Name: reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00
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이 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 No의 지원을 받았다. R01 GM-130934 및 NSF (National Science Foundation) 그랜트 MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., K.S.C.는 T32 GM119999 어워드에 따라 국립 일반 의료 과학 연구소의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

참고: 지지된 지질 이중층을 형성하려면 단분산 된 소형 일조기 소포 (SUV)를 준비해야합니다. SUV 형성에 대해 이전에 발표 된 프로토콜24를 참조하십시오. 간단히 말해서, 모든 SUV는 4 분 초음파 처리 기간을 통해 70 % 진폭에서 총 12 분 동안 프로브 초음파 처리에 의해 형성되고 얼음물에서 2 분의 휴식 기간이 뒤 따른다. SUV 솔루션은 크기가 잘 명확하고 단분산되어야합니다. SUV의 ...

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	<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li><li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curvature+and+spatial+organization+in+biological+membranes.">Curvature and spatial organization in biological membranes.</a> Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).</li><li>Mao, Y., Baum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug+of+war-The+influence+of+opposing+physical+forces+on+epithelial+cell+morphology.">Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology.</a> Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).</li><li>Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+organization+in+mixed+lipid+membranes+driven+by+intrinsic+curvature+difference.">Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).</li><li>Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArfGAP1+responds+to+membrane+curvature+through+the+folding+of+a+lipid+packing+sensor+motif.">ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif.</a> The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).</li><li>Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+lateral+diffusion+of+dipalmitoylphosphatidylcholine+adsorbed+on+silica+beads+in+the+absence+and+presence+of+melittin:+A+31P+two-dimensional+exchange+solid-state+NMR+study.">Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study.</a> Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).</li><li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+nanoparticle+supported+lipid+bilayers+for+the+structural+study+of+membrane+geometry-sensitive+molecules.">Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).</li><li>Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sub-nanometre+view+of+how+membrane+curvature+and+composition+modulate+lipid+packing+and+protein+recruitment.">A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment.</a> Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).</li><li>Gill, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+geometry-driven+localization+of+a+small+protein.">Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).</li><li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix.">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li><li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes.">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li><li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size.">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).</li><li>Ferhan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoplasmonic+sensing+architectures+for+decoding+membrane+curvature-dependent+biomacromolecular+interactions.">Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions.</a> Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Lou, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography.">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li><li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes.">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li><li>Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amphipathic+helix+enables+septins+to+sense+micrometer-scale+membrane+curvature.">An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature.</a> Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).</li><li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+of+supported+bilayer+formation+probed+by+single+vesicle+fluorescence+assays.">Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li><li>Lobato-M&#225;rquez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+into+bacterial+entrapment+by+septin+cage+reconstitution.">Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution.</a> Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).</li><li>Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cortex+at+the+yeast+mother-bud+neck.">The septin cortex at the yeast mother-bud neck.</a> Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).</li><li>Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+dynamic+remodelling+of+the+septin+cytoskeleton+during+the+cell+cycle.">Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle.</a> Nature Communications. 5, 1-10 (2014).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers.">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li><li>Hupfeld, S., Hols&#230;ter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+size+analysis+by+dynamic/static+light+scattering+upon+size+exclusion-/field+flow-fractionation.">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).</li><li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies.">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li><li>Woods, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+governing+septin+assembly.">Biophysical properties governing septin assembly.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Cannon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism.">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments.">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).</li><li>Reimhult, E., H&#246;&#246;k, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution:+Influence+of+surface+chemistry,+vesicle+size,+temperature,+and+osmotic+pressure.">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li><li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+phospholipid+bilayers+on+molecular+surfaces:+Role+of+surface+charge+density+and+electrostatic+interaction.">Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).</li><li>Andrews, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+lipid+bilayers+(SLBs)+from+buffers+containing+low+concentrations+of+group+I+chloride+salts.">Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts.</a> Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).</li><li>Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes:+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane.">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li><li>Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li></ol>

세포막은 다양한 모양, 곡률 및 물리 화학적 특성을 취합니다. 세포가 마이크로미터 규모의 어셈블리를 구축하는 나노미터 규모의 기계를 연구하기 위해서는 멤브레인 모방체의 최소 재구성 시스템을 설계할 필요가 있다. 이 프로토콜은 막 곡률과 조성을 정밀하게 제어하면서 사용자가 널리 이용 가능한 현미경 기술을 사용하여 정량적 형광 측정을 쉽게 수행 할 수있게 해주는 기술을 제시합니?...

세포의 모양과 많은 내부 구획은 그들을 둘러싸고있는 지질 막에 의존합니다. 막은 단백질과의 상호작용, 지질 분류 및 내외부 힘의 작용을 통해 변형되어 다양한 형상 1,2,3,4을 생성할 수 있는 점탄성 구조이다. 이러한 형상은 종종 막 곡률의 관점에서 설명된다. 세포는 세포 밀매, 사이토카인증 및 이동5,6을 포함하는 과정에 대해 정의된 시공간적 제어를 보장하기 위해, 특정 막 곡률에 우선적으로 조립하거나 "감지"할 수 있는 다양한 단백질 세트를 사용한다. 멤브레인에서 세포 기계의 역학은 시간과 공간 분해능과 세포 건강의 균형을 맞추는 것이 어렵 기 때문에 관찰하기가 특히 어렵습니다. 초분해능 기술은 이러한 구조에 대한 자세한 보기를 제공할 수 있지만, 대부분의 기계류에서 조립/분해의 시간 척도에 부합하지 않는 긴 인수가 필요합니다. 또한, 이러한 어셈블리의 기본 환경에서 분자 복잡성과 단일 구성 요소가 수행 할 수있는 다양한 역할은 최소한의 재구성 시스템을 분자의 기능적 능력을 연구하는 데 유용한 도구로 만듭니다.
세포 외부의 막 특성 및 단백질-막 상호작용을 연구하기 위해 최소한의 막 모조물이 개발되었다. 막 모조물은 리포솜 또는 거대한 유니라멜라 소포와 같은 독립형 지질 이중층으로부터 지지된 지질 이중층(SLBs)7,8,9,10에 이르기까지 다양하다. SLB는 기본 지지체에 앵커링된 생체모방 막으로, 전형적으로 유리, 운모 또는 실리카11,12로 구성된다. 평면 표면, 구체, 막대, 심지어 오목한 곡률과 볼록한 곡률 모두에서 단백질-막 상호작용을 동시에 조사하기 위해 기복 또는 미세패턴화된 기판을 포함한 다양한 형상을 사용할 수 있습니다1 3,14,15,16,17,18 . 이중층 형성은 친수성 표면 상에 소낭 흡착으로 시작하고, 이어서 융합 및 파열이 뒤이어 연속적인 이중층을 형성한다(도 1)19. 지지되는 이중층은 특히 빛과 전자 현미경에 적합하며, 세포에서 종종 달성할 수 있는 것보다 더 나은 시간과 공간 분해능을 제공한다. 곡선형 SLB는 특히 상당한 막 변형이 없을 때 단백질 곡률 감도를 프로브하는 매력적인 수단을 제공하여 곡률 감지와 곡률 유도를 구별할 수 있으며, 이는 종종 독립 시스템에서 분리할 수 없습니다.
셉틴은 필라멘트-형성 세포골격 단백질의 부류로서 양성 곡선 막(6,18,20)에 조립하는 능력으로 잘 알려져 있다. 효모에서 세포 주기의 과정에 걸쳐, 셉틴은 고리로 조립하고, 새싹 출현 및 사이토카인증과 관련된 모래시계 및 이중 고리 구조를 형성하기 위해 재배열되어야 한다(21). 다양한 세포주기 단계22에서 셉틴 구조를 관찰하기 위해 백금 복제 전자 현미경을 사용하여 아름다운 작업이 수행되었지만 효모에서 광 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 셉틴 조립을 관찰하는 것은 제한된 공간 해상도를 충족했습니다. 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 시각화 된 지질 단층을 사용하는 셉틴에 대한 이전의 연구는 고리, 번들 및 거즈23과 같은 몇 가지 흥미로운 셉틴 구조를 재구성 할 수있었습니다. 그러나, EM 기술은 형광 현미경과 달리 그들의 시간적 분해능에서 마찬가지로 제한된다. 셉틴 어셈블리의 다중 스케일 공정의 운동 파라미터를 더 잘 해결하기 위해, 우리는 멤브레인 지오메트리, 샘플 조건 및 이미징 양식을 신중하게 제어 할 수있는 지원되는 멤브레인 모방체로 전환했습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 평면 또는 곡선형 SLB, 정제된 단백질 및 현미경 기술의 조합을 사용합니다. 정량적 형광 공초점 현미경 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 사용하여 다양한 막 곡률에 대한 벌크 단백질 결합을 측정하고 단일 분자의 결합 동역학을 측정했습니다. 또한,이 프로토콜은 주사 전자 현미경 (SEM)과 함께 사용하여 다른 막 곡률에서 단백질 울트라 구조를 검사하도록 조정되었습니다. 이러한 프로토콜의 초점은 셉틴 세포 골격에 있지만, 프로토콜은 독자가 흥미를 느끼는 모든 단백질의 곡률 감도를 조사하기 위해 쉽게 변형 될 수 있습니다. 추가적으로, 엔도사이토시스 또는 수포 밀매와 같은 분야에서 일하는 사람들은 다중 단백질 복합체의 곡률 의존성 어셈블리를 프로빙하는데 유용한 이들 기술을 발견할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural</td>
			<td>Watson</td>
			<td>137-211C(EX)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL low adhesion tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4612-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for making PEGylated coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152450</td>
			<td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Liss Rhodamine PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Sodium Cacodylate Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M052-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglass coverslips for planar bilayers</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>22x22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Functionalized Silica Microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratories, Inc.</td>
			<td>Depends on size: SS0200*-SS0500*</td>
			<td>Silica in aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Thorlabs</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>Flexible adhesive for glass or plastics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20816-12-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-25</td>
			<td>Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0395-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverglass, #1.5 12mm&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td>Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy PI</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>ENF-260C</td>
			<td>115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanGlass Microfiber Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28455-030</td>
			<td>42.5 mm diameter, Grade GF/C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions

대부분의 세포는 근본적인 세포 과정을 수행하기 위해 모양을 감지하고 변경할 수 있습니다. 많은 진핵생물에서, 셉틴 세포골격은 사이토카인증, 편광된 성장 및 이동과 같은 형태 변화를 조정하는데 필수적인 성분이다. 셉틴은 다양한 고차 구조를 형성하기 위해 조립하는 필라멘트 형성 단백질이며, 많은 경우 원형질막의 다른 영역, 특히 미크론 규모의 양성 곡률 영역에서 발견됩니다. 생체 내에서 셉틴 조립 과정을 모니터링하는 것은 세포의 광 현미경 검사의 한계뿐만 아니라 막 및 세포 골격 요소와의 상호 작용의 복잡성으로 인해 방해를 받아 살아있는 시스템에서 셉틴 역학을 정량화하기가 어렵습니다. 다행스럽게도, 지난 십 년 동안 높은 공간 및 시간적 해상도에서 셉틴 어셈블리를 제어하는 메커니즘을 해부하기 위해 세포없는 시스템에서 셉틴 세포 골격을 재구성하는 데 상당한 진전이있었습니다. 셉틴 조립의 핵심 단계는 셉틴 헤테로올리고머 회합 및 막과의 해리, 필라멘트로의 중합, 필라멘트 간의 상호작용을 통한 고차 구조의 형성을 포함한다. 여기에서는 다른 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 방법을 제시합니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대. 이러한 방법은 조립의 여러 단계에서 셉틴의 생물 물리학 적 매개 변수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 : 멤브레인을 결합하는 단일 옥타머로서, 필라멘트로서, 필라멘트의 어셈블리로. 우리는 곡률 샘플링 및 우대 흡착의 측정과 함께 이러한 매개 변수를 사용하여 곡률 감지가 다양한 길이 및 시간 척도에서 어떻게 작동하는지 이해합니다.

각각의 SLB의 제조에 이어서, 셉틴 또는 관심있는 단백질은 원하는 지지체와 함께 인큐베이션되고 TIRFM, 공초점 현미경 또는 SEM을 통해 영상화될 수 있다. 여기에 나타낸 결과는 대장균17로부터 재조합적으로 발현되고 정제된 셉틴을 사용한다. 평면 SLB에서 TIRFM을 사용하면 필라멘트의 길이와 유연성을 결정하고 확산 계수를 측정하며 시간28,29<sup c...

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Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

이 프로토콜은 막 결합 단백질을 연구하는 사람들을 안내하여 막 모양이 단백질 어셈블리 조직에서 어떻게 역할을 하는지 결정합니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 유형, 막 구성 및 막 형상에 대한 다양성입니다. 또한 지질 이중층이 관련 단백질의 특성을 어떻게 변화시킬 수 있는지에 대한 질문을 허용합니다.실험에 적합한 막을 식별하려면 지질 확산 속도, 관심 단백질의 이동성, 표면에 붙어 있는 파열되지 않은 리포좀 또는 융합된 리포좀이 있는지 여부를 포함할 수 있는 체크리스트를 설정하는 것이 좋습니다. 슬라이드의 플라즈마 청소를 시작하려면 플라즈마 클리너를 산소로 5 분 동안 퍼지하여 라인과 챔버에서 공기를 제거하십시오. 건식 커버 유리 슬라이드를 세라믹 크래들에 배열합니다.퍼지하는 동안 마이크로 커버 유리 슬라이드 위로 불활성 가스를 흘려 먼지와 미립자를 제거합니다. 커버 슬립이 챔버의 긴 가장자리와 평행이 되도록 크래들을 플라즈마 챔버 뒤쪽에 놓습니다. 최대 전력의 산소로 플라즈마 클리너를 15 분 동안 작동하십시오.챔버 준비를 위해 0.2 밀리리터 PCR 튜브의 젖빛 부분 바로 아래의 캡을 잘라냅니다. 튜브 내부를 피하면서 UV 활성화 접착제로 PCR 튜브의 가장자리를 칠합니다. PCR 튜브 접착제를 플라즈마 세척 커버슬립의 중앙에 부드럽게 놓은 다음 챔버를 장파장 자외선 아래에 5-7분 동안 놓아 접착제를 경화시킵니다.이중층을 형성하려면 시약을 웰에 첨가하십시오. 챔버를 좌우로 부드럽게 흔들어 SUV를 방해 한 다음 섭씨 37도에서 20 분 동안 배양합니다. 배양 후, 과도한 지질을 씻어내기 위해 피펫팅하여 150마이크로리터의 SLBB로 이중층을 6회 헹구고, 이중층을 150마이크로리터의 반응 완충액으로 6회 세척한 후 셉틴과 함께 배양합니다.마지막 세척 단계에서 반응 완충액을 제거하고 웰에 75 마이크로리터를 남깁니다. SSB에 희석 된 25 마이크로 리터의 셉틴을 추가하고 TIRF 현미경으로 이미지화하십시오. 먼저, 실리카 마이크로스피어가 들어 있는 병을 15초 동안 와동시킨 다음, 1분 동안 초음파 처리하고 15초 동안 다시 와동시켜 클러스터를 파괴합니다.저접착 미세 원심분리 튜브에 비드를 SLBB 및 10마이크로리터의 5밀리몰 SUV와 혼합합니다. 비드 지질 혼합물을 침전을 방지하기 위해 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그 동안 페길화된 커버슬립을 해동하고 절단된 0.2밀리리터 PCR 튜브를 붙입니다.배양 후, 지정된 RCF에서 30초 동안 비드를 원심분리한다. 첫 번째 스핀 후 50 마이크로리터의 상청액을 제거한 다음 200 마이크로리터의 PRB를 추가하고 격렬한 피펫팅으로 혼합합니다. 다음 라운드를 위해 200 마이크로 리터의 PRB를 제거하고 두 번째 및 세 번째 스핀 후에 200 마이크로 리터를 추가하고 네 번째 스핀 후에 220 마이크로 리터의 PRB를 추가합니다.여러 비드 크기로 경쟁 분석을 수행하는 경우 각 비드 크기의 동일한 부피를 혼합하고 이 비드 혼합물 29마이크로리터를 721마이크로리터의 반응 완충액으로 희석하여 반응을 준비한 다음 75마이크로리터의 희석된 비드와 SSB에 희석된 단백질 25마이크로리터를 웰에 추가하고 혼합합니다. 정상 상태에서 셉틴을 측정하는 경우 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 TIRF 근처 또는 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 녹색으로 표시된 셉틴과 함께 배양 된 평면 SLB의 TIRF 현미경 사진은 균일 한 단백질 분포를 보였다.제대로 청소되지 않은 유리 커버슬립으로 만든 SLB는 낮은 셉틴 영역의 이중층에 구멍이나 틈이 있었습니다. 파열되지 않고 관형 리포좀은 오래된 리포좀을 사용하거나 세척이 엄격하지 않은 경우 표면에 축적될 수 있습니다. 로다민 PE를 사용하여 시각화된 지질 코팅된 마이크로스피어의 현미경 사진에서 부드러운 이중층 침착을 보여주었습니다.구형 지지체는 멤브레인에 의해 고르게 코팅되었으며 비드 클러스터가 거의 없었습니다. 과도한 지질의 불충분한 세척은 지질 덩어리에 의해 관찰되는 고르지 않은 막 코팅을 유발하고 부적절한 취급은 이중층에 틈을 일으켰습니다. 비드의 불충분한 혼합은 총 단백질 흡수를 측정하는 데 이상적이지 않은 응집을 일으켰습니다.여기에 제시된 지지된 지질 이중층을 사용하여 형광 수명 이미징 현미경, 막의 질량 세포분석 및 고속 원자력 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 다양한 단백질-단백질 또는 단백질-막 역학을 검사할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

연구

생화학

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

천연 물의 생물 조절 특성을 측정하는 플래니언 모틸리티 분석

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...