Name: reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00
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Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health (NIH) Grant Nr. R01 GM-130934 und National Science Foundation (NSF) Grant MCB-2016022. B.N.C., E.J.D.V. und K.S.C. wurden zum Teil durch einen Zuschuss des National Institute of General Medical Sciences im Rahmen der Auszeichnung T32 GM119999 unterstützt.

HINWEIS: Die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten erfordert die Herstellung von monodispersen kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs). Bitte beachten Sie ein bereits veröffentlichtes Protokoll24 zur SUV-Formation. Kurz gesagt, alle SUVs werden durch Sondenbeschallung für insgesamt 12 min bei 70% Amplitude über 4 min Beschallungsperioden gebildet, gefolgt von 2 min Ruhezeiten in Eiswasser. SUV-Lösungen müssen gut geklärt und monodispers sein. Größenverteilungen von SUVs können be...

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	<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li><li>Parthasarathy, R., Groves, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+geometry-driven+localization+of+a+small+protein.">Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).</li><li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix.">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li><li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes.">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li><li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size.">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).</li><li>Ferhan, A. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography.">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li><li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes.">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li><li>Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. 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A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers.">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li><li>Hupfeld, S., Hols&#230;ter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+size+analysis+by+dynamic/static+light+scattering+upon+size+exclusion-/field+flow-fractionation.">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).</li><li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies.">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li><li>Woods, B. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism.">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments.">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).</li><li>Reimhult, E., H&#246;&#246;k, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution:+Influence+of+surface+chemistry,+vesicle+size,+temperature,+and+osmotic+pressure.">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li><li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. 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A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes:+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane.">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li><li>Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li></ol>

Zellmembranen nehmen viele verschiedene Formen, Krümmungen und physikalisch-chemische Eigenschaften an. Um die nanometergroße Maschinerie zu untersuchen, durch die Zellen mikrometergroße Baugruppen aufbauen, ist es notwendig, minimale Rekonstitutionssysteme der Membranmimetik zu entwerfen. Dieses Protokoll stellt Techniken vor, die sowohl die Membrankrümmung als auch die Zusammensetzung präzise steuern und es dem Benutzer ermöglichen, quantitative Fluoreszenzmessungen mit weit verbreiteten Mikroskopietechniken durc...

Die Formen der Zellen und viele ihrer inneren Kompartimente hängen von den Lipidmembranen ab, die sie umgeben. Membranen sind viskoelastische Strukturen, die durch Wechselwirkungen mit Proteinen, Lipidsortierung und wirkende innere und äußere Kräfte verformt werden können, um eine Vielzahl von Formenzu erzeugen 1,2,3,4. Diese Formen werden oft in Form von Membrankrümmung beschrieben. Zellen verwenden eine Vielzahl von Proteinen, die in der Lage sind, sich bevorzugt auf bestimmte Membrankrümmungen zu setzen oder diese zu "erfassen", um eine definierte räumlich-zeitliche Kontrolle über Prozesse wie Zellverkehr, Zytokinese und Migration sicherzustellen 5,6. Die Dynamik der Zellmaschinerie an der Membran ist aufgrund der Schwierigkeit, Zeit und räumliche Auflösung mit der Zellgesundheit in Einklang zu bringen, besonders schwer zu beobachten. Während Super-Resolution-Techniken eine detaillierte Ansicht solcher Strukturen bieten können, erfordern sie langwierige Akquisitionen, die für die meisten Maschinen nicht für die Zeitskalen der Montage / Demontage zugänglich sind. Darüber hinaus machen die molekulare Komplexität dieser Baugruppen in ihrer nativen Umgebung und die Vielzahl der Rollen, die eine einzelne Komponente spielen kann, minimale Rekonstitutionssysteme zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der Funktionsfähigkeit von Molekülen.
Minimale Membranmimetika wurden entwickelt, um Membraneigenschaften und Protein-Membran-Interaktionen außerhalb der Zelle zu untersuchen. Die Membranmimetik variiert von freistehenden Lipiddoppelschichten wie Liposomen oder riesigen unilamellären Vesikeln bis hin zu unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) 7,8,9,10. SLBs sind biomimetische Membranen, die auf dem darunter liegenden Träger verankert sind und typischerweise aus Glas, Glimmer oder Kieselsäure11,12 bestehen. Eine Vielzahl von Geometrien kann verwendet werden, einschließlich planarer Oberflächen, Kugeln, Stäbchen und sogar wellenförmiger oder mikrostrukturierter Substrate, um Protein-Membran-Wechselwirkungen auf konkaven und konvexen Krümmungen gleichzeitig zu untersuchen1 3,14,15,16,17,18 . Die Bilayer-Bildung beginnt mit der Adsorption von Vesikeln auf eine hydrophile Oberfläche, gefolgt von Fusion und Bruch zu einer kontinuierlichen Doppelschicht (Abbildung 1)19. Unterstützte Doppelschichten sind besonders licht- und elektronenmikroskopisch zugänglich und bieten sowohl eine bessere zeitliche als auch eine bessere räumliche Auflösung, als dies in Zellen oft möglich ist. Gekrümmte SLBs bieten insbesondere ein attraktives Mittel, um die Proteinkrümmungsempfindlichkeit ohne signifikante Membranverformung zu untersuchen, so dass zwischen Krümmungsmessung und Krümmungsinduktion unterschieden werden kann, die in freistehenden Systemen oft unmöglich zu trennen sind.
Septine sind eine Klasse von filamentbildenden zytoskelettalen Proteinen, die für ihre Fähigkeit bekannt sind, sich auf positiv gekrümmten Membranen zu sammeln 6,18,20. Im Laufe des Zellzyklus in Hefe lagern sich Septine zu einem Ring zusammen und müssen sich neu anordnen, um die Sanduhr- und Doppelringstrukturen zu bilden, die mit der Knospenentstehung bzw. Zytokinese verbunden sind21. Während schöne Arbeiten mit Platin-Replikatelektronenmikroskopie durchgeführt wurden, um die Septinarchitektur in verschiedenen Zellzyklusstadien22 zu beobachten, ist die Beobachtung der Septin-Montage im Laufe der Zeit mit Lichtmikroskopie in Hefe auf eine begrenzte räumliche Auflösung gestoßen. Frühere Arbeiten an Septinen unter Verwendung von Lipidmonoschichten, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht wurden, konnten mehrere interessante Septinstrukturen wie Ringe, Bündel und Gazerekonstruieren 23. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmikroskopie sind EM-Techniken jedoch ebenfalls in ihrer zeitlichen Auflösung begrenzt. Um die kinetischen Parameter des Multiskalenprozesses der Septin-Montage besser zu lösen, haben wir uns der unterstützten Membranmimetik zugewandt, bei der die Membrangeometrie, die Probenbedingungen und die Bildgebungsmodalität sorgfältig kontrolliert werden können.
Die hier beschriebenen Protokolle verwenden planare oder gekrümmte SLBs, gereinigtes Protein und eine Kombination von Mikroskopietechniken. Die quantitative Fluoreszenzkonfokalmikroskopie und die totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) wurden verwendet, um sowohl die Bindung von Massenproteinen an verschiedene Membrankrümmungen als auch die Bindungskinetik einzelner Moleküle zu messen. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll angepasst, um mit der Rasterelektronenmikroskopie (REM) verwendet zu werden, um die Proteinultrastruktur auf verschiedenen Membrankrümmungen zu untersuchen. Während der Fokus dieser Protokolle auf dem Septin-Zytoskelett liegt, können die Protokolle leicht modifiziert werden, um die Krümmungsempfindlichkeit jedes Proteins zu untersuchen, das der Leser interessant findet. Darüber hinaus können diejenigen, die in Bereichen wie Endozytose oder vesikulärem Verkehr arbeiten, diese Techniken nützlich finden, um die krümmungsabhängigen Anordnungen von Multiproteinkomplexen zu untersuchen.

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		<tr>
			<td>0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural</td>
			<td>Watson</td>
			<td>137-211C(EX)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL low adhesion tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4612-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for making PEGylated coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152450</td>
			<td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Liss Rhodamine PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Sodium Cacodylate Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M052-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglass coverslips for planar bilayers</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>22x22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Functionalized Silica Microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratories, Inc.</td>
			<td>Depends on size: SS0200*-SS0500*</td>
			<td>Silica in aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Thorlabs</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>Flexible adhesive for glass or plastics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20816-12-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-25</td>
			<td>Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0395-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverglass, #1.5 12mm&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td>Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy PI</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>ENF-260C</td>
			<td>115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanGlass Microfiber Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28455-030</td>
			<td>42.5 mm diameter, Grade GF/C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions

Die meisten Zellen können ihre Form wahrnehmen und verändern, um grundlegende Zellprozesse durchzuführen. Bei vielen Eukaryoten ist das Septin-Zytoskelett ein integraler Bestandteil bei der Koordination von Formveränderungen wie Zytokinese, polarisiertem Wachstum und Migration. Septine sind filamentbildende Proteine, die sich zu verschiedenen Strukturen höherer Ordnung zusammensetzen und in vielen Fällen in verschiedenen Bereichen der Plasmamembran vorkommen, insbesondere in Regionen mit positiver Krümmung im Mikrometerbereich. Die Überwachung des Prozesses der Septinmontage in vivo wird durch die Einschränkungen der Lichtmikroskopie in Zellen sowie durch die Komplexität der Wechselwirkungen mit Membranen und Zytoskelettelementen behindert, was es schwierig macht, die Septindynamik in lebenden Systemen zu quantifizieren. Glücklicherweise gab es in den letzten zehn Jahren erhebliche Fortschritte bei der Rekonstitution des Septin-Zytoskeletts in einem zellfreien System, um die Mechanismen zu sezieren, die die Septin-Assemblierung bei hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen steuern. Die Kernschritte der Septin-Assemblierung umfassen die Septin-Heterooligomer-Assoziation und Dissoziation mit der Membran, die Polymerisation in Filamente und die Bildung von Strukturen höherer Ordnung durch Wechselwirkungen zwischen Filamenten. Hier stellen wir drei Methoden vor, um die Septinmontage in verschiedenen Kontexten zu beobachten: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen. Diese Methoden können verwendet werden, um die biophysikalischen Parameter von Septinen in verschiedenen Stadien der Montage zu bestimmen: als einzelne Oktamere, die die Membran binden, als Filamente und als Anordnungen von Filamenten. Wir verwenden diese Parameter gepaart mit Messungen der Krümmungsprobenahme und der bevorzugten Adsorption, um zu verstehen, wie die Krümmungsmessung auf einer Vielzahl von Längen- und Zeitskalen funktioniert.

Nach der Herstellung jedes SLB können Septine oder das interessierende Protein mit der gewünschten Unterstützung inkubiert und mittels TIRFM, konfokaler Mikroskopie oder REM abgebildet werden. Die hier gezeigten Ergebnisse verwenden Septine, die rekombinant exprimiert und gereinigt aus E. coli17 hergestellt werden. Mit TIRFM auf planaren SLBs ist es möglich, die Länge von Filamenten und ihre Flexibilität zu bestimmen, die Diffusionskoeffizienten zu messen und die Montage über die Z...

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Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Dieses Protokoll wird denjenigen, die an membranbindenden Proteinen arbeiten, helfen, zu bestimmen, wie die Membranform eine Rolle bei der Organisation von Proteinanordnungen spielt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit für Proteintyp, Membranzusammensetzung und Membrangeometrie. Es ermöglicht auch die Frage, wie eine Lipiddoppelschicht die Eigenschaften assoziierter Proteine verändern kann.Um eine gute Membran für das Experiment zu identifizieren, schlagen wir vor, eine Checkliste zu erstellen, die die Lipiddiffusionsraten, die Mobilität des interessierenden Proteins und die Frage, ob ungeplatzte Liposomen oder verschmolzene Liposomen an der Oberfläche haften, enthalten könnte. Um mit der Plasmareinigung der Objektträger zu beginnen, reinigen Sie den Plasmareiniger fünf Minuten lang mit Sauerstoff, um Luft aus den Leitungen und der Kammer zu entfernen. Ordnen Sie die Objektträger aus trockenem Deckglas in einer Keramikwiege an.Strömen Sie während des Spülens ein Inertgas über die Mikrodeckglasobjektträger, um Staub und Partikel zu entfernen. Platzieren Sie die Wiege an der Rückseite der Plasmakammer so, dass die Deckgläser parallel zum langen Rand der Kammer sind. Lassen Sie den Plasmareiniger 15 Minuten lang mit Sauerstoff bei maximaler Leistung laufen.Für die Kammervorbereitung schneiden Sie die Kappe knapp unter dem mattierten Teil eines 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens ab. Bemalen Sie den Rand der PCR-Röhre mit UV-aktiviertem Klebstoff, um das Innere des Röhrchens zu vermeiden. Legen Sie den PCR-Röhrchenkleber vorsichtig in die Mitte eines plasmagereinigten Deckglases und stellen Sie die Kammer dann fünf bis sieben Minuten lang unter langwelliges UV-Licht, um den Klebstoff auszuhärten.Um eine Doppelschicht zu bilden, fügen Sie die Reagenzien in die Vertiefung hinzu. Schütteln Sie die Kammern vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die SUVs zu stören, und inkubieren Sie dann 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation spülen Sie die Doppelschicht sechsmal mit 150 Mikrolitern SLBB durch Pipettieren, um überschüssige Lipide wegzuwaschen, dann waschen Sie die Doppelschicht sechsmal mit 150 Mikrolitern Reaktionspuffer, bevor Sie mit den Septinen inkubieren.Entfernen Sie im letzten Waschschritt den Reaktionspuffer und lassen Sie 75 Mikroliter im Bohrloch. Fügen Sie 25 Mikroliter Septine in SSB verdünnt hinzu und Bild durch TIRF-Mikroskopie. Zuerst die Flasche mit Siliziumdioxid-Mikrosphären für 15 Sekunden vorstruken, dann eine Minute lang beschallen und erneut 15 Sekunden lang wirbeln, um alle Cluster zu brechen.Mischen Sie die Perlen mit SLBB und 10 Mikrolitern von fünf Millimolar-SUVs in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adhäsion. Inkubieren Sie die Perllipidmischung für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Shaker, um eine Sedimentation zu verhindern. In der Zwischenzeit tauen Sie ein pegyliertes Deckglas auf und kleben ein geschnittenes 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen darauf.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Perlen für 30 Sekunden am vorgesehenen RCF. Nach dem ersten Spin 50 Mikroliter Überstand entfernen, dann 200 Mikroliter PRB hinzufügen und durch kräftiges Pipettieren mischen. Für die nächsten Runden 200 Mikroliter PRB entfernen und nach dem zweiten und dritten Spin weitere 200 Mikroliter und nach dem vierten Spin 220 Mikroliter PRB hinzufügen.Wenn Sie einen Wettkampftest mit mehreren Kugelgrößen durchführen, bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie gleiche Volumina jeder Kugelgröße mischen und 29 Mikroliter dieser Perlenmischung mit 721 Mikrolitern Reaktionspuffer verdünnen, dann 75 Mikroliter verdünnte Kügelchen und 25 Mikroliter des in SSB verdünnten Proteins in die Vertiefungen geben und mischen. Wenn Sie Septine im stationären Zustand messen, inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur und nehmen Sie dann entweder in der Nähe von TIRF oder konfokale Mikroskopie ab. TIRF-Mikroskopaufnahmen von planaren SLBs, die mit grün dargestellten Septinen inkubiert wurden, zeigten eine homogene Proteinverteilung.SLBs aus schlecht gereinigten Glasdeckgläsern zeigten Löcher oder Lücken in der Doppelschicht in Regionen mit niedrigem Septin. Nicht geplatzte und tubulierte Liposomen können sich auf der Oberfläche ansammeln, wenn alte Liposomen verwendet werden oder wenn die Waschungen nicht streng sind. In Mikroskopaufnahmen von lipidbeschichteten Mikrokugeln, die mit Rhodamin visualisiert wurden, zeigte PE eine glatte Doppelschichtabscheidung.Die kugelförmigen Stützen waren gleichmäßig von der Membran bedeckt und es gab nur wenige Perlencluster. Unzureichendes Waschen von überschüssigen Lipiden verursachte eine ungleichmäßige Membranbeschichtung, wie sie von Lipidklumpen beobachtet wurde, und unsachgemäße Handhabung verursachte Lücken in der Doppelschicht. Unzureichendes Mischen von Perlen verursachte Verklumpungen, was für die Messung der gesamten Proteinabsorption nicht ideal ist.Mit den hier vorgestellten unterstützten Lipiddoppelschichten können andere Methoden wie die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie, die Massenzytometrie von Membranen und die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie durchgeführt werden, um verschiedene Protein-Protein- oder Protein-Membran-Dynamiken zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Forschung

Biochemie

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Ein planarischer Motilitätstest zur Messung der biomodulierenden Eigenschaften natürlicher Produkte

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...