Name: visualizing subcellular localization of a protein in the heart using quantum dots-mediated immuno-labeling followed by transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-09-16T13:30:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy at JoV

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 och R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award och LARC Research Award till MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist kardiovaskulärt och AHA postdoktoralt stipendium till CSA (20POST35210789); och LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship till RA.

Djurhanteringsförfarandena i detta protokoll överensstämde med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (åttonde upplagan, National Institutes of Health, Bethesda, MD) och godkändes av Animal Care and Use Committee of Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport. Sex månader gamla hanmöss med FVB/N-bakgrund användes för den aktuella studien. Mössen erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning). Mössen som användes var inrymda i en välreglerad miljö i burar som möjliggjorde en 12 timmars ljus-mörk-cykel, försedd med vatten och en vanlig chow-diet ad libitum, och vårdades enligt NIH-guiden för vård och användning av laboratoriedjuren. Den övergripande processen illustreras i figur 1.
1. Beredning av djur
<ol><li>Bedöva mössen med 3% isofluran. Öppna bröstet genom att göra ett horisontellt snitt i regionen ovanför mitten av buken och dra i huden. Gör försiktigt ett nytt snitt för att öppna bröstkaviteten utan att punktera några andra organ21,22,23.<ol><li>Perfuse24 hjärtat genom toppen först och sedan höger kammare med kall 3% glutaraldehyd i kardioplegisk lösning (50 mM KCl, 5% dextros i PBS, se Tilläggsfil 1) i 2 minuter för att säkerställa fullständig myokardiell avslappning.</li>
	</ol></li>
	<li>Genomsyra hjärtat med iskall 3% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (pH 7,4, steg 2.1.1) i ytterligare 2 minuter. Använd tyngdkraftstrycket och använd en 25 G 5/8 "nål för att införa fixeringsmedlen i hjärtat. Omedelbart efter att hjärtat börjar fyllas med fixeringsmedlet, lyft upp hjärtats topp och skär kärlen under 1-2 mm från hjärtat för att lindra trycket och låta vätskorna rinna av.</li>
	<li>Dissekera hjärtat, ta bort förmaken24 och släpp ventriklarna i iskallt 3% glutaraldehyd/0,1 M natriumkakodylat i en petriskål. Gör ett fjärilssnitt efter 30-60 minuters fixering och lägg det i en petriskål som innehåller 3% glutaraldehyd/kakodylat (se Materialtabell). Hacka hjärtat med ett kirurgiskt blad i små kuber på 1 mm3 medan det är i glutaraldehyd / kakodylatlösning.</li>
	<li>Fixera/sänk ner den dissekerade hjärtvävnaden i glutaraldehyd/kakodylatlösning i 24 timmar vid 4 °C.</li>
</ol>2. Bearbetning av hjärtvävnad
<ol><li>Tvätta vävnaderna i 0,1 M natriumkakodylatbuffert efter 24 timmars fixering i 20 minuter.<ol><li>Förbered 0,1 M kakodylatbuffert enligt stegen nedan.<ol><li>För att bereda 0,1 M natriumkakodylatbuffert, bered en stam av 1 M natriumkakodylatbuffert genom att lösa natriumkakodylat (21,4 g) och 1% kalciumkloridlösning (3 ml) i 90 ml destillerat vatten. Volym upp lösningen till 100 ml genom att tillsätta det destillerade vattnet. Rör om lösningen väl och låt den stå över natten för att lösa upp det lösta ämnet.</li>
			<li>Ta sedan 10 ml 1 M natriumkakodylat stamlösning och tillsätt den till 80 ml destillerat vatten. Justera pH-värdet till 7,4 med HCl och volym upp till 100 ml genom att tillsätta destillerat vatten.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Upprepa tvätten i 0,1 M natriumkakodylatbuffert i ytterligare 20 minuter. Ta bort vävnaderna från natriumkakodylatbufferten och sänk ner dem i 2% osmiumtetroxidlösning i 4 timmar vid rumstemperatur. Denna process kallas osmication.<ol><li>Förbered 2% Osmiumtetroxidlösning enligt stegen nedan.<ol><li>För att bereda 2% Osmiumtetroxidlösning, ta 4% Osmiumtetroxidlösning, 4 ml (se materialtabell), 1 M natriumkakodylatstamlösning (0,8 ml) och destillerat vatten (3,2 ml) för att göra totalt 8 ml lösning. OBS: Hela denna process och stegen härifrån måste utföras i dragskåpet.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Efter osmication, sänk ner vävnaderna i 2% natriumacetatlösning i 10 min vid rumstemperatur.<ol><li>Bered 2% natriumacetatlösning genom att lösa 4 g natriumacetat i 20 ml destillerat vatten.</li>
	</ol></li>
	<li>Sänk sedan ner vävnaderna i 2% uranylacetatlösning i 1 timme vid rumstemperatur.<ol><li>Bered 2% uranylacetatlösning genom att lösa 4 g uranylacetat i 20 ml destillerat vatten.</li>
	</ol></li>
	<li>Efter färgning av uranalacetat dehydrerar du vävnaderna sekventiellt genom de graderade alkoholerna och acetonen i den ordning som anges i tilläggsfil 1.</li>
</ol>3. Inbäddning av hjärtvävnad
<ol><li>Bädda in de uttorkade vävnaderna i epoxiharts med låg viskositet enligt stegen nedan.<ol><li>För att tillverka epoxiharts med låg viskositet, blanda 10,24 ml vinylcyklohexendioxid (ERL 4221) epoximonomer, 6,74 ml diglycidyleter av polypropenglykol (DER 732) och 30,05 ml nonenyl bärnstenssyransyraanhydrid (NSA) (se materialtabell) i ett 50 ml rör. Rör om suspensionen väl för hand i 2 min.</li>
		<li>Tillsätt 18 droppar 2-dimetylaminoetanol (DMAE, se materialtabell) epoxiaccelerator och rör om suspensionen för att blanda komponenterna noggrant.</li>
		<li>Impregnera vävnaderna i epoxiharts i följande blandningssekvens.<ol><li>Byt ut 100% aceton med 1:1 harts: acetonsuspension och sänk ner vävnaderna i den i 1 timme vid rumstemperatur.</li>
			<li>Byt ut 1:1 harts: acetonsuspension med 6:1 harts: acetonsuspension och sänk ner vävnaderna i den i 3 timmar.</li>
			<li>Slutligen byt ut 6:1-hartset: acetonsuspension med 100% hartssuspension och låt vävnaderna nedsänkas i det över natten vid rumstemperatur.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Lägg vävnaderna i färskt harts i 8 mm mikroformar (se materialtabell) och härda de inbäddade vävnaderna vid 70 °C över natten. OBS: Se till att hartset är hårt men inte sprött efter härdning.</li>
</ol>4. Vävnadssektionering med hjälp av en ultramikrotom
<ol><li>Trimma hartsblocken med vävnaden till högst 1 mm innan de monteras på ultramikrotomen (se materialförteckning). Placera formen exakt som möjligt i ultramikrotomens segmenterade arm och för provformen manuellt mot diamantkniven.</li>
	<li>Skär sektionerna i en tjocklek av 500 nm (en halv mikron) med en Histo-kniv (se Materialtabell) och använd EM-slingverktyget, plocka upp dem och placera dem på en glasskiva.</li>
	<li>Placera glasskivan på en kokplatta för toluidinblå fläck25 för att hitta intresseområdet.</li>
	<li>När du har hittat intresseområdet använder du en Ultra 45 ° kniv (se materialtabell) för att producera ultratunna sektioner i blekt guld (100 nm). Placera dessa ultratunna sektioner på den tråkiga sidan av ett 200-näts kopparnät.</li>
</ol>5. Ultratunn hjärtsektionsfärgning
<ol><li>Starta färgningen genom att avmaskera antigenet med en etsningslösning, dvs 5% natriummetaperiodatlösning.<ol><li>Bered 500 μl 5% natriummetaperiodat (se materialtabell) lösning i destillerat vatten. OBS: Förbered färsk lösning före användning.</li>
		<li>Sätt 20 μl natriummetaperiodatlösning på en ren paraffinfilm. Placera de helt torkade gallren med vävnadssektioner på etsningslösningens droppe. OBS: Den tråkiga sidan av gallret med vävnadssektionen måste vända mot etsningslösningen.</li>
		<li>Lämna sektionsnätet på lösningen i 30 minuter vid rumstemperatur.</li>
	</ol></li>
	<li>Tvätta den etsade vävnadssektionen genom att placera den på en droppe destillerat vatten i 60 s.</li>
	<li>Blockera restaldehyderna genom att placera sektionsgallren på en droppe 0,05 M glycinlösning i 10 min vid rumstemperatur. Torka gallrets kanter på filterpapper för att ta bort den kvarvarande glycinlösningen.<ol><li>Bered 0,05 M glycinlösning (se materialtabell) genom att lösa 3,75 mg glycin i 1 ml 1x PBS (pH 7,4).</li>
	</ol></li>
	<li>Placera sektionsgallren i 10-20 μl blockerande lösning i 25 minuter vid rumstemperatur. OBS: Blockerande lösningskomposition: 2 μL 1% normalt getserum (NGS) + 20 μL 1% BSA (slutlig koncentration: 10%) + 178 μL 1x PBS (pH 7,4) för att göra en slutlig volym på 200 μL.</li>
	<li>Torka gallerkanterna på filterpapper och placera gallersektionen på antikroppsutspädningsmedel för konditionering vid rumstemperatur i 10 minuter.</li>
	<li>Inkubera gallersektionerna med primär antikropp (Sigmar1 i detta fall, se Materialförteckning; utspädd 1:10 i antikroppsutspädningsmedel) i 1 timme 30 min i en fuktad kammare.</li>
	<li>Torka gallret och tvätta gallersektionerna med antikroppsutspädningsmedel två gånger i 5 minuter vardera.</li>
	<li>Inkubera gallersektionerna med biotinylerad sekundär antikropp (i detta fall biotinylerad get-anti-kanin polyklonal sekundär antikropp, se Materialtabell; utspädd 1:10 i antikroppsutspädningsmedel) i 1 h i en fuktad kammare.</li>
	<li>Torka gallret och tvätta gallersektionerna med antikroppsutspädningsmedel två gånger i 5 minuter vardera.</li>
	<li>Inkubera rutnätssektionerna i kommersiellt tillgänglig streptavidinkonjugerad QD (QD655nm, se Materialförteckning; utspädd 1:10 i antikroppsutspädningsmedel) i 1 timme i en fuktad kammare vid rumstemperatur. Förhindra exponering för ljus genom att täcka kammaren med aluminiumfolie.</li>
	<li>Torka gallerkanterna med filterpapper och tvätta gallersektionerna genom att placera dem på vattendroppar i 2 minuter.</li>
	<li>Torka kanterna på gallret för att torka.</li>
</ol>6. Avbildning av transmissionselektronmikroskopi (TEM)
<ol><li>Placera de ultratunna sektionerna på koppargaller i en provkvartetthållare och kläm fast dem i ett läge för att möjliggöra val av galler i elektronstrålen.</li>
	<li>Sätt i provhållaren i mikroskopkolonnen och koppla in pumpomkopplaren för att evakuera goniometern, följt av fullständig insättning av provhållaren i mikroskopkolonnen (se materialförteckning).</li>
	<li>Ställ in spänningen på 80 kV innan du genererar strålen för bildobservation.</li>
	<li>Fokusera väl på önskat område, ta bilden med en höghastighets digitalkamera och spara filen i .tif format. OBS: Mikroskopinställningen för att fånga bild i denna studie var accelererande spänning eller högspänningsspänning på 80 kV och en förstoring på 20 000x.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lidke, D. S., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+imaging+-+techniques+for+three-dimensional+imaging+of+cellular+structures.">Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures.</a> Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).</li><li>de Duve, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+fraction-past+and+present.">Tissue fraction-past and present.</a> The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20 (1971).</li><li>Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E., Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. , 323-334 (2018).</li><li>Mayhew, T. M., M&#252;hlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).</li><li>Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+EM+of+non-heavy+metal+stained+biosamples:+Large-field+of+view,+high+contrast+and+highly+efficient+immunolabeling.">Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling.</a> Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).</li><li>Deerinck, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+fluorescent+quantum+dots+to+confocal,+multiphoton,+and+electron+microscopic+imaging.">The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).</li><li>Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantum+dots+as+probes+for+correlative+fluorescence,+conventional,+and+energy-filtered+transmission+electron+microscopy.">Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+for+live+cells,+in+vivo+imaging,+and+diagnostics.">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307 (5709), 538-544 (2005).</li><li>Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-+and+electron+microscopy+using+quantum+dot+nanoparticles.">Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54307 (2016).</li><li>Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H., Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantum Dots: Applications in Biology. , 43-53 (2007).</li><li>Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).</li><li>Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+ligands+provide+new+insights+into+erbB/HER+receptor-mediated+signal+transduction.">Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction.</a> Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).</li><li>Pleskova, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+functional+activity+of+human+neutrophilic+granulocytes+in+their+interactions+with+semiconductor+quantum+dots.">Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots.</a> Morfologiia. 135 (3), 47-49 (2009).</li><li>Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+single+molecule+tracking+reveals+a+wide+range+of+diffusive+motions+of+membrane+transport+proteins.">Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins.</a> Proceedings of SPIE. 7189, (2009).</li><li>Hanaki, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiconductor+quantum+dot/albumin+complex+is+a+long-life+and+highly+photostable+endosome+marker.">Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).</li><li>Lim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).</li><li>Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cancer+targeting+and+imaging+with+semiconductor+quantum+dots.">In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).</li><li>&#197;kerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanocrystal+targeting+in+vivo.">Nanocrystal targeting in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).</li><li>Sarwat, S. A. -. O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+ophthalmology:+A+literature+review.">Quantum dots in ophthalmology: A literature review.</a> Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).</li><li>Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigmar1's+molecular,+cellular,+and+biological+functions+in+regulating+cellular+pathophysiology.">Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology.</a> Frontiers in Physiology. 12, 705575 (2021).</li><li>Bohne, B., Harding, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).</li><li>Roszkowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-protocol. 11 (5), 3988 (2021).</li><li>Jones, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+murine+alpha+myosin+heavy+chain+gene+leads+to+dosage+effects+and+functional+deficits+in+the+heart.">Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).</li><li>Hunter, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , (1993).</li><li>Morris, R. E., Ciraolo, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+post-embedding+protocol+for+immunogold+labelling+of+osmium-fixed,+epoxy+resin-embedded+tissue.">A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue.</a> Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).</li><li>Brorson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deplasticizing+or+etching+of+epoxy+sections+with+different+concentrations+of+sodium+ethoxide+to+enhance+the+immunogold+labeling.">Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling.</a> Micron. 32 (2), 101-105 (2001).</li><li>Lobo, M. V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+Staining+with+Sodium+Metaperiodate+and+Sodium+Borohydride.">Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).</li><li>Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiconductor+nanocrystals+as+fluorescent+biological+labels.">Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels.</a> Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugated+quantum+dots+for+in+vivo+molecular+and+cellular+imaging.">Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).</li><li>Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutical+applications+of+quantum+dots.">Pharmaceutical applications of quantum dots.</a> AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233 (2021).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

I den aktuella studien användes QD-medierad immunmärkning för att tydligt visa den subcellulära lokaliseringen av Sigmar1. Med hjälp av QD avbildades Sigmar1s lokalisering på mitokondriellt membran, särskilt det inre mitokondriella membranet, i hjärtvävnad. Dessutom befanns Sigmar1 också vara belägen på sarkoplasmatisk / endoplasmatisk retikulum (S / ER) och lysosomer på ultrastrukturell nivå, som visas i figur 2A-D.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är etsnings- eller antigenavmaskeringssteget med högkoncentrerad natriummetaperiodatlösning för att avslöja antigenet efter glutaraldehydfixering och osmication. Detta protokoll använde en enda behandling med en hög koncentration (5%) natriummetaperiodat i 30 minuter vid rumstemperatur. Extra försiktighet behövs i detta steg eftersom en längre varaktighet eller högre koncentration för natriummetaperiodatinkubation kommer att resultera i aggregering av strukturer, förlust av membrandefinition för organellerna och orsaka perforeringar i sektionen, vilket gör det svårt att visualisera proteinet eller strukturen. Alternativt kan en lägre koncentration av (3%) metaperiodatlösning i två steg i 30 minuter också användas istället för 5% metaperiodat. Studier har visat att detta alternativ uppvisar liknande resultat som med 5% metaperiodatlösning för enstegs 30 min inkubation. En 3% metaperiodatlösning för 30 minuters inkubation i två gånger ger dock bättre kontroll över processen26,27,28. Ursprungligen använde detta protokoll inkubation av sektionerna med 10% metaperiodatlösning i 30 min. På grund av för många perforeringar som skapades i vävnadssektionen av denna koncentration minskade emellertid den slutliga koncentrationen och inkubationstiden för metaperiodatlösningen och optimerades till 5% i 30 minuter.
Ett annat steg krävde optimering av fixeringstiden med glutaraldehyd. Suboptimal fixering av vävnader resulterar i otillräcklig QD-märkning, medan överfixering av vävnader resulterar i högre icke-specifik märkning. Därför måste noggrann övervägning göras vid bestämning och titrering av en optimal nivå av vävnadsfixering för korrekt och specifik märkning av proteiner. I denna metod med användning av hjärtvävnader titrerades fixeringstiden med glutaraldehyd med användning av 24 h och 48 h som tidpunkter. Baserat på färgningsbilderna av de sektioner som var fixerade för båda tidpunkterna, fann man att sektioner fixerade i 24 timmar visade bättre resultat. Hittills finns QD-nanokristaller i flera storlekar, inklusive 525, 565, 585, 605, 655 och 705 nm11,29. Var och en av dessa QD har sina egna emissionsspektra och avger fluorescens vid olika våglängder. Dessutom visar dessa kommersiellt tillgängliga QD: er i olika storlekar olika former; till exempel är QD 525, 565 och 585 praktiskt taget sfäriska med olika storlekar, medan QD 605, 655 och 705 är oregelbundna avlånga formade. Av dessa olika QD-nanokristaller är QD 525, 565 och 655 lätta att skilja från varandra11,29. Dessa skillnader i emissionsspektra och former gör QD till en utmärkt kandidat för multimärkning av proteiner och visualisering genom fluorescens och elektronmikroskopi. I denna studie användes en kommersiellt tillgänglig QD, QD 655, för att märka Sigmar1-proteinet för att skilja det från någon icke-specifik bakgrund i de färgade sektionerna.
En annan motsvarighet till QD för proteinmärkning i högupplöst mikroskopi är immunogoldpartikeln. Immunogoldpartiklarna används traditionellt för att märka proteiner för högupplöst mikroskopi. Dessa guldpartiklar är mycket elektrontäta och lätt identifierbara jämfört med QD-nanokristaller. QD uppvisar dock bättre effektivitet med bättre penetration i vävnader, högre stabilitet och hållbarhet och bättre retention av ultrastrukturella komponenter, vilket gör dem till en bättre kandidat för proteinmärkning 4,5. QD har också en unik förmåga att detekteras med både ljus- och elektronmikroskopi, vilket ökar dess värde jämfört med immunogoldmärkning10.
En begränsning av denna QD-medierade immunmärkning är användningen av osmiumtetroxid under bearbetningen. Osmiumtetroxid används för att öka elektrondensiteten, konduktiviteten och kontrasten hos annars mindre elektrontäta och mindre kontrasterande biologiska membranstrukturer 5,30. Användningen av osmiumtetrexid förstör emellertid omedelbart och irreversibelt provets egenskap för att skapa fluorescens när den är märkt med QD6. Detta begränsar användningen av QD i fluorescensmikroskopi. Ett alternativt tillvägagångssätt som utelämnar användningen av osmiumtetroxid kommer att vara fördelaktigt för att behålla de fluorescerande egenskaperna och därmed den dubbla tillämpningen av QD-medierad immunmärkning. Några av de nyare modellerna av TEM har möjlighet att fästa EDX-systemet (Energy Dispersive X-Ray Analysis) som möjliggör identifiering av materialets elementära sammansättning. En annan begränsning i studien är bristen på elementär kartläggning av ett prov och bildanalys med EDX. Därför bör framtida studier fokusera på EDX-analysen av QD-spektra för att analysera elementarkompositionen.
QD-märkning av proteiner har fått mycket uppmärksamhet på senare tid. QD erbjuder flera tillämpningar och fördelar inom både biologisk forskning och medicinsk terapi. QD som dessutom lindas in med polydentatligand uppvisar ökad stabilitet som upprätthåller kvantutbytet. Vidare ökar inkapslande QD med dessa biogynnsamma medel också dess biotillgänglighet i vävnader vilket gör det till en bra kandidat för potentiell tillämpning vid detektering av tumörer, levande cellavbildning, läkemedelsleverans och vävnadsavbildning 3,31,32.

Människokroppen består av många proteiner som är ansvariga för många kroppsfunktioner. Proteinernas funktion beror till stor del på deras lokalisering i organ- och cellorganellerna. Flera tekniker, inklusive subcellulär fraktionering, immunofluorescens och tvättmedelsmedierad proteinextraktion, används vanligtvis för att bestämma proteinets subcellulära lokalisering 1,2. Mikroskopi med immunofluorescerande färgämne är den mest använda metoden bland dessa tekniker. De fluorescerande färgämnena som används i denna teknik är emellertid mindre stabila och benägna att fotobleka3. Andra tekniker involverade högupplöst mikroskopi för att visualisera proteinet på ultrastrukturell nivå genom att immunmärka proteiner med elektrontäta, tungmetaller (guld, ferritin) eller kvantprickar nanokristaller och följt av visualisering av dem med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM)4,5.
QD är en halvledarnanokristall som består av halvledarmetallföreningar med kontrollerbara fotoluminescensegenskaper som har stor betydelse i biologiska system3. QD-nanokristaller tillverkas i ett kärnskalformat där en nanokristall är inkapslad i bildandet av nanokristaller för att säkerställa att de är korrekt stabila och fungerar. Vanliga kombinationer av kärnskal nanokristaller är CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS och CdTe/CdS/ZnS (core/shell/shell)3. Bland dessa nanokristallkombinationer studeras CdSe/ZnS och CdSe/CdS mest kraftfullt och används ofta som sekundära antikroppskonjugat 3,6. Dessa QD-nanopartiklar har också fluorescerande egenskaper med olika excitations- och emissionsspektra än traditionella fluoroforer. QD använder excitering av elektroner från bulkvalensbandet för att uppvisa högre fluorescenskvantutbyten jämfört med traditionella fluoroforer. Nanokristallarrangemanget av halvledarmetaller gör QD-medierad märkning mer stabil och motståndskraftig mot fotoblekning6. Dessutom tillåter nanokristallkärnan i QD och dess kristallina struktur QD i olika storlekar att ha ett brett spektrum av absorptionsspektra och mycket smala emissionstoppar7. Dessutom är dessa QD-partiklar tillräckligt stora för att ge hög elektrondensitet, vilket gör dem användbara i högupplösta mikroskopitekniker, inklusive transmissionselektronmikroskopi 5,8,9. Dessa QD-nanokristaller är också kommersiellt tillgängliga i flera storlekar med olika fluorescensemissionsspektra och former, vilket gör dem till en utmärkt kandidat för märkning med flera antikroppar10,11.
QD-tekniken fick stor betydelse i biologisk forskning på grund av flera funktionella egenskaper, inklusive användning vid avbildning av levande celler, studier av transportmekanismer i cellen, membrantransport av proteinets diffusionsrörelse, funktionell heterogenitet hos celler och märkning av intracellulär organell 3,12,13,14,15,16 . QD är också användbart inom molekylär diagnostik för att rikta in sig på och upptäcka cancervävnader, karakterisera tumörens molekylära profil och immunstatus och visualisera glaskropp och epiretinala membran 3,17,18. Dessutom kan QD också användas i medicinska terapier för att behandla tumörmaligniteter via fotodynamisk terapi och oftalmiska anomalier genom att leverera läkemedel till ögon 3,17,18,19.
Med hjälp av dessa mycket användbara QD-nanokristaller bestämde den aktuella studien den subcellulära lokaliseringen av ett protein som heter Sigma 1-receptor (Sigmar1). Sigmar1 är ett allestädes närvarande uttryckt multi-tasking molekylärt chaperonprotein. Omfattande studier med fokus på Sigmar1s subcellulära lokalisering i olika vävnader och organ rapporterade en cell- och vävnadstypspecifik subcellulär lokalisering som framkallade molekylär funktion20. I olika celler (neuronala, fotoreceptor- och immunceller) och vävnader (lever och hjärna) med olika biokemiska tillvägagångssätt rapporterade studier lokaliseringen av Sigmar1 på endoplasmatisk retikulum (ER), mitokondrierassocierat ER-membran (MAM), kärnhölje, plasmamembran, nukleoplasmatisk retikulum, kärna och mitokondrier. Trots alla dessa studier förblev den subcellulära lokaliseringen av Sigmar1 i hjärtat okänd20. Därför bestämdes den subcellulära lokaliseringen av Sigmar1 i hjärtvävnad med användning av QD-medierad immunmärkning följt av TEM-avbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 Mesh copper grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G200HH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-month-old male mice with FVB/N background</td>
			<td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 100%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sigmar1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>61994S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSAc (10%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>25557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal Xyl</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>8312-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DER 732C36AA10:C33</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Histo; Ultra 450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAE</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEOL-1400 Flash</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERL 4221</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A405P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 3%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16538-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromolds</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Genesse Scientific</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metaperiodate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (size 10)</td>
			<td>Aspen surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM&#160; image software</td>
			<td>AMT-V700</td>
			<td>AMT TEM imaging systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM imaging camera</td>
			<td>XR80 TEM series</td>
			<td>AMT TEM imaging systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O solution (0.5%)</td>
			<td>Fisher Scientic</td>
			<td>S25612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing subcellular localization of a protein in the heart using quantum dots-mediated immuno-labeling followed by transmission electron microscopy

Den subcellulära lokaliseringen är avgörande för att avgränsa korrekt funktion och bestämma de molekylära mekanismerna för ett visst protein. Flera kvalitativa och kvantitativa tekniker används för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av proteiner. En av de framväxande teknikerna för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av ett protein är kvantprickar (QD) -medierad immunmärkning av ett protein följt av avbildning av dem med transmissionselektronmikroskopi (TEM). QD är en halvledarnanokristall med en dubbel egenskap av kristallin struktur och hög elektrondensitet, vilket gör dem tillämpliga på elektronmikroskopi. Denna nuvarande metod visualiserade den subcellulära lokaliseringen av Sigma 1-receptor (Sigmar1) protein med QD-TEM i hjärtvävnaden på ultrastrukturell nivå. Små kuber av hjärtvävnadssektionerna från en vildmusmus fixerades i 3% glutaraldehyd, därefter osmicerade, färgade med uranylacetat, följt av sekventiell uttorkning med etanol och aceton. Dessa uttorkade hjärtvävnadssektioner inbäddades i epoxihartser med låg viskositet, skars i tunna sektioner med 500 nm tjocklek, sattes på gallret och utsattes därefter för antigenavmaskering med 5% natriummetaperiodat, följt av släckning av restaldehyderna med glycin. Vävnaderna blockerades, följt av sekventiell inkubation i primär antikropp, biotinylerad sekundär antikropp och streptavidinkonjugerad QD. Dessa färgade sektioner torkades fläcktorkade och avbildades med hög förstoring med TEM. QD-TEM-tekniken möjliggjorde visualisering av Sigmar1-proteinets subcellulära lokalisering på ultrastrukturell nivå i hjärtat. Dessa tekniker kan användas för att visualisera närvaron av någon protein och subcellulär lokalisering i vilket organsystem som helst.

Den nuvarande QD-TEM-metoden visualiserade närvaron av Sigmar1 och dess lokalisering på de subcellulära hjärtfacken genom att utföra anti-Sigmar1-riktad QD-märkning på ultratunna hjärtsektioner för vuxna musar. Elektrontät anti-Sigmar1-märkt QD på mitokondriella membran (inre och yttre), lysosomer och endoplasmatisk retikulum / sarkoplasmatisk retikulum (ER / SR) membran-mitokondriellt gränssnitt (figur 2A, B) illustrerades av QD-TEM-bilderna. Dessutom märktes hjärtsektioner också med kanin IgG och QD som en isotypkontroll för anti-Sigmar1 kanin primär antikropp (figur 2C, D). Därför belyste QD-TEM-avbildning lokaliseringen av endogena Sigmar1 och dess anrikning mestadels på lysosomerna och mitokondriella membranen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk illustration som visar de sekventiella stegen och procedurerna som används för att utföra QD-TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig02.jpg"> Figur 2: Sigmar1 immunmärkt QD i vuxna möss hjärtvävnader. (A,B) Representativa TEM-bilder som visar Sigmar1-märkt QD på mitokondrier (yttre och inre membran), mitokondrierassocierade endoplasmatiska retikulum (ER) / sarkoplasmatiska retikulum (SR) membran och lysosomer. (C,D) TEM-bild av hjärtsektionerna av isotypkontroll märkt med QD och kanin IgG. Skala bar: 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tilläggsfil 1: Sammansättning av PBS och andra lösningar som används för vävnadsuttorkning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy at JoV

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Detta protokoll beskriver en metod för immunmärkning av ett protein i hjärtvävnadssektionerna med hjälp av kvantprickar. Denna teknik ger ett användbart verktyg för att visualisera alla proteins subcellulära lokalisering och uttryck på ultrastrukturell nivå.

Visualisering av subcellulär lokalisering av ett protein i hjärtat med hjälp av kvantprickmedierad immunmärkning följt av transmissionselektronmikroskopi

The subcellular localization is critical to delineating proper function and determining the molecular mechanisms of a particular protein. Several ...

Att bestämma den subcellulära lokaliseringen av ett protein är avgörande för att avgränsa dess korrekta funktion och de mekanismer som är involverade i den. Denna metod kan hjälpa oss att visualisera den subcellulära lokaliseringen av ett protein på ultrastrukturnivå. Kvantprickmedierad immunmärkning är mer stabil, resistent mot fotoblekning, har sina egna emissionsspektra, ger hög elektrondensitet och visar högre effektivitet och retention på vävnader med bättre penetration i vävnader.Flera steg i processen, det vill säga fixering, etsning, blockering och optimal koncentration av kvantprickar, är utmanande steg att optimera. Det är lämpligt att prova flera tidpunkter och koncentrationer av de använda reagenserna. En annan utmaning är att hantera nät för vilka bara tålamod och naturligtvis övning fungerar.Att demonstrera proceduren kommer att vara Chowdhury Abdullah, en postkamrat, Naznin Remex, en doktorand från mitt laboratorium, och Brandon Hartman, elektronmikroskopihandledare från våra elektronmikroskopitjänster. Efter att ha bedövat mössen och öppnat bröstkaviteten, rikligt hjärtat med iskall 3% glutaraldehyd i 0,1 molar natriumkakodylatbuffert i två minuter. Använd en 25 gauge nål på fem x åtta tum för att införa fixativen i hjärtat med hjälp av tyngdkraftstrycket.Omedelbart efter att hjärtat börjar fyllas med fixeringsmedlet, lyft hjärtans topp för att lindra trycket. Skär kärlen under med en till två millimeter från hjärtat och låt vätskorna rinna av. Dissekera hjärtat.Ta bort förmaken och släpp ventriklarna i en petriskål som innehåller iskall 3% glutaraldehyd och 0,1 molar natriumkakodylat. Gör en fjärilsskärning efter 30 till 60 minuters fixering och placera ventrikeln tillbaka i petriskålen. Hacka hjärtat med ett kirurgiskt blad i små kuber på en kubik millimeter.Fixa och sänk ner den dissekerade hjärtvävnaden i glutaraldehyd och kakodylatlösning i 24 timmar vid fyra grader Celsius. Efter 24 timmars fixering, tvätta vävnaden i 0,1 molar natriumkakodylatbuffert två gånger i 20 minuter. Ta bort vävnaden från natriumkakodylatbufferten och sänk ner i 2% osmiumtetroxidlösning i fyra timmar vid rumstemperatur.Efter osmos, sänk ner vävnaden i 2% natriumacetatlösning i 10 minuter vid rumstemperatur. Sänk sedan ner vävnaden i 2% uranylacetatlösning i en timme vid rumstemperatur. Efter färgning av uranylacetat, dehydrera vävnaden sekventiellt genom de graderade alkoholerna och acetonen.Bädda in den uttorkade vävnaden i epoxiharts med låg viskositet enligt beskrivningen i manuskriptet. Lägg vävnaden i färskt harts i åtta millimeter mikroformar och bota den inbäddade vävnaden vid 70 grader Celsius över natten. Efter att ha hittat intresseområdet, med en ultra 45 graders kniv, producera blekt guld ultratunna sektioner.Placera dessa ultratunna sektioner på den tråkiga sidan av ett 200-näts kopparnät. Börja färgningen genom att avmaskera antigenet genom att sätta 20 mikroliter etsningslösning metaperiodat på en ren paraffinfilm. Placera det torkade gallret med vävnadssektioner på etsningslösningens droppe.Lämna sektionsnätet på lösningen i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta de etsade vävnadssektionerna genom att placera dem på en droppe destillerat vatten i 60 sekunder. Blockera restaldehyderna genom att placera sektionsnätet på en droppe av 0,05 molar glycinlösning i 10 minuter vid rumstemperatur.Torka gallrets kanter på filterpapper för att ta bort den kvarvarande glycinlösningen. Placera sektionsnätet i 10 till 20 mikroliter blockerande lösning i 25 minuter vid rumstemperatur. Torka gallerkanterna på filterpapper och placera gallersektionerna på antikroppsutspädningsmedel för konditionering vid rumstemperatur i 10 minuter.Inkubera gallersektionerna med primär antikropp i en timme och 30 minuter i en fuktad kammare. Blot torka gallret och tvätta gallersektionerna med antikroppsutspädningsmedel två gånger i fem minuter vardera. Inkubera gallersektionerna med biotinylerad sekundär antikropp i en timme i en fuktad kammare.När gallret har torkats, tvätta gallersektionerna med antikroppsutspädningsmedel två gånger i fem minuter vardera. Inkubera rutnätssektionerna i kommersiellt tillgänglig streptavidinkonjugerad QD i en timme i en kammare vid rumstemperatur. Förhindra exponering för ljus genom att täcka kammaren med aluminiumfolie.Efter torkning av gallerkanterna med filterpapper, tvätta gallersektionerna genom att placera dem på vattendroppar i två minuter och torka gallerkanterna för att torka. Sätt in provhållaren i mikroskopkolonnen och koppla in pumpomkopplaren för att utvärdera goniometern, följt av fullständig insättning av provhållaren i mikroskopkolonnen. Fokusera väl på önskat område.Ta bilden med en höghastighets digitalkamera och spara filen i tif-format. Mitokondriella membran, lysosomer och endoplasmatisk retikulum eller sarkoplasmatisk retikulummembran mitokondriellt gränssnitt visade närvaron av Sigmar1-märkta kvantprickar. Hjärtsektioner visualiserades med hjälp av kaninimmunglobulin G och kvantprickar som en isotypkontroll för anti-Sigmar1 kanin primär antikropp.En viktig sak att tänka på när du arbetar med detta protokoll är att avmaskera tiden för antigen. Om vävnadssektionerna etsas för länge kommer metaperiodatlösningen att skapa perforeringar i tunna vävnadssektioner. Kvantprickmedierad märkning får uppmärksamhet inom tumördetektering, tumörmolekylär och immunstatusprofilering och vävnadsavbildning som banar ett nytt sätt för medicinsk diagnostik.Kvantprickar är också användbara vid behandling av tumörer via fotodynamiska terapier och oftalmiska anomalier genom att leverera medicin till ögonen.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualisera bultande hjärta i Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Beredning av embryon för elektronmikroskopi av Drosophila Embryonala hjärta tub

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualisera RNA lokalisering i Xenopus Oocyter

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Detektering av kväveoxid och superoxidradikalanjonen genom elektronparamagnetisk resonans-spektroskopi från celler med användning av spin traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: proteinlokalisering Använda Photo-aktiverad lokalisering Mikroskopi och elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Frysning: ett verktyg för Ultra och immunlokalisering Studier av suspensionsceller i transmissionselektronmikroskopi

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Provberedning och avbildning av Exosomes av transmissionselektronmikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniatyriserade provberedning för transmissionselektronmikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Att upptäcka Protein subcellulär lokalisering av grönt fluorescerande Protein taggning och 4', 6-diamidin-2-fenylindol färgning i Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...