिक / एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एस / ईआर) और लाइसोसोम पर भी स्थित पाया गया था, जैसा कि चित्र 2 ए-डी में दिखाया गया है।
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम ग्लूटारैल्डिहाइड निर्धारण और ऑस्मिकेशन के बाद एंटीजन को हटाने के लिए अत्यधिक केंद्रित सोडियम मेटापीरियोडेट समाधान का उपयोग करके नक़्क़ाशी या एंटीजन अनमास्किंग चरण है। इस प्रोटोकॉल ने कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सोडियम मेटापीरियडेट की उच्च एकाग्रता (5%) के साथ एक एकल उपचार का उपयोग किया। सोडियम मेटापीरियडेट के लिए लंबी अवधि या उच्च एकाग्रता के रूप में इस चरण में अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है इनक्यूबेशन परिणामस्वरूप संरचनाओं का एकत्रीकरण, ऑर्गेनेल के लिए झिल्ली की परिभाषा का नुकसान और अनुभाग में छिद्रण का कारण होगा, जिससे प्रोटीन या संरचना की कल्पना करना मुश्किल हो जाएगा। वैकल्पिक रूप से, 30 मिनट के लिए दो चरणों में (3%) मेटापीरियडेट समाधान की कम सांद्रता का उपयोग 5% मेटापीरियोडेट के बजाय भी किया जा सकता है। अध्ययनों ने इस विकल्प को एक-चरण 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए 5% मेटापीरियडेट समाधान के समान परिणाम प्रदर्शित करने के लिए दिखाया है। हालांकि, दो बार के लिए 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए 3% मेटापीरियडेट समाधान प्रक्रिया 26,27,28 पर बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है। प्रारंभ में, इस प्रोटोकॉल ने 30 मिनट के लिए 10% मेटापीरियडेट समाधान के साथ अनुभागों के इनक्यूबेशन का उपयोग किया। हालांकि, इस एकाग्रता द्वारा ऊतक अनुभाग में बनाए गए बहुत सारे छिद्रों के कारण, मेटापीरियडेट समाधान की अंतिम एकाग्रता और इनक्यूबेशन अवधि को कम कर दिया गया और 30 मिनट के लिए 5% तक अनुकूलित किया गया।
एक अन्य कदम के लिए ग्लूटारल्डिहाइड के साथ निर्धारण समय के अनुकूलन की आवश्यकता थी। ऊतकों के उप-निर्धारण के परिणामस्वरूप अपर्याप्त क्यूडी लेबलिंग होती है, जबकि ऊतकों के अधिक निर्धारण के परिणामस्वरूप उच्च गैर-विशिष्ट लेबलिंग होती है। इसलिए, प्रोटीन के उचित और विशिष्ट लेबलिंग के लिए ऊतक निर्धारण के इष्टतम स्तर को निर्धारित करने और निर्धारित करने में सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। हृदय के ऊतकों का उपयोग करके इस विधि में, ग्लूटारल्डिहाइड के साथ निर्धारण समय को टाइमपॉइंट के रूप में 24 घंटे और 48 घंटे का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। दोनों टाइमपॉइंट के लिए तय किए गए अनुभागों की धुंधला छवियों के आधार पर, यह पाया गया कि 24 घंटे के लिए तय किए गए अनुभागों ने बेहतर परिणाम प्रदर्शित किए। आज तक, क्यूडी नैनोक्रिस्टल कई आकारों में उपलब्ध हैं, जिनमें 525, 565, 585, 605, 655 और 705 एनएम11,29 शामिल हैं। इनमें से प्रत्येक क्यूडी का अपना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है और विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न आकारों के ये व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्यूडी विभिन्न आकृतियों को प्रदर्शित करते हैं; उदाहरण के लिए, QD 525, 565, और 585 विभिन्न आकारों के साथ लगभग गोलाकार हैं, जबकि QD 605, 655 और 705 अनियमित आयताकार आकार के हैं। इन विभिन्न क्यूडी नैनोक्रिस्टल में से, क्यूडी 525, 565 और 655 एक दूसरे से आसानी से अलग हैं11,29। उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और आकृतियों में ये अंतर क्यूडी को प्रोटीन के बहु-लेबलिंग और प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक महान उम्मीदवार बनाते हैं। इस अध्ययन में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्यूडी, क्यूडी 655 का उपयोग सिगमार 1 प्रोटीन को लेबल करने के लिए किया गया था ताकि इसे दाग वाले वर्गों में किसी भी गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि से अलग किया जा सके।
उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में प्रोटीन लेबलिंग के लिए क्यूडी का एक और समकक्ष इम्यूनोगोल्ड कण है। इम्यूनोगोल्ड कणों का उपयोग पारंपरिक रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन को लेबल करने के लिए किया जाता है। ये सोने के कण क्यूडी नैनोक्रिस्टल की तुलना में अत्यधिक इलेक्ट्रॉन-घने और आसानी से पहचाने जाने योग्य हैं। हालांकि, क्यूडी ऊतकों में बेहतर प्रवेश, उच्च स्थिरता और शेल्फ जीवन, और अल्ट्रास्ट्रक्चरल घटकों के बेहतर प्रतिधारण के साथ बेहतर दक्षता प्रदर्शित करता है, जिससे उन्हें प्रोटीन लेबलिंग 4,5 के लिए बेहतर उम्मीदवार बना दिया जाता है। क्यूडी में प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दोनों द्वारा पता लगाने की एक अनूठी क्षमता भी है, जो इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग10 पर इसके मूल्य को जोड़ती है।
इस क्यूडी-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग की एक सीमा प्रसंस्करण के दौरान ऑस्मियम टेट्रोक्साइड का उपयोग है। ऑस्मियम टेट्रोक्साइड का उपयोग इलेक्ट्रॉन घनत्व, चालकता और अन्यथा कम इलेक्ट्रॉन-घने और कम विपरीत जैविक झिल्ली संरचनाओं 5,30 के विपरीत को बढ़ाने के लिए किया जाता है। हालांकि, ऑस्मियम टेट्रोक्साइड का उपयोग तुरंत और अपरिवर्तनीय रूप से क्यूडी6 के साथ लेबल किए जाने पर प्रतिदीप्ति बनाने के लिए नमूने की संपत्ति को नष्ट कर देता है। यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में क्यूडी के उपयोग को सीमित करता है। ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के उपयोग को छोड़ने वाला एक वैकल्पिक दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट गुणों को बनाए रखने में फायदेमंद होगा और इसलिए क्यूडी-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग का दोहरा अनुप्रयोग होगा। टीईएम के कुछ नए मॉडलों में ऊर्जा फैलाने वाले एक्स-रे विश्लेषण (ईडीएक्स) प्रणाली को संलग्न करने का विकल्प है जो सामग्री की मौलिक संरचना की पहचान की अनुमति देता है। अध्ययन की एक और सीमा ईडीएक्स का उपयोग करके एक नमूने और छवि विश्लेषण के मौलिक मानचित्रण की कमी है। इसलिए, भविष्य के अध्ययनों को मौलिक संरचना का विश्लेषण करने के लिए क्यूडी स्पेक्ट्रा के ईडीएक्स विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए।
प्रोटीन के क्यूडी लेबलिंग ने हाल के दिनों में बहुत ध्यान आकर्षित किया है। क्यूडी जैविक अनुसंधान और चिकित्सा चिकित्सा विज्ञान दोनों में कई अनुप्रयोग और फायदे प्रदान करता है। क्यूडी को पॉलीडेंट लिगैंड के साथ लपेटने से क्वांटम उपज को बनाए रखने में स्थिरता में वृद्धि होती है। इसके अलावा, इन जैव-अनुकूल एजेंटों के साथ क्यूडी को संलग्न करने से ऊतकों में इसकी जैव उपलब्धता भी बढ़ जाती है, जिससे यह ट्यूमर, लाइव-सेल इमेजिंग, दवा वितरण और ऊतक इमेजिंग3,31,32 का पता लगाने में संभावित अनुप्रयोग के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बन जाता है।

मानव शरीर कई शारीरिक कार्यों के लिए जिम्मेदार कई प्रोटीनों से बना है। प्रोटीन का कार्य काफी हद तक अंग और सेलुलर ऑर्गेनेल में उनके स्थानीयकरण पर निर्भर करता है। उपकोशिकीय विभाजन, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और डिटर्जेंट-मध्यस्थता प्रोटीन निष्कर्षण सहित कई तकनीकों का उपयोग आमतौर पर प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण 1,2 को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी इन तकनीकों में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। हालांकि, इस तकनीक में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट रंजक कम स्थिर हैं और फोटोब्लीचिंग3 के लिए प्रवण हैं। अन्य तकनीकों में इलेक्ट्रॉन-घने, भारी धातुओं (सोना, फेरिटिन) या क्वांटम डॉट्स नैनोक्रिस्टल के साथ इम्यूनोलेबलिंग प्रोटीन द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर प्रोटीन की कल्पना करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी शामिल थी और इसके बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 4,5 का उपयोग करके उन्हें कल्पना की गई थी।
क्यूडी एक अर्धचालक नैनोक्रिस्टल है जो अर्धचालक धातु यौगिकों से बना है जिसमें नियंत्रणीय फोटोलुमिनेसेंस गुण होते हैं जो जैविक प्रणालियों में एक महान महत्वरखते हैं। क्यूडी नैनोक्रिस्टल को कोर-शेल प्रारूप में बनाया जाता है जहां उनकी उचित स्थिरता और कार्यप्रणाली सुनिश्चित करने के लिए नैनोक्रिस्टल के गठन में एक नैनोक्रिस्टल को समझाया जाता है। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कोर-शेल नैनोक्रिस्टल संयोजन सीडीएसई / जेडएनएस, सीडीएसई / सीडीएस सीडीएसई / जेडएनएसई, सीडीटीई / सीडीएस, सीडीटीई / जेडएनएस, और सीडीटीई / सीडीएस / जेडएनएस (कोर / शेल / शेल) 3 हैं। इन नैनोक्रिस्टल संयोजनों में, सीडीएसई / जेडएनएस और सीडीएसई / सीडीएस का सबसे सख्ती से अध्ययन किया जाता है और अक्सर द्वितीयक एंटीबॉडी संयुग्म 3,6 के रूप में उपयोग किया जाता है। इन क्यूडी नैनोकणों में पारंपरिक फ्लोरोफोरे की तुलना में अलग-अलग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ फ्लोरोसेंट गुण भी होते हैं। क्यूडी पारंपरिक फ्लोरोफोरेस की तुलना में उच्च प्रतिदीप्ति क्वांटम पैदावार प्रदर्शित करने के लिए थोक वैलेंस बैंड से इलेक्ट्रॉनों की उत्तेजना को नियोजित करता है। अर्धचालक धातुओं की नैनोक्रिस्टल व्यवस्था क्यूडी-मध्यस्थता लेबलिंग को अधिक स्थिर और फोटोब्लीचिंग 6 के लिए प्रतिरोधी बनातीहै। इसके अलावा, क्यूडी में नैनोक्रिस्टल कोर और इसकी क्रिस्टलीय संरचना विभिन्न आकारों के क्यूडी को अवशोषण स्पेक्ट्रा की एक विस्तृत श्रृंखला और बहुत संकीर्ण उत्सर्जन चोटियों7 की अनुमति देती है। इसके अलावा, ये क्यूडी कण उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व उत्पन्न करने के लिए काफी बड़े हैं, जिससे उन्हें ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 5,8,9 सहित उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों में उपयोगी बनाया जाता है। ये क्यूडी नैनोक्रिस्टल विभिन्न प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और आकारों के साथ कई आकारों में व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध हैं, जिससे उन्हें कई एंटीबॉडी10,11 के साथ लेबलिंग के लिए एक महान उम्मीदवार बना दिया गया है।
क्यूडी तकनीक ने कई कार्यात्मक गुणों के कारण जैविक अनुसंधान में बहुत महत्व आकर्षित किया, जिसमें लाइव-सेल इमेजिंग में उपयोग, कोशिका में परिवहन तंत्र का अध्ययन, प्रोटीन के प्रसार आंदोलन का झिल्ली परिवहन, कोशिकाओं की कार्यात्मक विषमता और इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 3,12,13,14,15,16 का अंकन शामिल है। . क्यूडी कैंसर के ऊतकों को लक्षित करने और पता लगाने के लिए आणविक निदान में भी उपयोगी है, ट्यूमर की आणविक प्रोफ़ाइल और प्रतिरक्षा स्थिति को चिह्नित करता है, और विट्रियस बॉडी और एपिरेटिनल झिल्ली 3,17,18 की कल्पना करता है। इसके अलावा, क्यूडी का उपयोग चिकित्सा उपचारों में फोटोडायनामिक थेरेपी और नेत्र विसंगतियों के माध्यम से ट्यूमर विकृतियों का इलाज करने के लिए आंखों तक दवाएं पहुंचाकर 3,17,18,19 भी किया जा सकता है।
इन अत्यधिक उपयोगी क्यूडी नैनोक्रिस्टल का उपयोग करते हुए, वर्तमान अध्ययन ने सिग्मा 1 रिसेप्टर (सिगमार 1) नामक प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित किया। सिगमार 1 एक सर्वव्यापी रूप से व्यक्त मल्टी-टास्किंग आणविक चैपरोन प्रोटीन है। विभिन्न ऊतकों और अंगों में सिगमार 1 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण पर ध्यान केंद्रित करने वाले व्यापक अध्ययनों ने आणविक कार्य20 को प्राप्त करने वाले सेल और ऊतक-प्रकार के विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानीयकरण की सूचना दी। विभिन्न जैव रासायनिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके विभिन्न कोशिकाओं (न्यूरोनल, फोटोरिसेप्टर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं) और ऊतकों (यकृत और मस्तिष्क) में, अध्ययनों ने एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े ईआर झिल्ली (एमएएम), परमाणु लिफाफा, प्लाज्मा झिल्ली, न्यूक्लियोप्लाज्मिक रेटिकुलम, न्यूक्लियस और माइटोकॉन्ड्रिया पर सिग्मार 1 के स्थानीयकरण की सूचना दी। इन सभी अध्ययनों के बावजूद, दिल में सिगमार 1 का उपकोशिकीय स्थानीयकरणअज्ञात रहा। इसलिए, कार्डियक ऊतक में सिगमार 1 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को क्यूडी-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जिसके बाद टीईएम इमेजिंग थी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 Mesh copper grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G200HH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-month-old male mice with FVB/N background</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 100%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sigmar1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>61994S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSAc (10%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>25557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal Xyl</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DER 732C36AA10:C33</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Histo; Ultra 450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAE</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEOL-1400 Flash</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERL 4221</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A405P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 3%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16538-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromolds</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metaperiodate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (size 10)</td>
			<td>Aspen surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM&#160; image software</td>
			<td>AMT-V700</td>
			<td>AMT TEM imaging systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM imaging camera</td>
			<td>XR80 TEM series</td>
			<td>AMT TEM imaging systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O solution (0.5%)</td>
			<td>Fisher Scientic</td>
			<td>S25612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing subcellular localization of a protein in the heart using quantum dots-mediated immuno-labeling followed by transmission electron microscopy

उपकोशिकीय स्थानीयकरण उचित कार्य को रेखांकित करने और किसी विशेष प्रोटीन के आणविक तंत्र को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए कई गुणात्मक और मात्रात्मक तकनीकों का उपयोग किया जाता है। प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने में उभरती तकनीकों में से एक क्वांटम डॉट्स (क्यूडी) -एक प्रोटीन की मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग है, जिसके बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के साथ उन्हें इमेजिंग किया जाता है। क्यूडी क्रिस्टलीय संरचना और उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व की दोहरी संपत्ति के साथ एक अर्धचालक नैनोक्रिस्टल है, जो उन्हें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर लागू करता है। इस वर्तमान विधि ने अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर हृदय के ऊतकों में क्यूडी-टीईएम का उपयोग करके सिग्मा 1 रिसेप्टर (सिगमार 1) प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की कल्पना की। जंगली प्रकार के माउस से हृदय ऊतक वर्गों के छोटे क्यूब्स को 3% ग्लूटारल्डिहाइड में तय किया गया था, बाद में ऑस्मिकेटेड, यूरिनिल एसीटेट से सना हुआ, इसके बाद इथेनॉल और एसीटोन के साथ अनुक्रमिक निर्जलीकरण हुआ। इन निर्जलित हृदय ऊतक वर्गों को कम चिपचिपाहट वाले एपॉक्सी रेजिन में एम्बेडेड किया गया था, 500 एनएम मोटाई के पतले वर्गों में काटा गया था, ग्रिड पर रखा गया था, और बाद में 5% सोडियम मेटापीरियडेट के साथ एंटीजन अनमास्किंग के अधीन किया गया था, इसके बाद ग्लाइसिन के साथ अवशिष्ट एल्डिहाइड का शमन किया गया था। ऊतकों को अवरुद्ध कर दिया गया था, इसके बाद प्राथमिक एंटीबॉडी, बायोटिनिलेटेड द्वितीयक एंटीबॉडी और स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित क्यूडी में अनुक्रमिक इनक्यूबेशन थे। इन दाग वाले वर्गों को टीईएम का उपयोग करके उच्च आवर्धन पर धब्बा सुखाया गया और चित्रित किया गया। क्यूडी-टीईएम तकनीक ने दिल में अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर सिगमार 1 प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दी। इन तकनीकों का उपयोग किसी भी अंग प्रणाली में किसी भी प्रोटीन और उपकोशिकीय स्थानीयकरण की उपस्थिति की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है।

वर्तमान क्यूडी-टीईएम पद्धति ने वयस्क माउस अल्ट्रा-पतले हृदय वर्गों पर एंटी-सिगमार 1 लक्षित क्यूडी लेबलिंग करके उपकोशिकीय हृदय डिब्बों पर सिगमार 1 की उपस्थिति और इसके स्थानीयकरण की कल्पना की। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आंतरिक और बाहरी), लाइसोसोम और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम / सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर / एसआर) झिल्ली-माइटोकॉन्ड्रियल इंटरफ़ेस (चित्रा 2 ए, बी) पर क्यूडी लेबल वाले इलेक्ट्रॉन-घने एंटी-सिग्मार 1 को क्यूडी-टीईएम छवियों द्वारा चित्रित किया गया था। इसके अलावा, हृदय वर्गों को खरगोश आईजीजी और क्यूडी के साथ एंटी-सिगमार 1 खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी (चित्रा 2 सी, डी) के लिए आइसोटाइप नियंत्रण के रूप में भी लेबल किया गया था। इसलिए, क्यूडी-टीईएम इमेजिंग ने अंतर्जात सिगमार 1 के स्थानीयकरण और इसके संवर्धन को ज्यादातर लाइसोसोम और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली पर उजागर किया।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig01.jpg"> चित्रा 1: QD-TEM करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अनुक्रमिक चरणों और प्रक्रियाओं को दिखाने वाला योजनाबद्ध चित्रण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig02.jpg"> (ए, बी) प्रतिनिधि टीईएम छवियां माइटोकॉन्ड्रिया (बाहरी और आंतरिक-झिल्ली), माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) / सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) झिल्ली और लाइसोसोम पर क्यूडी लेबल वाले सिगमार 1 दिखाती हैं। (C, D) क्यूडी और खरगोश आईजीजी के साथ लेबल किए गए आइसोटाइप नियंत्रण के हृदय वर्गों की टीईएम छवि। स्केल बार: 200 एनएम। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
पूरक फ़ाइल 1: ऊतक निर्जलीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले पीबीएस और अन्य समाधानों की संरचना। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy at JoV

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

वर्तमान प्रोटोकॉल क्वांटम डॉट्स का उपयोग करके हृदय ऊतक वर्गों में एक प्रोटीन को इम्यूनो-लेबलिंग की एक विधि का वर्णन करता है। यह तकनीक अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर किसी भी प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करती है।

क्वांटम डॉट्स-मध्यस्थता इम्यूनो-लेबलिंग का उपयोग करके हृदय में प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की कल्पना करना, इसके बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

The subcellular localization is critical to delineating proper function and determining the molecular mechanisms of a particular protein. Several ...

एक प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का निर्धारण इसके उचित कार्य और इसमें शामिल तंत्र को रेखांकित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह विधि हमें अल्ट्रा संरचना स्तर पर प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की कल्पना करने में मदद कर सकती है। क्वांटम डॉट्स-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग अधिक स्थिर है, फोटोब्लीचिंग के लिए प्रतिरोधी है, इसका अपना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है, उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व पैदा करता है, और ऊतकों में बेहतर प्रवेश के साथ ऊतकों पर उच्च दक्षता और प्रतिधारण प्रदर्शित करता है।प्रक्रिया के कई चरण, अर्थात् निर्धारण, नक़्क़ाशी, अवरुद्ध, और इष्टतम क्वांटम डॉट्स एकाग्रता, अनुकूलन के लिए चुनौतीपूर्ण कदम हैं। उपयोग किए गए अभिकर्मकों के कई समय बिंदुओं और सांद्रता की कोशिश करना उचित है। एक और चुनौती ग्रिड को संभालना है जिसके लिए केवल धैर्य और निश्चित रूप से, अभ्यास काम करता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन चौधरी अब्दुल्ला, एक डाक साथी, नाज़निन रीमेक्स, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र, और ब्रैंडन हार्टमैन, हमारी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेवाओं से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर्यवेक्षक होंगे। चूहों को एनेस्थेटाइज करने और छाती गुहा खोलने के बाद, दो मिनट के लिए सोडियम कैकोडाइलेट बफर के 0.1 मोलर में बर्फ ठंडा 3% ग्लूटारल्डिहाइड का उपयोग करके दिल को भरें। गुरुत्वाकर्षण दबाव का उपयोग करके दिल में फिक्सेटिव पेश करने के लिए पांच से आठ इंच की 25 गेज सुई का उपयोग करें।जैसे ही दिल फिक्सेटिव से भरना शुरू हो जाता है, दबाव से राहत पाने के लिए दिल के शीर्ष को उठाएं। दिल से एक से दो मिलीमीटर पर नीचे वाहिकाओं को काटें और तरल पदार्थों को निकालने दें। दिल का विश्लेषण करें।एट्रिया को हटा दें और वेंट्रिकल्स को पेट्री डिश में छोड़ दें जिसमें बर्फ ठंडा 3% ग्लूटारल्डिहाइड और 0.1 मोलर सोडियम कैकोडाइलेट हो। निर्धारण के 30 से 60 मिनट के बाद एक तितली काट लें और वेंट्रिकल को पेट्री डिश में वापस रखें। एक क्यूबिक मिलीमीटर के छोटे क्यूब्स में सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके दिल को काट लें।चार डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ग्लूटारल्डिहाइड और कैकोडाइलेट घोल में विच्छेदित हृदय ऊतक को ठीक करें और डुबोएं। निर्धारण के 24 घंटे बाद, ऊतक को 0.1 मोलर सोडियम कोकोडाइलेट बफर में 20 मिनट के लिए दो बार धोएं। सोडियम कैकोडिलेट बफर से ऊतक को निकालें और कमरे के तापमान पर चार घंटे के लिए 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड समाधान में डुबोएं।ऑस्मिकेशन के बाद, ऊतक को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2% सोडियम एसीटेट समाधान में डुबोएं। इसके बाद, कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए ऊतक को 2% यूरिनिल एसीटेट समाधान में डुबोएं। यूरिनिल एसीटेट धुंधला होने के बाद, वर्गीकृत अल्कोहल और एसीटोन के माध्यम से क्रमिक रूप से ऊतक को निर्जलित करें।पांडुलिपि में वर्णित कम चिपचिपाहट एपॉक्सी राल में निर्जलित ऊतक को एम्बेड करें। ऊतक को आठ मिलीमीटर माइक्रो मोल्ड में ताजा राल में डालें और रात भर में 70 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेडेड ऊतक को ठीक करें। रुचि के क्षेत्र का पता लगाने के बाद, अल्ट्रा 45 डिग्री चाकू का उपयोग करके, हल्के सोने के अल्ट्राथिन वर्गों का उत्पादन करें।इन अल्ट्राथिन वर्गों को 200 जाल तांबा ग्रिड के सुस्त पक्ष पर रखें। एक साफ पैराफिन फिल्म पर 20 माइक्रोलीटर नक़्क़ाशी घोल मेटापीरियडेट डालकर एंटीजन को अनमास्क करके धुंधलापन शुरू करें। नक़्क़ाशी घोल की बूंद पर ऊतक वर्गों के साथ सूखे ग्रिड रखें।कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान पर अनुभाग ग्रिड छोड़ दें। 60 सेकंड के लिए आसुत जल की एक बूंद पर रखकर उकेरे गए ऊतक वर्गों को धो लें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.05 मोलर ग्लाइसिन समाधान की बूंद पर अनुभाग ग्रिड रखकर अवशिष्ट एल्डिहाइड को अवरुद्ध करें।अवशिष्ट ग्लाइसिन समाधान को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर पर ग्रिड के किनारों को ब्लॉट करें। अनुभाग ग्रिड को कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए ब्लॉकिंग समाधान के 10 से 20 माइक्रोलीटर में रखें। फिल्टर पेपर पर ग्रिड किनारों को ब्लॉट करें और ग्रिड सेक्शन को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कंडीशनिंग के लिए एंटीबॉडी डिल्यूएंट पर रखें।एक ह्यूमिडिफ़ायर कक्ष में एक घंटे 30 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ग्रिड वर्गों को इनक्यूबेट करें। ब्लोट ग्रिड को सुखाएं और ग्रिड अनुभागों को एंटीबॉडी डिल्यूएंट के साथ पांच मिनट के लिए दो बार धोएं। एक ह्यूमिडिफ़ायर कक्ष में एक घंटे के लिए बायोटिनिलेटेड द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ग्रिड वर्गों को इनक्यूबेट करें।एक बार जब ग्रिड सूख जाता है, तो ग्रिड अनुभागों को एंटीबॉडी डिल्यूएंट के साथ पांच मिनट के लिए दो बार धोएं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्ट्रेप्टाविडिन संयुग्मित क्यूडी में ग्रिड वर्गों को कमरे के तापमान पर एक कक्ष में एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कक्ष को कवर करके प्रकाश के संपर्क को रोकें।फिल्टर पेपर का उपयोग करके ग्रिड किनारों को सुखाने के बाद, ग्रिड अनुभागों को दो मिनट के लिए पानी की बूंदों पर रखकर धो लें और ग्रिड किनारों को सूखने के लिए धब्बा दें। माइक्रोस्कोप कॉलम में नमूना धारक डालें और गोनियोमीटर का मूल्यांकन करने के लिए पंप स्विच को संलग्न करें, इसके बाद माइक्रोस्कोप कॉलम में नमूना धारक का पूर्ण सम्मिलन होता है। इच्छित क्षेत्र पर अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित करें।एक उच्च गति वाले डिजिटल कैमरे का उपयोग करके छवि कैप्चर करें और फ़ाइल को टीआईएफ प्रारूप में सहेजें। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली, लाइसोसोम, और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम या सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली माइटोकॉन्ड्रियल इंटरफ़ेस ने सिगमार 1 लेबल क्वांटम डॉट्स की उपस्थिति दिखाई। एंटी-सिगमार 1 खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए आइसोटाइप नियंत्रण के रूप में खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन जी और क्वांटम डॉट्स का उपयोग करके हृदय वर्गों की कल्पना की गई थी।इस प्रोटोकॉल पर काम करते समय विचार करने वाली एक महत्वपूर्ण बात एंटीजन के लिए समय को अनमास्क करना है। यदि ऊतक वर्गों को बहुत लंबे समय तक उकेरा जाता है, तो मेटापीरियडेट समाधान पतले ऊतक वर्गों में छिद्र पैदा करेगा। क्वांटम डॉट-मध्यस्थता लेबलिंग ट्यूमर का पता लगाने, ट्यूमर आणविक और प्रतिरक्षा स्थिति प्रोफाइलिंग और ऊतक इमेजिंग में ध्यान आकर्षित कर रही है जो चिकित्सा निदान के लिए एक नया रास्ता तैयार कर रही है।क्वांटम डॉट्स आंखों को दवा पहुंचाकर फोटोडायनामिक थेरेपी और नेत्र विसंगतियों के माध्यम से ट्यूमर के इलाज में भी उपयोगी हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

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में दिल की धड़कन visualizing ड्रोसोफिला</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

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भ्रूण की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार ड्रोसोफिला भ्रूण दिल ट्यूब

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

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Visualizing शाही सेना स्थानीयकरण में Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

नाइट्रिक ऑक्साइड और कोशिकाओं से superoxide इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा कट्टरपंथी आयनों की जांच स्पिन जाल का उपयोग

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

नैनो फेम: प्रोटीन फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का स्थानीयकरण

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

डुबकी बर्फ़ीली: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में निलंबन कोशिकाओं के Ultrastructural और Immunolocalization अध्ययन के लिए एक उपकरण

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosomes की नमूना तैयारी और इमेजिंग

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए लघुकृत नमूना तैयारी

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन टैगिंग और 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole धुंधला Caenorhabditis एलिगेंस में द्वारा प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

उच्च दबाव ठंड, माइक्रोवेव की सहायता के विपरीत वृद्धि, और मात्रा इमेजिंग के लिए ंयूनतम राल Embedding द्वारा जैविक नमूना तैयारी

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...