Name: reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00
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Este trabajo fue apoyado por la subvención no. R01 GM-130934 y National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. y K.S.C. fueron apoyados en parte por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales bajo el premio T32 GM119999.

NOTA: La formación de bicapas lipídicas soportadas requiere la preparación de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) monodispersadas. Consulte un protocolo24 publicado anteriormente sobre la formación de SUV. Brevemente, todos los SUV están formados por sonicación de sonda durante 12 minutos en total a una amplitud del 70% a través de períodos de sonicación de 4 minutos seguidos de períodos de descanso de 2 minutos en agua helada. Las soluciones SUV deben estar bien clarificadas y monod...

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	<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li><li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curvature+and+spatial+organization+in+biological+membranes.">Curvature and spatial organization in biological membranes.</a> Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).</li><li>Mao, Y., Baum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug+of+war-The+influence+of+opposing+physical+forces+on+epithelial+cell+morphology.">Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology.</a> Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).</li><li>Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+organization+in+mixed+lipid+membranes+driven+by+intrinsic+curvature+difference.">Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).</li><li>Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArfGAP1+responds+to+membrane+curvature+through+the+folding+of+a+lipid+packing+sensor+motif.">ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif.</a> The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).</li><li>Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+lateral+diffusion+of+dipalmitoylphosphatidylcholine+adsorbed+on+silica+beads+in+the+absence+and+presence+of+melittin:+A+31P+two-dimensional+exchange+solid-state+NMR+study.">Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study.</a> Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).</li><li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+nanoparticle+supported+lipid+bilayers+for+the+structural+study+of+membrane+geometry-sensitive+molecules.">Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).</li><li>Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sub-nanometre+view+of+how+membrane+curvature+and+composition+modulate+lipid+packing+and+protein+recruitment.">A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment.</a> Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).</li><li>Gill, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+geometry-driven+localization+of+a+small+protein.">Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).</li><li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix.">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li><li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes.">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li><li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size.">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).</li><li>Ferhan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoplasmonic+sensing+architectures+for+decoding+membrane+curvature-dependent+biomacromolecular+interactions.">Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions.</a> Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Lou, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography.">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li><li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes.">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li><li>Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. 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A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers.">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li><li>Hupfeld, S., Hols&#230;ter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+size+analysis+by+dynamic/static+light+scattering+upon+size+exclusion-/field+flow-fractionation.">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).</li><li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies.">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li><li>Woods, B. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism.">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments.">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).</li><li>Reimhult, E., H&#246;&#246;k, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution:+Influence+of+surface+chemistry,+vesicle+size,+temperature,+and+osmotic+pressure.">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li><li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+phospholipid+bilayers+on+molecular+surfaces:+Role+of+surface+charge+density+and+electrostatic+interaction.">Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).</li><li>Andrews, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+lipid+bilayers+(SLBs)+from+buffers+containing+low+concentrations+of+group+I+chloride+salts.">Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts.</a> Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).</li><li>Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes:+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane.">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li><li>Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li></ol>

Las membranas celulares adquieren muchas formas, curvaturas y propiedades fisicoquímicas diferentes. Para estudiar la maquinaria a escala nanométrica a través de la cual las células construyen ensamblajes a escala micrométrica, es necesario diseñar sistemas de reconstitución mínimos de mimética de membrana. Este protocolo presenta técnicas que controlan con precisión tanto la curvatura como la composición de la membrana, al tiempo que permiten al usuario tomar fácilmente mediciones cuantitativas de fluoresce...

Las formas de las células y muchos de sus compartimentos internos dependen de las membranas lipídicas que las rodean. Las membranas son estructuras viscoelásticas que pueden deformarse a través de interacciones con proteínas, clasificación de lípidos y fuerzas internas y externas que actúan para generar una variedad de formas 1,2,3,4. Estas formas a menudo se describen en términos de curvatura de la membrana. Las células utilizan un conjunto diverso de proteínas capaces de ensamblar preferentemente o "detectar" curvaturas de membrana particulares para garantizar un control espacio-temporal definido sobre procesos que incluyen tráfico celular, citocinesis y migración 5,6. La dinámica de la maquinaria celular en la membrana es notablemente difícil de observar debido a la dificultad de equilibrar el tiempo y la resolución espacial con la salud celular. Si bien las técnicas de superresolución pueden ofrecer una visión detallada de tales estructuras, requieren adquisiciones prolongadas que no son susceptibles a las escalas de tiempo de ensamblaje / desmontaje para la mayoría de la maquinaria. Además, la complejidad molecular de estos ensamblajes en su entorno nativo y la multitud de funciones que puede desempeñar un solo componente hacen que los sistemas de reconstitución mínima sean una herramienta valiosa para estudiar la capacidad funcional de las moléculas.
Se han desarrollado miméticos mínimos de membrana para estudiar las propiedades de la membrana y las interacciones proteína-membrana fuera de la célula. Los miméticos de membrana varían desde bicapas lipídicas independientes, como liposomas o vesículas unilamelares gigantes, hasta bicapas lipídicas soportadas (SLB)7,8,9,10. Los SLB son membranas biomiméticas ancladas al soporte subyacente, típicamente compuestas de vidrio, mica o sílice 11,12. Se puede utilizar una variedad de geometrías, incluidas superficies planas, esferas, varillas e incluso sustratos ondulados o micropatronados para sondear las interacciones proteína-membrana en curvaturas cóncavas y convexas simultáneamente1 3,14,15,16,17,18 . La formación de bicapa comienza con la adsorción de vesículas sobre una superficie hidrófila, seguida de fusión y ruptura para formar una bicapa continua (Figura 1)19. Las bicapas soportadas son particularmente susceptibles a la luz y la microscopía electrónica, proporcionando una mejor resolución temporal y espacial de lo que a menudo se puede lograr en las células. Los SLB curvos proporcionan especialmente un medio atractivo para sondear la sensibilidad a la curvatura de la proteína en ausencia de una deformación significativa de la membrana, lo que permite distinguir entre la detección de curvatura y la inducción de curvatura, que a menudo son imposibles de separar en sistemas independientes.
Las septinas son una clase de proteínas citoesqueléticas formadoras de filamentos bien conocidas por su capacidad de ensamblarse en membranas curvadas positivamente 6,18,20. En el transcurso del ciclo celular en la levadura, las septinas se ensamblan en un anillo y deben reorganizarse para formar las estructuras de reloj de arena y doble anillo asociadas con la aparición de brotes y la citocinesis, respectivamente21. Si bien se ha realizado un hermoso trabajo utilizando microscopía electrónica de réplica de platino para observar la arquitectura de la septina en diferentes etapas del ciclo celular22, observar el ensamblaje de la septina a lo largo del tiempo utilizando la microscopía de luz en la levadura se ha encontrado con una resolución espacial limitada. Trabajos previos sobre septinas utilizando monocapas lipídicas visualizadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) fueron capaces de reconstituir varias estructuras de septina interesantes como anillos, haces y gasas23. Sin embargo, las técnicas EM también están limitadas en su resolución temporal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia. Con el fin de resolver mejor los parámetros cinéticos del proceso multiescala de ensamblaje de septina, recurrimos a la mimética de membrana soportada, donde se puede controlar cuidadosamente la geometría de la membrana, las condiciones de la muestra y la modalidad de imagen.
Los protocolos descritos aquí utilizan SLB planos o curvos, proteína purificada y una combinación de técnicas de microscopía. La microscopía confocal de fluorescencia cuantitativa y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) se utilizaron para medir tanto la unión de proteínas a granel en varias curvaturas de membrana, como para medir la cinética de unión de moléculas individuales. Además, este protocolo ha sido adaptado para ser utilizado con microscopía electrónica de barrido (SEM) para examinar la ultraestructura de proteínas en diferentes curvaturas de membrana. Si bien el enfoque de estos protocolos está en el citoesqueleto de septina, los protocolos se pueden modificar fácilmente para investigar la sensibilidad a la curvatura de cualquier proteína que el lector encuentre interesante. Además, aquellos que trabajan en campos como la endocitosis o el tráfico vesicular pueden encontrar estas técnicas útiles para sondear los ensamblajes dependientes de la curvatura de complejos multiproteicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural</td>
			<td>Watson</td>
			<td>137-211C(EX)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL low adhesion tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4612-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for making PEGylated coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152450</td>
			<td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Liss Rhodamine PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Sodium Cacodylate Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M052-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglass coverslips for planar bilayers</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>22x22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Functionalized Silica Microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratories, Inc.</td>
			<td>Depends on size: SS0200*-SS0500*</td>
			<td>Silica in aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Thorlabs</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>Flexible adhesive for glass or plastics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20816-12-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-25</td>
			<td>Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0395-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverglass, #1.5 12mm&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td>Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy PI</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>ENF-260C</td>
			<td>115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanGlass Microfiber Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28455-030</td>
			<td>42.5 mm diameter, Grade GF/C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions

La mayoría de las células pueden detectar y cambiar su forma para llevar a cabo procesos celulares fundamentales. En muchos eucariotas, el citoesqueleto de septina es un componente integral en la coordinación de cambios de forma como la citocinesis, el crecimiento polarizado y la migración. Las septinas son proteínas formadoras de filamentos que se ensamblan para formar diversas estructuras de orden superior y, en muchos casos, se encuentran en diferentes áreas de la membrana plasmática, especialmente en regiones de curvatura positiva a escala micrométrica. El monitoreo del proceso de ensamblaje de la septina in vivo se ve obstaculizado por las limitaciones de la microscopía de luz en las células, así como por la complejidad de las interacciones tanto con las membranas como con los elementos citoesqueléticos, lo que dificulta la cuantificación de la dinámica de la septina en los sistemas vivos. Afortunadamente, ha habido un progreso sustancial en la última década en la reconstitución del citoesqueleto de septina en un sistema libre de células para diseccionar los mecanismos que controlan el ensamblaje de la septina a altas resoluciones espaciales y temporales. Los pasos centrales del ensamblaje de la septina incluyen la asociación y disociación del heterooligómero de la septina con la membrana, la polimerización en filamentos y la formación de estructuras de orden superior a través de interacciones entre filamentos. Aquí, presentamos tres métodos para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla. Estos métodos se pueden utilizar para determinar los parámetros biofísicos de las septinas en diferentes etapas de ensamblaje: como octamperadores individuales que se unen a la membrana, como filamentos y como ensamblajes de filamentos. Utilizamos estos parámetros combinados con mediciones de muestreo de curvatura y adsorción preferencial para comprender cómo opera la detección de curvatura en una variedad de escalas de longitud y tiempo.

Después de la preparación de cada SLB, las septinas o la proteína de interés pueden incubarse con el soporte deseado y obtener imágenes a través de TIRFM, microscopía confocal o SEM. Los resultados que se muestran aquí utilizan septinas expresadas y purificadas recombinantemente a partir de E. coli17. Utilizando TIRFM en SLB planos, es posible determinar la longitud de los filamentos y su flexibilidad, medir los coeficientes de difusión y observar el ensamblaje a lo largo del tie...

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Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Este protocolo guiará a aquellos que trabajan en proteínas de unión a membrana para determinar cómo la forma de la membrana juega un papel en la organización de ensamblajes de proteínas. La principal ventaja de esta técnica es su versatilidad para el tipo de proteína, la composición de la membrana y la geometría de la membrana. También permite interrogar cómo una bicapa lipídica puede alterar las propiedades de las proteínas asociadas.Para identificar una buena membrana para el experimento, sugerimos establecer una lista de verificación que podría incluir tasas de difusión de lípidos, movilidad de la proteína de interés y si hay liposomas sin estallar o liposomas fusionados adheridos a la superficie. Para comenzar la limpieza con plasma de los portaobjetos, purgue el limpiador de plasma durante cinco minutos con oxígeno para eliminar el aire de las líneas y la cámara. Coloque los portaobjetos de vidrio de cubierta seca en una cuna de cerámica.Mientras purga, haga correr un gas inerte sobre los portaobjetos de vidrio de la microcubierta para eliminar el polvo y las partículas. Coloque la cuna en la parte posterior de la cámara de plasma de modo que los cubreobjetos queden paralelos al borde largo de la cámara. Haga funcionar el limpiador de plasma durante 15 minutos con oxígeno a máxima potencia.Para la preparación de la cámara, corte la tapa justo debajo de la parte esmerilada de un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Pintar el borde del tubo de PCR con adhesivo activado UV evitando el interior del tubo. Coloque suavemente el pegamento del tubo de PCR en el centro de un cubreobjetos limpio con plasma, luego coloque la cámara bajo luz UV de longitud de onda larga durante cinco a siete minutos para curar el adhesivo.Para formar una bicapa, agregue los reactivos al pozo. Agite suavemente las cámaras de lado a lado para interrumpir los SUV y luego incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, enjuague la bicapa seis veces con 150 microlitros de SLBB pipeteando para eliminar el exceso de lípidos, luego lave la bicapa seis veces con 150 microlitros de tampón de reacción antes de incubar con las septinas.En el último paso de lavado, retire el tampón de reacción, dejando 75 microlitros en el pozo. Añadir 25 microlitros de septinas diluidas en SSB e imagen por microscopía TIRF. Primero, vorete la botella que contiene microesferas de sílice durante 15 segundos, luego bañe sonicate durante un minuto y vuelva a vorátice durante 15 segundos para romper cualquier grupo.Mezcle las perlas con SLBB y 10 microlitros de cinco SUV milimolares en un tubo de microcentrífuga de baja adherencia. Incubar la mezcla lipídica de perlas durante una hora a temperatura ambiente en un agitador para evitar la sedimentación. Mientras tanto, descongele un cubreobjetos pegilado y pegue un tubo de PCR cortado de 0,2 mililitros.Después de la incubación, centrifugar las perlas durante 30 segundos en el RCF designado. Después del primer giro, retire 50 microlitros de sobrenadante, luego agregue 200 microlitros de PRB y mezcle con un pipeteo vigoroso. Para las siguientes rondas, retire 200 microlitros de PRB y agregue otros 200 microlitros después del segundo y tercer giro y agregue 220 microlitros de PRB después del cuarto giro.Si realiza un ensayo de competencia con múltiples tamaños de perlas, prepare la reacción mezclando volúmenes iguales de cada tamaño de perla y diluyendo 29 microlitros de esta mezcla de perlas con 721 microlitros de tampón de reacción, luego agregue 75 microlitros de perlas diluidas y 25 microlitros de la proteína diluida en SSB a los pocillos y mezcle. Si mide septinas en un estado estacionario, incube la mezcla a temperatura ambiente durante una hora y luego obtenga una imagen cerca de TIRF o microscopía confocal. Las micrografías TIRF de SLB planas incubadas con septinas mostradas en verde mostraron una distribución homogénea de proteínas.Los SLB hechos con cubreobjetos de vidrio mal limpiados mostraron agujeros o huecos en la bicapa en regiones de baja septina. Los liposomas tubulados y sin estallar pueden acumularse en la superficie si se usan liposomas viejos o si los lavados no son estrictos. En micrografías de microesferas recubiertas de lípidos visualizadas usando rodamina PE mostró una deposición lisa de bicapa.Los soportes esféricos estaban recubiertos uniformemente por la membrana y había pocos grupos de cuentas. El lavado insuficiente del exceso de lípidos causó un recubrimiento desigual de la membrana como se observó por los grupos de lípidos y el manejo inadecuado causó brechas en la bicapa. La mezcla insuficiente de perlas causó aglutinación que no es ideal para medir la absorción total de proteínas.Utilizando las bicapas lipídicas soportadas presentadas aquí, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida, la citometría de masas de membranas y la microscopía de fuerza atómica de alta velocidad para examinar diferentes dinámicas proteína-proteína o proteína-membrana.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Investigación

Bioquímica

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Un ensayo de motilidad planarian para medir las propiedades biomodulantes de los productos naturales

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Inserción co-traduccional de proteínas de membrana en nanodiscos preformados

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...